Bài Giảng Sinh Học Phân Tử - TS Võ MInh Trí - SlideShare

Trang chủ » Slideshare Sinh Học » Bài Giảng Sinh Học Phân Tử - TS Võ MInh Trí - SlideShare

Có thể bạn quan tâm

Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí•73 likes•22,356 viewsTài liệu sinh học Tài liệu sinh học Follow

Bài giảng SHTB của Trường ĐH KHoa Học Tự Nhiên - ĐH Quốc Gia TP.HCMRead less

Read more1 of 190TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOAHỌC TỰ NHIÊN GV. TS.VoõMinh Trí ðẠI HỌC QUỐC GIATP. HỒ CHÍ MINH SINH HỌC PHÂN TỬ (MOLECULAR BIOLOGY) 1 CBGD: GV.TS.VoõMinh Trí NỘI DUNG GV. TS.VoõMinh Trí 1. Giới thiệu 2. Cấu trúc và sự nhân bản của vật liệu di truyền 3. Biểu hiện gene 4. ðiều hòa biểu hiện gene 5. Dụng cụ, thiết bị dùng trong sinh học phân tử 6. Enzyme dùng trong sinh học phân tử 7. Một số phương pháp trong sinh học phân tử 2 GIỚI THIỆU GV. TS.VoõMinh Trí 3  Sinh học phân tử là gì?  Môn học tìm hiểu những hiện tượng sinh học ở mức ñộ phân tử: ñịnh nghĩa này khó phân biệt sinh học phân tử với sinh hóa (biochemistry).  Môn học nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen ở mức ñộ phân tử.  Trong lịch sử, sinh học phân tử phát triển từ môn di truyền học và sinh hóa học.  ðiểm bắt ñầu của sinh học phân tử từ nhữngthí nghiệm di truyền của Mendel từ giữa thế kỷ 19.  Di truyền tính trạng  Sinh học phân tử ra ñời vào 1944 khi thành phần hóa học của gen ñược khám phá. GV. TS.VoõMinh Trí 4 5 GV. TS.VoõMinh Trí CẤU TRÚC VÀ SỰ NHÂN BẢN CỦA VẬTLIỆU DI TRUYỀN  Phát hiện và vị trí của DNA trong tếbào  DNA là vật liệu di truyền  Thành phần và cấu trúc DNA  Cơ chế sao chép  Cơ chế sửa sai và bảo vệ DNA 6 GV. TS.VoõMinh Trí PHÁT HIỆN VÀ VỊ TRÍ CỦA DNA TRONG TẾBÀO  1896 Friedrich Meischer ñã phân lập DNAtừ tinh trùng cá và mủ từ vết thương.  Vì phân lập từ vùng nhân (nuclei), F. Meischer ñặt tên cho thành phần hóa học mới này là nuclein  Tên ñược ñổi thành nucleic acid, sau ñó là deoxyribonucleic acid (DNA)  1914 Robert Feulgen phát hiện DNAnhuộm màu với thuốc nhuộm fuchsin GV. TS.VoõMinh Trí Phát hiện và vị trí của DNA trong tếbào 7 GV. TS.VoõMinh Trí Vị trí của DNA trong tế bào 8 9 GV. TS.VoõMinh Trí DNA LÀ VẬT LIỆU DI TRUYỀN  Thí nghiệm chứng minh hiện tượng biến nạp ở vi khuẩn của Griffith (1928)  Thí nghiệm chứng minh nhân tố gây biến nạp là DNA của Avery, Loeod, và Carty (1944)  Thí nghiệm xác ñịnh vật liệu do phage bơm vào vi khuẩn là DNA của Hershey và Chase (1952) HIỆN TƯỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN (GrG ifV f. iT tS h.V )oõMinhTrí  Streptococcus pneumoniae: phế cầu khuẩn gây viêm phổi  Chủng ñộc (S, smooth): khuẩn lạc trơn, gây chết chuột  Chủng lành (R, rough): khuẩn lạc thô, không gây chết chuột 10  ðun diệt chủng ñộc,tiêm vào chuột: chuột sống. HIỆN TƯỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN (GriG fV f. itT hS. )VoõMinhTrí 11  ðun diệt chủng ñộc, trộn với chủng lành, tiêm vào chuột: chuột chết.  Kết luận: tế bào chết chủng ñộc ñã truyền tính gây bệnh cho chủng lành.  Biến nạp (transformation):  Griffith: hiện tượng truyền tính gây bệnh từ vi khuẩn ñộc sang vi khuẩn lành.  Sinh học phân tử hiện ñại: sự tiếp nhận DNA trần bởi tế bào nhận. HIỆN TƯỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN (GriG fV f. itT hS. )VoõMinhTrí 12 NHÂN TỐ GÂY BIẾN NẠP LÀ DNA (Avery, LoeodG ,V. CTS a. rVo tõ yM )inhTrí 13 NHÂN TỐ GÂY BIẾN NẠP LÀ DNA(Avery, LoG eV o. dTS ,.V Coõ aM rin th yTr )í 14  Huyền phù chủng ñộc ñã bị ñun chết ñược trộn với các enzyme khác nhau trước khi trộn với chủng lành và tiêm vào chuột:  Xử lý với protease (thủy phân protein): chuột chết.  Xử lý với ribonuclease (thủy phân RNA): chuột chết.  Xử lý với endonuclease (thủy phân DNA): chuột sống.  Trộn DNA từ chủng ñộc chết với chủng lành, tiêm vào chuột: chuột chết.  Kết luận: DNA là vật liệu di truyền ở hiện tượng biến nạp GV. TS.VoõMinh Trí VẬT LIỆU DO PHAGE BƠM VÀO VI KHUẨN LÀ DNA (Hershey, Chase) 15  Sự xâm nhập và nhân bản bacteriophage ở vi khuẩn  Nuôi cấy bacteriophage SỰ XÂM NHẬP VÀ NHÂN BẢN BACTERIOPHAGEG ỞV.T VS. IVo KõM Hinh UTr Ẩí N  Bacteriophage (phage, thực khuẩn thể): vi rút của vi khuẩn 16  Phage T2:  Vỏ protein bên ngoài  DNA bên trong  Phage T2 xâm nhiễm vi khuẩn E. coli  Gắn lên bề mặt vi khuẩn  Chuyển vật chất vào vi khuẩn  Làm tan vi khuẩn và phóng thích các phage mới  Protein hay DNAñược chuyển vào E. coli? SỰ XÂM NHẬP VÀ NHÂN BẢN BACTERIOPHAGEG ỞV.T VS. IVo KõM Hinh UTr Ẩí N 17 GV. TS.VoõMinh Trí 18 GV. TS.VoõMinh Trí THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)  ðánh dấu protein của phage bằng 35S bằng cách nhiễm phage lên E. coli ñược nuôi trong môi trường có chứa chất dinh dưỡng 35S  Phage ñược sinh ra có protein mang 35S 19 GV. TS.VoõMinh Trí THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)  ðánh dấu DNA của phage bằng 32P bằng cách nhiễm phage lên E. coli ñược nuôi trong môi trường có chứa chất dinh dưỡng 32P  Phage ñược sinh ra có DNA mang32P 20 21 GV. TS.VoõMinh Trí THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)  Nhiễm phage ñã ñánh dấu 35S và 32P lên E. colinuôi trong môi trường không chứa ñồng vị phóng xạ  Tách phần gắn của phage lên bề mặt E. coli bằng cách lắc mạnh  Ly tâm ñể làm lắng E. coli ở ñáy ống ly tâm  Thu E. coli ở cặn lắng (cặn ly tâm, precipitant) ñáy ống ly tâm và thu dịch không lắng (dịch nổi, supernatant) chứa phage 22 GV. TS.VoõMinh Trí THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)  Xác ñịnh hàm lượng ñồng vị phóng xạ 35S và 32P ở phần cặn (chứa E. coli) và phần dịch nổi (chứa phage):  Tế bào E. coli (phần cặn) chứa 70% tổng 32P  Dịch nổi chứa phage chiếm 80% tổng 35S  Kết luận:  DNA của phage ñược chuyển vào trong tế bào E. coli, cho phép nhân bản tạo nhiều phage mới trong E. coli  Vật chất di truyền của phage là DNA GV. TS.VoõMinh Trí THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952) 23 GV. TS.VoõMinh Trí THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC DNA  Thành phần hóa học và ñặc ñiểm DNA sợiñơn  Mô hình cấu trúc DNA mạch ñôiWatson-Crick  ðặc tính ñối songsong  Các cấu hình DNA  Cấu trúc bậc cao của DNA ở tếbào tiền nhân (prokaryote)  Cấu trúc bậc cao của DNA ở tếbào nhân thật (eukaryote) 24 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ðƠN PHÂN TRONG DNAVÀ RNA GV. TS.VoõMinh Trí 25 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ðƠN PHÂN TRONG DNAVÀ RNA GV. TS.VoõMinh Trí 26 GV. TS.VoõMinh Trí 27 SỰ HÌNH THÀNH NUCLEOSIDE VÀ NUCLEOTIDE GV. TS.VoõMinh Trí 28 CÁC DẠNG NUCLEOTIDE MONOPHOSPHATE TỪ ADENINE: AMP,cAMP GV. TS.VoõMinh Trí 29 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ðƠN PHÂN TRONG DNAVÀ RNA GV. TS.VoõMinh Trí Các dạng deoxyribonucleotide 30 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ðƠN PHÂN TRONG DNAVÀ RNA GV. TS.VoõMinh Trí Các dạng ribonucleotide 31 PHÂN LOẠI NUCLEOTIDE VÀ NUCLEIC ACID GV. TS.VoõMinh Trí 32 GV. TS.VoõMinh Trí SỰ TẠO THÀNH PHÂN TỬ POLY-(RIBO)NUCLEOTIDE BẰNG LIÊN KẾT PHOSPHODIESTER 33 GV. TS.VoõMinh Trí SỰ SẮP XẾP BASE, RIBOSE VÀ PHOSPHATE TRONGMẠCH NUCLEICACID  Khung: mạch ribose và liên kết phosphodiester  ðầu chứa gốc phosphate tựdo: ñầu 5’ phosphate (ñầu5’)  ðầu chứa gốc hydroxyl tựdo: ñầu 3’ hydroxyl (ñầu3’)  Các base gắn vuông gốc với mặt phẳng ñường ribose  Mạch nucleic acid có tính ñịnh hướng 34 LIÊN KẾT HYDROGEN GIỮA CÁC CẶP BASE PURINE-PYRIMIDINE TRONG NUCLEIC ACID MẠCH KÉP GV. TS.VoõMinh Trí 35 TÍNH ðỐI SONG SONG CỦA HAI MẠCH TRONG PHÂN TỬ DNA GV. TS.VoõMinh Trí 36 MÔ HÌNH DNA KÉP CỦA WATSON-CRICK(1953) GV. TS.VoõMinh Trí 37 GV. TS.VoõMinh Trí CÁC CẤU HÌNH CỦA DNA TRONG TẾBÀO  DNA tồn tại ở nhiềucấu hình khác nhau:  Bán kính phân tử (r)  Khoảng cách giữa 2 nucleotide (h)  Các cặp nucleotide/vòng xoắn (n)  Dạng B: trong ñiều kiện sinh lý bình thường  Các dạng khác (A, C,…, Z): các ñiều kiện môi trường, nội môi trường khác nhau 38 CÁC THÔNG SỐ ðẶC TRƯNG CỦA DNA DẠNG A, B, Z GV. TS.VoõMinh Trí 39 KÍCH THƯỚC PHÂN TỬ DNA GV. TS.VoõMinh Trí 40 KÍCH THƯỚC PHÂN TỬ DNA GV. TS.VoõMinh Trí 41 CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở PROKARYOTE GV. TS.VoõMinh Trí 42 CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở PROKARYOTE GV. TS.VoõMinh Trí 43 CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở EUKARYOTE GV. TS.VoõMinh Trí 44 CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở EUKARYOTE GV. TS.VoõMinh Trí 45 46 CƠ CHẾ SAO CHÉP DNA GV. TS.VoõMinh Trí  Sao chép theo khuôn, bán bảo tồn  Cơ chế phân tử của sự sao chép  So sánh sao chép ở prokaryote và eukaryote CÁC MÔ HÌNH SAO CHÉP DNA GV. TS.VoõMinh Trí  Sao chép (sao mã, replication) 47 THÍ NGHIỆM CỦA MESELSON-STAHL (1958) GV. TS.VoõMinh Trí 48 THÍ NGHIỆM CỦA MESELSON-STAHL (1958) GV. TS.VoõMinh Trí 49 THÍ NGHIỆM CỦA MESELSON-STAHL (1958) GV. TS.VoõMinh Trí 15N-15N 15N-15N 15N-15N 15N-14N 14N-14N 50 SAO CHÉP THEO KHUÔN, BÁN BẢO TG ỒV.T NS.VoõMinh Trí 51 52 CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA SỰ SAO CHÉP DNA GV. TS.VoõMinh Trí  ðiều kiện của phản ứng tổng hợp DNA (saochép):  Cần khuôn mạch ñơn  Xúc tác bởi DNApolymerase  Cần ñoạn mồi (primer): ñoạn RNA ngắn bổ sung với khuôn  Cơ chất: dATP, dCTP, dTTP, dGTP (dNTP)  Mạch mới ñược tổng hợp bằng cách kéo dài mồi theo chiều 5’ -> 3’: ñầu 5’-phosphate của nucleotide mớisẽ gắn vào ñầu 3’-OH của ñường ribose trong oligonucleotide  Các nucleotide ñược nối với nhau bằng liên kết phosphodiester giữa 5’-P và 3’-OH CÁC DNA POLYMERASE Ở E. coli GV. TS.VoõMinh Trí 53 CƠ CHẤT CỦA PHẢN ỨNG TỔNG HỢP RNA, DNA GV. TS.VoõMinh Trí 54 KHUÔN, MỒI VÀ TỔNG HỢP THEO CHIỀU 5’ ->3’ GV. TS.VoõMinh Trí 55 GV. TS.VoõMinh Trí KHUÔN, MỒI VÀ TỔNG HỢP THEO CHIỀU 5’ -> 3’ 56 57 GV. TS.VoõMinh Trí BA BƯỚC TRONG QUÁ TRÌNH SAO CHÉP (SAOMÃ)  Khởi sự (Initiation): hình thành phức hợp sao chép (replisome) ở trình tự khởi sự sao chép ori, hình thành khuôn mạch ñơn, hình thành chẻ ba sao chép (replication fork), tạo primer  Tổng hợp (kéo dài, Elongation): kéo dài primer, tổng hợp sợi DNA theokhuôn  Kết thúc (Termination): giải thể phức hợp replisome, kết thúc sao mã GV. TS.VoõMinh Trí CÁC PROTEIN CẦN CHO QUÁ TRÌNH SAO CHÉP (SAO MÃ) 58  DnaA: nhận diện, gắn vào ori, cảm ứng tách mạch, cảm ứng gắn DnaB, DnaC  DnaB: tạo phức hợp với DnaC  DnaC: giúp gắn DnaB vào khuôn  DnaG: primase  SSB: gắn và ổn ñịnh DNA mạchñơn  DNA gyrase: giải xoắn DNA  DNA polymerase III: kéo dài primer, tạo mạch DNAmới, có hoạt tính 3’=> 5’exonuclease ñể loại bỏ nucleotide sai  DNA polymerase I: thủy phân mồi RNA vàthay bằng DNA  DNA ligase: nối các ñoạnOkazaki GV. TS.VoõMinh Trí GẮN DnaA VÀO OriC VÀ HÌNH THÀNH KHUÔN MẠCH ðƠN Ở E. coli 59 GV. TS.VoõMinh Trí KHỞI SỰ SAO CHÉP (SAO MÃ) 60 GV. TS.VoõMinh Trí VỊ TRÍ VÀ HOẠT ðỘNG CỦA CÁC PROTEIN TRONG SAOCHÉP 61 GV. TS.VoõMinh Trí TƯƠNG TÁC CHẶT CHẼ GIỮA CÁC DNA POLYMERASE GIỮA HAI KHUÔN