A. Phương Pháp MPN (Most Probable Number) - Tài Liệu Text - 123doc

1. Trang chủ >
2. Cao đẳng - Đại học >
3. Chuyên ngành kinh tế >

a. Phương pháp MPN (Most Probable Number)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (830.32 KB, 27 trang )

-Canh MR-PVThuốc thử Methyl ReadThuốc thử α-napthol.Thao tác:Bước 1: Lấy mẫu và pha loãng mẫu đến 3 nồng độ liên tiếp thích hợp.Bước 2: Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 3 ống nghiệm môitrường Lauryl Sulphate broth (LSB). Hút 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ 3 ống nghiệm.Bước 3: Ủ ấm từ 35 – 370C, thời gian 24 - 48 giờ.Bước 4: Ống dương tính là có bọt khí trong ống durham.Bước 5: Tra bảng Mac Crady – loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ liên tiếp.Bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10 ml, 1ml và 0,1ml tương đươngMPN/ml của mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2 và 10-3 dùng phân tích.Kết quả tra bảng MPN/ml = kết quả tra bảng x f/10( f độ pha loãng thấp nhất 10n)Lưu ý: Các ống nghiệm có khả năng hiện diện của coliform là dương tính cả haimôi trường LSB và BGBL.Quy trình phân tíchTuần tự cấy 1ml dung dịch mẫu đã pha loãng 10 -1vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗiống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10 -2 và 10-3. Đâylà trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 x 3 hay9 ống nghiệm). nếu nghi ngờ số lượng vi sinh vật trong mẫu quá cao, phải sử dụng cácmẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 370C trong 48 giờ.Ghi nhận ống cósinh hơi. Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống cóchứa canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C trong 48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết quả (+) (cósinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng.Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LSB (+) sang môitrường canh EC, ủ ở 44,5 ± 0,20C trong 24 giờ. Đếm số lượng các ống cho kết quả (+)(sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng.Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ông (+) trên môi trường canh EC sang môitrường thạch đĩa MBN. Ủ các đĩa này ở 37 0C trong 24 giờ để tìm khuẩn lạc E.coli giảđịnh (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím). Chọn khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1mmvà cấy vào các môi trường MRVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệmIMViC. Khuẩn lạc E.coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là + + - - chínhlà E.coli. Ống nghiệm cho kết quả trong môi trường EC và khuẩn lạc E.coli giả định trênmôi trường EMB cho kết quả thử nghiệm IMViC như trên là ống nghiệm có E.coli(+).Thực hiện tương tự cho tất cả các ông nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC vàtạo được khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB. Ghi nhận số lượng các ốngnghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu.Cách đọc kết quảỞ tất cả các trường hợp nêu trên, từ số lượng các ông nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độpha loãng của mẫu, dùng bảng MPN thích hợp (bảng 3 x 3 tức 9 ống nghiệm) để tính ramật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu banđầu chưa pha loãng.b.Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạcNguyên tắcMẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọnlọc thích hợp chứa lactose.Đếm số khuẩn lạc lên men lactose & sinh acid sau khi ủ ở37±1oC trong 24-48h., đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của Coliforms.Khẳngđịnh khuẩn lạc đã đếm là E.coli bằng các thử nghiệm IMViC.Môi trường và hóa chất- Môi trường canh Tryptone Soya Agar (TSA) và môi trường Violet Red Bile Agar (VRB)--được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh, đun chảy và làm nguội ở nhiệt độ 45 0Ctrong bể điều nhiệt trước khi sử dụng.Môi trường canh Escherichia coli broth (EC Broth) được phân phối 10ml trong mỗi ốngnghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng để nguội và kiểm tra không có sựhiện diện của bọt khí trong ống Durham. Các ống EC này được bảo quản ở 2 – 80C.Môi trường canh Lactose Tryptone Lautyl Sulphate Broth (LST Broth) được chuẩn bịtương tự môi trường canh EC.Môi trường canh Tryptone Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khửtrùng.Môi trường canh MR-VP Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng,để nguội và bảo quản ở 2-80C cho đến khi sử dụng.Môi trường thạch Simmon Citrate được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng cómàu xanh lục.Thuốc thử Kovac’s.Quy trình phân tíchMẫu được đồng nhất hóa bằng cách đối với mẫu rắn xay nhuyễn mẫu trong điềukiện vô trùng rồi cân chính xác 10g (hoặc 25g), đối với mẫu lỏng hút 10ml (hoặc 25ml),bổ sung vào trong bình tam giác chứa 90ml (hay 225ml) nước SPW đã được hấp khửtrùng. Lắc đều trong một thời gian nhất định (ít nhất là 2 phút đối với mẫu rắn). Sau khiđược làm đồng nhất bằng cách trên, dung dịch mẫu thu được có độ pha loãng là 10 -1 sovới ban đầu.Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách chuyển1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng. Dung dịch này có độ phaloãng 10-2, sau đó tiếp tục chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ hai chứa 9mldung dịch pha loăng ta sẽ thu được dịch mẫu có độ pha loãng 10 -3. Tiếp tục thực hiện đểđược các độ pha loãng thập phân tiếp theo sao cho chứa