TRONG SAO CHÉP 62 GV. TS.VoõMinh Trí TỒNG HỢP LIÊN TỤC Ở MẠCH TRƯỚC VÀ KHÔNG LIÊN TỤC Ở MẠCH SAU 63  Mạch trước: tổng hợp liên tục, hướng ñi vào ngã ba sao chép  Mạch sau: tổng hợp không liên tục theo từng ñoạn Okazaki (1000-2000bp), theo hướng ñi ra khỏi ngã ba sao chép  Tốc ñộ sao chép ở E. coli 5 x 104 nu/phút GV. TS.VoõMinh Trí VAI TRÒ CỦA DNA POLYMERASE I VÀ LIGASE Ở TỔNG HỢP MẠCH SAU 64 GV. TS.VoõMinh Trí VAI TRÒ CỦA DNA POLYMERASE I VÀ LIGASE Ở TỔNG HỢP MẠCH SAU 65 GV. TS.VoõMinh TríVAI TRÒ CỦA DNA POLYMERASE I VÀ LIGASE Ở TỔNG HỢP MẠCH SAU 66 GV. TS.VoõMinh Trí TỔNG HỢP THEO MỘT VÀ HAI CHẺ BA SAOCHÉP 67 GV. TS.VoõMinh Trí SAO CHÉP VÀ PHÂN TÁCH DNA CON Ở PROKARYOTE 68 GV. TS.VoõMinh Trí KẾT THÚC SAO CHÉP Ở E. coli 69 GV. TS.VoõMinh Trí PHÂN TÁCH DNA CON KHI HOÀN TẤT SAO CHÉP 70 GV. TS.VoõMinh Trí SAO CHÉP Ở EUKARYOTE  Sao chép phức tạp và chậm hơn so với prokaryote (3000nu/phút)  Nhiều ñiểm xuất phát sao chép (replicon) trên 1 nhiễm sắc thể  Cơ chế kiểm soát sự sao chép lặp lại trên 1 ori 71 GV. TS.VoõMinh Trí SAO CHÉP ðỒNG THỜI TRÊN NHIIỀU REPLICON Ở EUKARYOTE 72 GV. TS.VoõMinh Trí CƠ CHẾ SỬA SAI VÀ BẢO VỆDNA  Các dạng ñột biến trên DNA  Sửa sai trong sao chép  Sửa sai các ñột biến  Các hệ thống bảo vệ DNA 73 74 GV. TS.VoõMinh Trí CÁC DẠNG ðỘT BIẾN TRÊNDNA  ðột biến do sai sót trong saochép  ðứt mạch do cơhọc  Thủy phân liên kết N-glycoside làm mất base  Methyl hóa trên base dẫn ñến bắt cặp sai  Mất nhóm amine dẫn ñến bắt cặp sai  Chuyển dạng enol-keto, amino-imino dẫn ñến bắt cặp sai  Tạo dimer thymine trên cùng một mạch do tia UV GV. TS.VoõMinh Trí THỦY PHÂN LIÊN KẾT N-GLYCOSIDE LÀM MẤTBASE  Xảy ra với tỷ lệ cao ñối với purine so với pyrimidine  1/105 purine/ngày/tế bào người trong ñiều kiện bình thường 75 GV. TS.VoõMinh Trí MẤT NHÓMAMINE 76 GV. TS.VoõMinh Trí CHUYỂN DẠNG ENOL-KETO, AMINO-IMINO 77 GV. TS.VoõMinh Trí TẠO DIMER THYMINE TRÊN CÙNG MỘT MẠCH DO TIAUV 78 79 GV. TS.VoõMinh Trí HỆ THỐNG SỬASAI DNAðẢM BẢO TÍNH ỔN ðỊNH CỦA VẬT LIỆU DI TRUYỀN DNAQUACÁC THẾ HỆ  Tần số sai sót của sao chép in vitro: 10-5  Tần số sai sót của sao chép in vivo: 10-9  Hệ thống sửa sai DNA:  Sửa sai trong sao chép: DNA polymerase III, DNA polymerase I  Sửa sai do ñột biến GV. TS.VoõMinh Trí HỆ THỐNG SỬA SAI TRÊN DNA Ở E. coli 80 MẠCH DNA MẸ VÀCON GV. TS.VoõMinh Trí PHÁT HIỆN NUCLEOTIDE SAI TRÊN MẠCH CON 81 GV. TS.VoõMinh Trí THAY ðOẠN CHỨA NUCLEOTIDE SAI BẰNG ðOẠN MỚI 82 THAY ðOẠN CHỨA NUCLEOTIDE MẤT BASEBẰNGG ðV. OTS. ẠV NoõM Minh ỚTr Ií  Vị trí apurinic  Vị trí apyrimidinic 83 GV. TS.VoõMinh Trí THAY BẰNG ðOẠN MỚI 84 85 GV. TS.VoõMinh Trí HỆ THỐNG BẢO VỆ DNA  Hệ thống sửa sai  Hệ thống SOS  Hệ thống giới hạn-biến ñổi HỆ THỐNG SOS (SOS REGULATORY SYGV S.T TS. EVo MõMin )h Trí 86 GV. TS.VoõMinh Trí HỆ THỐNG GIỚI HẠN – BIẾN ðỔI 87 (RESTRICTION – MODIFICATION SYSTEM  Giúp vi khuẩn phân biệt DNA chính mình vớiDNA ngoại lai (phage) và thủy phân DNA ngoạilai  ðặc ñiểm:  Nhận diện một trình tự nucleotide chuyên biệt (trình tự nhận biết) có tính ñối ngẫu (palindrome, trình tự 5’ => 3’ của hai sợi ñồng nhất)  Có hoạt tính methyl hóa một nucleotide trên trình tự nhận biết: hoạt tính methylase  Có hoạt tính cắt liên kết phosphodiester tại trình tự nhận biết, hoặc một vị trí nhất ñịnh so với trình tự nhận biết: hoạt tính endonuclease  Hoạt tính endonuclease chỉ có ñối với trình tự nhận biết không bị methyl hóa GV. TS.VoõMinh Trí HỆ THỐNG GIỚI HẠN – BIẾN ðỔI (RESTRICTION – MODIFICATION SYSTEM 88 89 GV. TS.VoõMinh Trí BIỂU HIỆN GEN: PHƯƠNG THỨC SỬ DỤNG THÔNG TIN DI TRUYỀN TRONG TẾ BÀO  Học thuyết trung tâm  DNA và mã di truyền  Phiên mã ở prokaryote  Phiên mã ở eukaryote  ðặc ñiểm, chức năng các sản phẩm phiên mã(RNA)  Dịch mã  Biến ñổi sau dịch mã 90 GV. TS.VoõMinh Trí HỌC THUYẾT TRUNG TÂM  Gen và tính trạng  Nguyên tắc truyền thông tin di truyền trong tế bào và qua các thế hệ  Các bước trong quá trình biểu hiện của gen SAI HỎNG CỦA GEN DẪN ðẾN CÁC SAI HỎNGGV. ST IS. NVo HõMin HhT Órí A  Bệnh niệu alkaptonuria (Garrod, 1908): ñột biến lặn liên quan ñến homogentisic acid oxidase  Các bệnh di truyền ñột biến lặn khác trong chu trình phenylalanine 91 GV. TS.VoõMinh Trí 1 GEN – 1 ENZYME  Beadle, Tatum (1941): thí nghiệm trên mốc vàng Neurospora crassa  Tạo các chủng mốc ñột biến khuyết dưỡng (mất khả năng tự tổng hợp một nhu cầu dinh dưỡng, ví dụ 1 acid amin  Xác ñịnh mỗi chủng ñột biến liên quan ñến 1 gen: giả thuyết “1 gen-1 enzyme”  Mở rộng khái niệm:  1 gen - 1 protein  1 gen - 1 polypeptide  1 gen - 1 ñại phân tử sinh học 92 NGUYÊN TẮC TRUYỀN THÔNG TIN DI TGV R.T US.V YoõM Ềin Nh Trí TRONG TẾ BÀO VÀ QUA CÁC THẾ HỆ Truyền thông tin giữa 2 thế hệ Truyền thông tin trong tế bào 93 Functional protein Ý NGHĨA VÀ ðẶC ðIỂM CỦA CÁC BƯGV Ớ.TS C.VoõMinh Trí 94 TRUYỀN THÔNG TIN  Phiên mã (transcription):  Chọn lựa phần thông tin di truyền cần sử dụng từ bộ gen  Chuyển thông tin di truyền từ DNA thành RNA  Kích thước RNA nhỏ 1/1000 lần so với DNA  RNA kém bền do có C2’-OH, chỉ tồn tại trong một thời gian nhất ñịnh trong tế bào  Phương thức mã hóa thông tin không thay ñổi  Bản chất hóa học và kiểu kiên kết hầu như không thay ñổi Ý NGHĨA VÀ ðẶC ðIỂM CỦA CÁC BƯGV Ớ.TS C.VoõMinh Trí 95 TRUYỀN THÔNG TIN  Dịch mã (translation):  Thông tin di truyền ñược dịch thành trình tự các amino acid có bản chất hóa học và kiểu liên kết khác  Các sản phẩm phiên mã ñược dịch mã ở mức ñộ khác nhau  Sản phẩm dịch mã có cấu trúc và chức năng ña dạng  Protein không bền vững và bị phân hủy sau một thời gian nhất ñịnh  Biến ñổi sau dịch mã (post-translational modification)  Giúp kiểm soát ở mức ñộ cao hơn sự biểu hiện của gen  Thực hiện bằng những biến ñổi cộng hóa trị và không cộng hóa trị CHỨC NĂNG ðA DẠNG CỦAPROTEGV I.T NS.VoõMinh Trí 96 DÒNG THÔNG TIN Ở TẾ BÀO PROKARYOTE VÀ EGV U.T KS. AVo RõM Yinh OTr Tí E  Prokaryote: DNA=>RNA=>protein=>functional protein  Eukaryote: DNA=>pre-mRNA=>RNA=>protein=>functional protein 97 GV. TS.VoõMinh Trí MÃ DI TRUYỀN (CODON) 98 GV. TS.VoõMinh TríPHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE  Là phản ứng sinh tổng hợp RNA trong tế bào từ DNA khuôn.  ðiều kiện của phiên mã in vivo:  RNA polymerase có hoạt tính (tạo liên kết phosphodiester giữa các rNTP dựa theo khuôn DNA mạch ñơn) 99  Có ñủ rNTP (rATP, rGTP, rCTP, rUTP)  Gen ñược mở  Sự phiên mã ñược thực hiện theo từng ñơn vị phiên mã  Sự tổng hợp RNAluôn theo chiều 5’ =>3’. ðƠN VỊ PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTEGV.TS.VoõMinh Trí  ðơn vị phiênmã:  Promoter: trình DNA nơi RNA polymerase gắn vào  Trình tự mang mã: gồm trình tự các bộ ba mã hóa (codon) bắt ñầu bằng ATG và kết thúc bằng bộ ba kết thúc  Terminator: trình tự mã hóa cấu trúc kết thúc phiên mã  RNA polymerase gắn với promoter thôngqua nhân tố sigma 100 101 PROMOTER VÀ SỰ NHẬN DIỆN BỞI SIGGVM.TS.AVoõMinh Trí  Promoter: vùng chứa trình tự bảo tồn ở các nucleotide -10 (TATAAT) và -35 (TTGACA) so với ñiểm bắt ñầu +1.  Nhân tố sigma nhận diện và gắn với promoter tại vùng -10 và -35.  Sigma gắn với promoter ở cả hai mạch, mạch xuôi 5’ => 3’chứa trình tự bảo tồn ñược nhận diện là mạch mang mã, mạch ñối diện là mạch khuôn dùng ñể tổng hợp RNA.  Trình tự ribonucleotide của RNA tương tự với trình tự nucleotide của mạch mang mã. CÁC SỰ KIỆN TRONG KHỞI SỰ PHIÊN MGVÃ.TS.VoõMinh Trí 102 BA BƯỚC TRONG SỰ PHIÊN MÃ: KÉGOV.TDS.VÀoõMIinhTrí 103 BA BƯỚC TRONG SỰ PHIÊN MÃ: KẾTGVT.TSH.VÚoõMCinhTrí 104 BA BƯỚC TRONG SỰ PHIÊN MÃ: KẾTGVT.TSH.VÚoõMCinhTrí 105 GV. TS.VoõMinh Trí PHIÊN MÃ THEO CÁC ðƠN VỊ PHIÊN MÃ Maïch DNAkhuoân Maïch DNA mang maõ 106 GV. TS.VoõMinh TríPHIÊN MÃ THEO CÁC ðƠN VỊ PHIÊN MÃ 107 GV. TS.VoõMinh Trí SO SÁNH PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE  Prokaryote:  Một loại RNA polymerase tổng hợp tất cả các loại RNA 108  mRNA thường chứa nhiều ORF (nhiều gene, polycistron)  Eukaryote:  Vùng mang mã di truyền của gene (exon) bị gián ñoạn bởi các ñoạn không mang mã (intron)  mRNA ñược tổng hợp qua hai bước: tiền mRNA (pre mRNA) và mRNA trưởng thành (mature mRNA)  Pre mRNA có chứa chóp 7-methyl-guanosine ở ñầu 5’và chứa ñuôi polyA (100-200 adenine) ở ñầu 3’  Pre mRNA ñược chế biến (splicing) ñể loại bỏ intron và nối các exon lại trước khi ñi vào tế bào chất  mRNA trưởng thành trong tế bào chất chứa thông tin liên tục GV. TS.VoõMinh Trí SO SÁNH PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE  Eukaryote:  mRNA chỉ chứa 1 ORF (một gen, monocistron)  RNA polymerase I và III: tổng hợp rRNA, tRNA và các RNA nhỏ khác 109  RNA polymerase II: tổng hợp mRNA GV. TS.VoõMinh Trí PHIÊN MÃ Ở EUKARYOTE 110 GV. TS.VoõMinh Trí GẮN CHÓP 5’, ðUÔI POLYAVÀ SPLICING TRONG PHIÊNMÃ Ở EUKARYOTE 111 CÁC VÙNG CHỨC NĂNG VÀ ðỘ BỀN CỦAGmV.TRS.NVoAõMinhTrí  Các vùng chức năng:  5’-UTR (untranslated region): vùng 5’ không dịchmã  Vùng dịch mã: một hay nhiều khung dịch mã (ORF, open reading frame)  3’-UTR: vùng 3’ không dịchmã  Terminator: cấu trúc kết thúc  ðộ bềnmRNA: Phụ thuộc vào cấu trúc bậc cao ở ñầu 5’và 3’, mũ 5’và ñuôi polyA mRNA của prokaryote có cấu trúc ñơn giản, thờigian bán phân ngắn (phút) mRNA của eukaryote có thời gian bán phân dài (30 phút – 24giờ) Vùng 5’không dịch mã 112 Vùng dịch mã, ORF Vùng 3’không dịch mã ðƠN VỊ PHIÊN MÃ CỦA OPERON RNA ỞPROGKV.ATSR.VYoõOMinThETrí 113 GV. TS.VoõMinh Trí RNA RIBOSOME (rRNA) 114 GV. TS.VoõMinh Trí CẤU TRÚC BẬC 2 CỦA rRNA 115 GV. TS.VoõMinh Trí RNA VẬN CHUYỂN (tRNA) 116 SỰ GẮN CHUYÊN BIỆT AMINO ACID LÊN tRNATƯGV Ờ.T NS. GVoõM Ứin Nh GTrí  Liên kết ester hình thành giữa 3’-OH của tRNA và –COOH của amino acid tương ứng nhờ sự xúc tác của aminoacyl-tRNA synthetase tương ứng 117 MÔ HÌNH PHÂN TỬ MINH HỌA TÍNH CHUYÊN BG IV Ệ.T TS.V Goõ IM Ữin AhTrí ENZYME, AMINO ACID VÀtRNA 118 GV. TS.VoõMinh Trí DỊCH MÃ 119  Là quá trình sinh tổng hợp protein trong tế bào trên khuôn mRNA và ribosome.  ðiều kiện của dịch mã in vivo:  Có ñủ amino acid và aminoacyl-tRNA (tRNAgắn amino acid)  Có ñủ các nhân tố dịch mã  Ribosome hoạt ñộng và mRNA  Sự dịch mã ñược thực hiện theo từng ñơn vị là ORF  Sự dịch mã luôn theo chiều 5’ => 3’ của mRNA, ñầu 5’ tương ứng với -NH2 (ñầu N), ñầu 3’ tương ứng với -COOH (ñầu C) của polypeptide GV. TS.VoõMinh Trí DỊCH MÃ TRÊN POLYSOME ðỒNG THỜI VỚI PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE 120 GV. TS.VoõMinh Trí BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KHỞI SỰ 121  Gồm các sự kiện lắp ghép có trực tự của mRNA, các tiểu phần ribosome, tRNA-fMet tại codon khởi sự trước khi hình thành một liên kết peptide  Ribosome hoàn chỉnh có ba vị trí:  A: nơi tiếp nhận tRNA gắn amino acid  P: nơi tiếp nhận tRNA-fMet và nơi chứa tRNA-peptide  E: vị trí thoát của tRNA  ðược kiểm soát bởi các nhân tốkhởi sự dịch mã IF (Initiation factor) TƯƠNG TÁC GIỮA 16S rRNA VÀ TRÌNH TGV Ự.TS. SVo HõM Iin NhT Erí - DALGARNO Ở ðẦU 5’CỦA mRNA 122 BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KÉOG DV. ÀTS. IVoõMinhTrí  Các nhân tố kéo dài dịch mã EF (elongation factor) giúp ñưa tRNA mang amino acid vào vị trí A và cảm ứng sự xúc tác hình thành liên kết peptide 123 BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KÉOG DV. ÀTS. IVoõMinhTrí  Ribosome di chuyển 1 bộ ba theo chiều 5’ => 3’của mRNA  Vị trí của các tRNAtrên ribosome thay ñổi  Năng lượng ñược cung cấp từ sự thủy phân GTP 124 BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KÉOG DV. ÀTS. IVoõMinhTrí 125 HÌNH THÀNH LIÊN KẾT PEPTIDE VÀ SGV Ự.TS D.Vo ỊõM Cin Hh Trí CHUYỂN CỦA RIBOSOME TRONG DỊCH MÃ 126 127 BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KẾT TG HV.T ÚS. CVoõMinhTrí  Vị trí A củaribosome gặp codon kết thúc  Nhân tố kết thúc dịch mã RF (releasing factor) gắn vào  Thủy phân liên kết ester giữa peptide và tRNA  Hai tiểu phần ribosome tách ly và rời khuôn mRNA BIẾN ðỔI SAU DỊCH MÃ (POST-TRANSLATIONALMODG IV F.T IS C.V Ao TõM Ii Onh NTr )í  Biến ñổi cộng hóa trị: gắn thêm ñường, phosphate, methyl…  Biến ñổi không cộng hóa trị:  Gắn với một hợp chất phân tử lượng nhỏ (tác nhân biến cấu)  Gắn với một protein khác  Tương tác với chaperon phân tử 128  ðột biếnñiểm: ðỘT BIẾN (MUTATION) LÀM THAY ðỔI KIỂU GENE VGÀV.KTSI.ỂVUoõMHinÌhNTrHí  Thêm hoặc mất một nu: làm lệch khung dịch mã  Thay thế nu này bằng nu khác: ñột biến lệch nghĩa (mis-sense), ñột biến trung tính (neutral) hay lặn (silent), ñột biến mất nghĩa (non-sense)  Hồi biến (reverse mutation): ñột biến ñiểm trở lại nu ban ñầu  ðột biến mất ñoạn, thêm ñoạn, ñảo ñoạn, chuyểnvị: làm bất hoạt gen và mất khung dịch mã  Tần số ñột biến tự nhiên:  ðột biến trong sao chép: 10-4-10-8/thế hệ  ðột biến mất nghĩa: 10-6-10-8/thế hệ  Chuyển vị gene: 10-4/thế hệ  Tác nhân gây ñột biến: tia xạ, hóa chất, sinh học…129 ðỘT BIẾN (MUTATION) LÀM THAY ðỔI KIỂU GENE VGÀV.KTSI.ỂVUoõ MHinÌhNTrHí 130 ðỘT BIẾN (MUTATION) LÀM THAY ðỔI KIỂU GENE VÀG KV. IT ỂS. UVo HõM Ìin Nh HTrí 131 GV. TS.VoõMinh Trí ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦAGENE VÀ SỰ PHÁT TRIỂN 132  Hiện tượng ñiều hòa biểu hiện của gene  ðặc ñiểm cơ bản của sự ñiều hòa biểu hiệncủa gene ở prokaryote và eukaryote  Các mức ñiều hòa sự biểu hiện của gene  Kiểm soát dương và kiểm soát âm ở prokaryote  Cấu trúc protein ñiều hòa  ðặc ñiểm kiểm soát phiên mã của gene ởeukaryote  ðiều hòa biểu hiện của gene trong biệt hóavà phát triển 133 HIỆN TƯỢNG ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CGV Ủ.TS A.Vo Gõ M Einh NTrí E  ðáp ứng thích nghi của tế bào, cá thể về hìnhthái, sinh lý, sinh hóa… ñối với sự thay ñổi của môi trường  Sự biểu hiện nối tiếp, có chương trình của các gene ở vi sinh vật  Sự biệt hóa thành nhiều tế bào có chức năng khác nhau trong cơ thể ña bào bậc cao ðẶC ðIỂM BIỂU HIỆN CỦA GENE ỞPROG KV. ATS. RVo YõMi OnhT Trí E  Sự biểu hiện của gene ñáp ứng theo thay ñổi của môi trường  Hầu như không có biệt hóa 134 ðẶC ðIỂM BIỂU HIỆN CỦA GENE ỞEUKGV A.T RS.V Yoõ M Oinh TT Erí  Phương thức ñiều hòa phức tạp hơn và có sự biệt hóa 135 136 CÁC MỨC ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦGV A.TS G.Vo Eõ M Ninh ETrí  Mức DNA:  Thay ñổi cấu trúc bậc cao  ðột biến, sắp xếp lại DNA  Mức phiên mã: tăng cường hay ức chế phiên mã tạo mRNA  Mức dịch mã:  Tính ổn ñịnh và cấu trúc mRNA  Hiệu quả tổng hợp protein  Mức sau dịch mã:  Hình thành cấu hình tự nhiên  Chức năng và hoạt tính protein GV. TS.VoõMinh Trí ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦA GENE MÃHÓA ENZYME Ở MỨC PHIÊN MÃ, DỊCH MÃ VÀ SAU DỊCH MÃ 137 ðIỀU HÒA SỰ TỔNG HỢP ENZYMEVÀGV. HTS O.Vo ẠõMi TnhTrí TÍNH ENZYME 138 GV. TS.VoõMinh Trí BIẾN ðỔI SAU DỊCH MÃ BẰNG CƠ CHẾ BIẾN CẤU (BIẾN ðỔI LẬPTHỂ) 139 140 ðIỀU HÒA PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTEGV:.TKS.VIoỂõMMinh Trí SOÁT ÂM (NEGATIVE CONTROL)  Liên quan tới repressor và operator  Khi repressor gắn vào operator => không tạo mRNA  Repressor ñược ñiều hòa sau dịch mã => trạng thái có hoạt tính và không có hoạt tính:  Repressor ñược hoạt hóa bởi Effector và gắn vào operator: sự biểu hiện của trp operon bị ức chế (repression) bởi tryptophane  Repressor bị bất hoạt không gắn vào operator: sự biểu hiện của lac operon ñược cảm ứng (induction) bằng lactose XÚC TÁC SỰ THỦY PHÂN LACTOSE BỞI -GALACTOSIDASE 141 KIỂM SOÁT ÂM SỰ BIỂU HIỆN CỦA OPERON LGV A.T CS. TVo OõM Sin Eh Trí 142 KIỂM SOÁT ÂM SỰ BIỂU HIỆN CỦA OPERON TRG YV. PTS T. V Ooõ PMi Hnh ATr Ní E 143 144 GV. TS.VoõMinh Trí ðIỀU HÒA PHIÊN MÃ: KIỂM SOÁTDƯƠNG (POSITIVE CONTROL)  Liên quan tới activator và activator-binding site (hoặc enhancer)  Activator gắn vào enhancer => tăng cường tạo mRNA  Activator ñược ñiều hòa sau dịch mã: trạng thái có hoạt tính và không có hoạt tính  Activator ñược hoạt hóa bởi effector (cAMP) ñể gắn vào activator-binding site: trường hợp lac operon, mal operon ðIỀU HÒA KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở lac OPEROG NV.TS.VoõMinhTrí 145 ðIỀU HÒA KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở lacOG PV. ETS. RVo OõMi Nnh Trí 146 ðIỀU HÒA KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở malOGV P.T ES. RVoõ OMin Nh Trí 147 VAI TRÒ CỦA ACTIVATOR TRONG KIỂM SOÁTGV D.TS Ư.V ƠoõM Nin Gh Trí 148 GV. TS.VoõMinh Trí TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN VÀ NUCLEIC ACID  Tương tác không chuyên biệt: histone-DNA  Tương tác chuyên biệt: protein là dimer, mỗi monomer gắn vào một trình tự xác ñịnh trên một sợi DNA  ðặc ñiểm của trình tự gắn protein: lặp lạiñảo ngược (trên một mạch) 149 GV. TS.VoõMinh Trí TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN VÀ NUCLEIC ACID 150 151 GV. TS.VoõMinh Trí ðẶC ðIỂM CẤU TRÚC CỦA DNA-BINDINGPROTEIN  Cấu trúc bậc 2 (xoắn -helix), phần ổn ñịnh cấu hình và phần chứa trình tự nhận diện (nơi gắn)  Xoắn-gập-xoắn (Helix-turn-helix motif)  Ngón tay gắn kẽm (zinc finger)  Dây kéo leucine (leucine zipper) GV. TS.VoõMinh Trí MỘT SỐ CẤU TRÚC DNA BINDING PROTEIN 152 153 GV. TS.VoõMinh Trí ðẶC ðIỂM ðIỀU HÒA PHIÊN MÃ Ở EUKARYOTE  Phương thức ñiều hòa phức tạp hơn  Promoter bao gồm: TATAbox và UPE (upstream element)  Hầu hết các gene ñược ñiều hòa bởi ñồng thời nhiều trình tự ñiều hòa  ðiều hóa theo cơ chế kiểm soát dương bởi activator và các enhancer nằm cách xa về phía thượng lưu hoặc hạ lưu của promoter  ðiều hòa theo cơ chế kiểm soát âm bởirepressor và trình tự ñiều hòa (repressor-binding site) GV. TS.VoõMinh Trí PROMOTER Ở PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE 154 GV. TS.VoõMinh Trí ENHANCER VÀ KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở EUKARYOTE 155 GV. TS.VoõMinh Trí 156 157 GV. TS.VoõMinh Trí ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦA GENE TRONGQUÁ TRÌNH BIỆT HÓA VÀ PHÁTTRIỂN  Các tế bào khác nhau ở cơ thể ña bào ñều có lượng DNA như nhau và có khả năng bắt cặp bổ sung với nhau  Các tế bào biệt hóa khác nhau có hàm lượng, chủng loại mRNA và protein khác nhau  Các gene ñược biểu hiện theo chương trình thời gian  Phiên mã là cơ chế chủ yếu của sự ñiều hòa biểu hiện của gene trong biệt hóa và phát triển 158 MỘT SỐ ENZYME CƠ BẢN DÙNG TRG OV. NTS G.VoõMinhTrí SINH HỌC PHÂN TỬ  DNApolymerase:  Taq polymerase  Pfu polymerase  Enzyme cắt hạn chế:  Enzyme cắt ñầu dính  Enzyme cắt ñầu bằng  Enzyme nối DNA:  T4 DNAligase GV. TS.VoõMinh Trí Taq polymerase  DNA polymerase chịu nhiệt, nhiệt ñộ hoạtñộng thích hợp ở 70-80oC  Chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng  Tốc ñộ tổng hợp chuỗi oligonucleotide khoảng 1000-1500nu/phút  ðược sử dụng ñể tổng hợp ñoạn DNA invitro  Taq polymerase sẽ gắn các dNTP vào ñầu 3’OH của nucleotide nằm trong oligonucleotide dựa theo mạch khuôn 159 GV. TS.VoõMinh Trí Taq polymerase 160  Taq polymerase sẽ gắn thêm một nucleotide adenine (A), làm cho mạch mới tổng hợp sẽ dư một Aso với mạch khuôn (75% sản phẩm PCR)  ðộ chính xác không cao (10-4errors/bp)  Phản ứng ñược xúc tác bởi Taq polymerase phải có ñầy ñủ các thành phần sau:  Mạch DNA ñơn làm khuôn  Mồi-là một ñoạn oligonucleotide ngắn (5-150 nu) phải bổ sung với mạch DNAkhuôn  dNTP: dTTP, dATP, dGTP và dCTP  Dung dịch ñệm chứa phần muối và pH thích hợp ñể duy trì hoạt tính của Taq polymerase GV. TS.VoõMinh Trí Taq polymerase - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ 3’-TGATCGAT-5’ 5’-ATCGGC-3’ 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTAA-3’ 3’-ATAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTAA-3’ 3’-ATAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 161 162 GV. TS.VoõMinh Trí Pfu polymerase  Là DNA polymerase chịu nhiệt, nhiệt ñộ hoạtñộng thích hợp ở 70-80oC  Chiết tách từ vi khuẩn cổ Pyrococcus furiosus sốngở suối nước nóng (nhiệt ñộ thích hợp 100oC )  Tốc ñộ tổng hợp chuỗi oligonucleotide khoảng 500-1000nu/phút  ðược sử dụng ñể tổng hợp ñoạn DNA invitro  Pfu polymerase sẽ gắn các dNTP vào ñầu 3’OH của nucleotide nằm trong oligonucleotide dựa theo mạch khuôn 163 GV. TS.VoõMinh Trí Pfu polymerase  Pfu polymerase không gắn nucleotide vào ñầu 3’OH  ðộ chính xác cao (10-6 errors/bp)  Phản ứng ñược xúc tác bởi Pfu polymerase phải có ñầy ñủ các thành phần sau (cũng tương tự Taq polymerase):  Mạch DNA ñơn làm khuôn  Mồi-là một ñoạn oligonucleotide ngắn (5-150 nu) phải bổ sung với mạch DNAkhuôn  dNTP: dTTP, dATP, dGTP và dCTP  Dung dịch ñệm chứa phần muối và pH thích hợp ñể duy trì hoạt tính của Pfu polymerase GV. TS.VoõMinh Trí Pfu polymerase 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ 3’-TGATCGAT-5’ 5’-ATCGGC-3’ 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 164 GV. TS.VoõMinh Trí Enzyme cắt hạn chế  Là enzyme của vi khuẩn dùng ñể cắt DNAcủa bacteriophage (phage) xâm nhiễm vi khuẩn, nhờ ñó bảo vệ vi khuẩn khỏi bị phage tiêu diệt  Thủy phân liên kết phosphodiester trên sợi DNA tại vị trí chuyên biệt sẽ giải phóng sợi DNA có ñầu 5’P và 3’OH  Có nhiều loại enzyme cắt hạn chế  Sau khi cắt sản phẩm DNAcó thể ñầu dính hay ñầu bằng  Tên gọi của enzyme cắt hạn chế ñược gọi theo tên viết tắt của loài vi sinh vật ñầu tiên có enzyme cắt giới hạn ñó 165 GV. TS.VoõMinh TríCác loại enzyme cắt hạn chế 166 167 GV. TS.VoõMinh Trí Tên gọi của enzyme cắt hạn chế HindIII: Haemophilus influenzae serotype d EcoRI: Escherichia coli RY13 BglII: Bacillus globigii GV. TS.VoõMinh Trí Vị trí cắt của enzyme cắt hạn chế  Trình tự ñối ngẫu: ñối xứng qua một trục  Cắt ñầu dính: 5’-G-3’OH 3’-CTTAA-5’P 5’P-AATTC-3’ 3’OH-G-5’ 5’-A-3’OH 3’-TTCGA-5’P 5’P-AGCTT-3’ 3’OH-A-5’ 168 GV. TS.VoõMinh Trí Vị trí cắt của enzyme cắt hạn chế  Cắt ñầu bằng: 169 5’-CCC-3’OH 3’-GGG-5’P 5’P-GGG-3’ 3’OH-CCC-5’ 5’-AGG-3’OH 3’-TCC-5’P 5’P-CCT-3’ 3’OH-GGA-5’ 170 GV. TS.VoõMinh Trí T4 DNAligase  ðược tìm thấy và chiết tách từ bacteriophageT4  Xúc tác sự hình thành phosphodiester giữa 3’OH của chuỗi DNA này với ñầu 5’P của một chuỗi DNAkhác  T4 DNA ligase có thể nối DNAsợi ñôi hoặc DNA sợi ñơn/RNA ñể tạo thành một phântử  Trong trường hợp DNA sợi ñôi, các ñoạnDNA ñã xử lý với enzyme cắt hạn chế thì T4 DNAligase chỉ có thể nối các ñoạn DNA cắt cùng loạienzyme GV. TS.VoõMinh Trí T4 DNA ligase 171 Phân tử DNA 1 ñã xử lý vớiEcoRI 5’-ATATATACCGGAG-3’OH 3’-TATATATGGCCTCTTAA-5’P GV. TS.VoõMinh Trí Phân tử DNA 2 ñã xử lý vớiEcoRI 5’P-AATTCTTCCACCCCCGGAAGCTTGGGAAAT-3’ 3’OH-GAAGGTGGGGGCCTTCGAACCCTTTA-5’ T4 DNAligase 5’P3’OH 3’OH5’P 5’-ATATATACCGGAGAATTCTTCCACCCCCGGAAGCTTGGGAAAT-3’ - - - - - - 3’-TATATATGGCCTCTTAAGAAGGTGGGGGCCTTCGAACCCTTTA-5’ Liên kết hydro ñược tạo thành giữa các base nitơ bắt cặp bổ sung 5’-ATATATACCGGAGAATTCTTCCACCCCCGGAAGCTTGGGAAAT-3’ - - - - - - 3’-TATATATGGCCTCTTAAGAAGGTGGGGGCCTTCGAACCCTTTA-5’ T4 DNA ligase sẽ xúc táchình thành liên kết phosphodiester ở cả hai mạch tạo thành 1 phân tử DNA 172 MỘT SỐ DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠG NV.T GS.V PoõM Hin Áh Tr Pí DÙNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ  Pipetman, eppendorf  Máy ly tâm, phương pháp ly tâm  ðiện di và phát hiện nucleic acid  Nhân bản DNA bằng phản ứngPCR  Xác ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch mẫu nucleic acid  Biến tính DNA  Lai DNA  Giải trình tự DNA  Tách chiết DNA bộ gene và plasmid  Thu nhận ñoạn DNA, gene 173 GV. TS.VoõMinh Trí Pipetman Hút chính xác vi dung tích (µl) 174 GV. TS.VoõMinh Trí Eppendorf  Chứa mẫu với dung tích nhỏ (0,5µ l –2ml)  Ống ly tâm  Ống thực hiện phản ứng PCR 175 GV. TS.VoõMinh Trí Phương pháp ly tâm  Phân tách các thành phần rắn trong huyền phù dựa vào trong lượng phân tử dưới tác dụng của lực ly tâm F = mω2r RCF = (1.119 x 10-5)(rpm)2(r) 176 GV. TS.VoõMinh Trí ðiện di DNA  Phân tách các ñoạn DNA có kích thước phân tử khác nhau dưới tác dụng của ñiện trường  Mẫu di chuyển từ cực âm sang cực dương  Bộ nguồn: cung cấp dòng ñiện  Bồn ñiện di: nơi chứa dung dịch ñiện di, giá thể ñiện di (agarose gel), nơi xảy ra quá trình di chuyển của các ñoạn DNA 177 GV. TS.VoõMinh Trí ðiện di DNA Cách tiến hành:  Chuẩn bị giá thể ñiện di (agarose gel): ñun chảy agarose gel, chờ nguội, ñổ vào khuôn ñã gắn lược tạo giếng, chờ agarose gel ñông  Tháo lược ra khỏi agarose gel, lắp vào bồn ñiện di, thêm dung dịch diện di vượt qua mặt gel 178 GV. TS.VoõMinh Trí ðiện di DNA Cách tiến hành:  Chuẩn bị mẫu ñiện di: mẫu DNA ñược trộn với dung dịch nạp mẫu  Chứa glycerol hoặc succrose: ngăn không cho mẫu DNA thoát ra khỏi giếng  Chứa phẩm màu: nhận biết mẫu ñiện di ñã di chuyển tới ñâu trong giá thể ñiện di  Mỗi mẫu DNA ñược nạp ở mỗi 179 giếng khác nhau  Giếng ñầu tiên ñược nạp với thang DNA  Chứa các ñoạn DNA ñã biết trước kích thước  ðậy nắp bồn ñiện di, bật nguồn ñể cung cấp dòng ñiện, quan sát sự di chuyển của vạch màu, tắt nguồn khi vạch màu di chuyển tới một vị trí thích hợp GV. TS.VoõMinh Trí ðiện di DNA 1.0 kb Cách tiến hành:  Ngâm gel vào dung dịch chứa ethidium bromide  Ethidium bromide có ái lực mạnh với nucleic acid và xen giữa hai base nitơ, phát sáng khi kích thích bằng tia UV, vì vậy trên gel agarose nơi có DNA thì ethidium bromide sẽ gắn vào vàphát ra vạch sáng  Xem kết quả trên hộp ñèn UV, chụp hình 1 2 3 4 5 1176 bp 0.5 kb 2148 bp 3.5 kb 3.0 kb 2.5 kb 180 181 Xác ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch mẫu nucleG iV c.TS a.V co iõM dinhTrí  Xác ñịnh nồng ñộ của dung dịch nucleic acid:  Dựa vào sự hấp thu của nucleic acid ở bước sóng 260nm  ðối với dung dịch DNA mạch ñôi: 1 ñơn vịOD260nm tương ứng 50µg/ml  ðối với dung dịch DNA mạch ñơn hoặc RNA: 1 ñơnvị OD260nm tương ứng 40µg/ml  Xác ñịnh ñộ sạch của mẫu nucleic acid:  Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm  OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2 => mẫu nucleic acid sạch protein Xác ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch mẫu nucleG iV c.TS a.V co iõM dinhTrí 182 GV. TS.VoõMinh Trí Nhân bản DNA bằng phản ứngPCR  PCR (Polymerase Chain Reaction): là phản ứng nhân bản in vitro DNA dưới xúc tác của DNA polymerase chịu nhiệt  Gồm 3 bước: Biến tính DNA: phản ứng PCR ñược nâng nhiệt ñộ tới khoảng 95oC ñể hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau ra. Hai mạch này ñược sử dụng làm khuôn  Bắt cặp: Phản ứng PCR ñược hạ nhiệt ñộ xuống trong khoảng 50-65oC ñể mạch khuôn và mồi bắt cặp với nhau. Nhiệt ñộ bắt cặp tùy thuộc vào ñặc tính của mồi 183 GV. TS.VoõMinh Trí Nhân bản DNA bằng phản ứngPCR  Kéo dài: Phản ứng PCR ñược nâng lên nhiệt ñộ thích hợp cho DNA polymerase chịu nhiệt hoạt ñộng khoảng 72oC ñể kéo dài mồi theo chiều 5’=> 3’bằng cách thêm nucleotide vào ñầu 3’OH và dựa vào mạch bổ sung  Ba bước này tạo thành một chu kỳ trong phản ứng PCR. Mỗi phản ứng PCR thường lặp lại khoảng 30 – 35 chu kỳ  Khuếch ñại số lượng bản sao ñoạn DNA lên 106 lần 184 GV. TS.VoõMinh Trí Biến tính DNA  Liên kết hydrogen giữa hai mạch bổ sung có thể bị cắt ñứt khi xử lý với tác nhân hóa học-vật lý, giúp hai mạch tách rời nhau  Tm: nhiệt ñộ cần thiết ñể mạch ñôi của phân tử DNA tách thành mạch ñơn  Hai mạch DNA ñã tách có thể tái bắt cặp bổ sung ñể trở về dạng ban ñầu (phân tử DNA mạch ñôi) khi dung dịch ñược hạ nhiệt ñộ từ từ 185 GV. TS.VoõMinh Trí Lai DNA (DNAhybridization)  Phương pháp lai Southern  Giúp phát hiện trình tự chuyên biệt trên một ñoạn DNA  Dựa vào sự bắt cặp bổ sung giữa trình tự cần xác ñịnh và mẫu dò (probe)  Probe: oligonucleotide với trình tự ñã biết và ñược ñánh dấu bằng ñồng vị phóng xa, chất phát huỳnh quang, một chất có khả năng tạo màu 186 GV. TS.VoõMinh Trí Lai DNA (DNAhybridization) 187 GV. TS.VoõMinh Trí 188 Giải trình tự DNA Dùng phương pháp Sanger với dideoxyribonucleotide (ddNTP) ñánh dấu  Trình tự DNA ñược ñọc dựa trên tổng hợp các sợi bổ sung bằng DNA polymerase bị gián ñoạn bởi một ddNTP nhất ñịnh ñược ñánh dấu  Tách các ñoạn DNA bằng ñiện di trên polyacrylamide gel  ðọc trìnhtự GV. TS.VoõMinh Trí Giải trình tự DNA 189 GV. TS.VoõMinh Trí Thu nhận DNA bộ gene và plasmid  Tách chiết DNA bộ gene, plasmid từ tế bào  Phân tích bằng ñiện di  Kiểm tra ñộ sạch, nồng ñộ 190

More Related Content

Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí

  • 1. TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOAHỌC TỰ NHIÊN GV. TS.VoõMinh Trí ðẠI HỌC QUỐC GIATP. HỒ CHÍ MINH SINH HỌC PHÂN TỬ (MOLECULAR BIOLOGY) 1 CBGD: GV.TS.VoõMinh Trí
  • 2. NỘI DUNG GV. TS.VoõMinh Trí 1. Giới thiệu 2. Cấu trúc và sự nhân bản của vật liệu di truyền 3. Biểu hiện gene 4. ðiều hòa biểu hiện gene 5. Dụng cụ, thiết bị dùng trong sinh học phân tử 6. Enzyme dùng trong sinh học phân tử 7. Một số phương pháp trong sinh học phân tử 2
  • 3. GIỚI THIỆU GV. TS.VoõMinh Trí 3  Sinh học phân tử là gì?  Môn học tìm hiểu những hiện tượng sinh học ở mức ñộ phân tử: ñịnh nghĩa này khó phân biệt sinh học phân tử với sinh hóa (biochemistry).  Môn học nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen ở mức ñộ phân tử.  Trong lịch sử, sinh học phân tử phát triển từ môn di truyền học và sinh hóa học.  ðiểm bắt ñầu của sinh học phân tử từ nhữngthí nghiệm di truyền của Mendel từ giữa thế kỷ 19.  Di truyền tính trạng  Sinh học phân tử ra ñời vào 1944 khi thành phần hóa học của gen ñược khám phá.
  • 4. GV. TS.VoõMinh Trí 4
  • 5. 5 GV. TS.VoõMinh Trí CẤU TRÚC VÀ SỰ NHÂN BẢN CỦA VẬTLIỆU DI TRUYỀN  Phát hiện và vị trí của DNA trong tếbào  DNA là vật liệu di truyền  Thành phần và cấu trúc DNA  Cơ chế sao chép  Cơ chế sửa sai và bảo vệ DNA
  • 6. 6 GV. TS.VoõMinh Trí PHÁT HIỆN VÀ VỊ TRÍ CỦA DNA TRONG TẾBÀO  1896 Friedrich Meischer ñã phân lập DNAtừ tinh trùng cá và mủ từ vết thương.  Vì phân lập từ vùng nhân (nuclei), F. Meischer ñặt tên cho thành phần hóa học mới này là nuclein  Tên ñược ñổi thành nucleic acid, sau ñó là deoxyribonucleic acid (DNA)  1914 Robert Feulgen phát hiện DNAnhuộm màu với thuốc nhuộm fuchsin
  • 7. GV. TS.VoõMinh Trí Phát hiện và vị trí của DNA trong tếbào 7
  • 8. GV. TS.VoõMinh Trí Vị trí của DNA trong tế bào 8
  • 9. 9 GV. TS.VoõMinh Trí DNA LÀ VẬT LIỆU DI TRUYỀN  Thí nghiệm chứng minh hiện tượng biến nạp ở vi khuẩn của Griffith (1928)  Thí nghiệm chứng minh nhân tố gây biến nạp là DNA của Avery, Loeod, và Carty (1944)  Thí nghiệm xác ñịnh vật liệu do phage bơm vào vi khuẩn là DNA của Hershey và Chase (1952)
  • 10. HIỆN TƯỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN (GrG ifV f. iT tS h.V )oõMinhTrí  Streptococcus pneumoniae: phế cầu khuẩn gây viêm phổi  Chủng ñộc (S, smooth): khuẩn lạc trơn, gây chết chuột  Chủng lành (R, rough): khuẩn lạc thô, không gây chết chuột 10
  • 11.  ðun diệt chủng ñộc,tiêm vào chuột: chuột sống. HIỆN TƯỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN (GriG fV f. itT hS. )VoõMinhTrí 11  ðun diệt chủng ñộc, trộn với chủng lành, tiêm vào chuột: chuột chết.  Kết luận: tế bào chết chủng ñộc ñã truyền tính gây bệnh cho chủng lành.  Biến nạp (transformation):  Griffith: hiện tượng truyền tính gây bệnh từ vi khuẩn ñộc sang vi khuẩn lành.  Sinh học phân tử hiện ñại: sự tiếp nhận DNA trần bởi tế bào nhận.
  • 12. HIỆN TƯỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN (GriG fV f. itT hS. )VoõMinhTrí 12
  • 13. NHÂN TỐ GÂY BIẾN NẠP LÀ DNA (Avery, LoeodG ,V. CTS a. rVo tõ yM )inhTrí 13
  • 14. NHÂN TỐ GÂY BIẾN NẠP LÀ DNA(Avery, LoG eV o. dTS ,.V Coõ aM rin th yTr )í 14  Huyền phù chủng ñộc ñã bị ñun chết ñược trộn với các enzyme khác nhau trước khi trộn với chủng lành và tiêm vào chuột:  Xử lý với protease (thủy phân protein): chuột chết.  Xử lý với ribonuclease (thủy phân RNA): chuột chết.  Xử lý với endonuclease (thủy phân DNA): chuột sống.  Trộn DNA từ chủng ñộc chết với chủng lành, tiêm vào chuột: chuột chết.  Kết luận: DNA là vật liệu di truyền ở hiện tượng biến nạp
  • 15. GV. TS.VoõMinh Trí VẬT LIỆU DO PHAGE BƠM VÀO VI KHUẨN LÀ DNA (Hershey, Chase) 15  Sự xâm nhập và nhân bản bacteriophage ở vi khuẩn  Nuôi cấy bacteriophage
  • 16. SỰ XÂM NHẬP VÀ NHÂN BẢN BACTERIOPHAGEG ỞV.T VS. IVo KõM Hinh UTr Ẩí N  Bacteriophage (phage, thực khuẩn thể): vi rút của vi khuẩn 16  Phage T2:  Vỏ protein bên ngoài  DNA bên trong  Phage T2 xâm nhiễm vi khuẩn E. coli  Gắn lên bề mặt vi khuẩn  Chuyển vật chất vào vi khuẩn  Làm tan vi khuẩn và phóng thích các phage mới  Protein hay DNAñược chuyển vào E. coli?
  • 17. SỰ XÂM NHẬP VÀ NHÂN BẢN BACTERIOPHAGEG ỞV.T VS. IVo KõM Hinh UTr Ẩí N 17
  • 18. GV. TS.VoõMinh Trí 18
  • 19. GV. TS.VoõMinh Trí THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)  ðánh dấu protein của phage bằng 35S bằng cách nhiễm phage lên E. coli ñược nuôi trong môi trường có chứa chất dinh dưỡng 35S  Phage ñược sinh ra có protein mang 35S 19
  • 20. GV. TS.VoõMinh Trí THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)  ðánh dấu DNA của phage bằng 32P bằng cách nhiễm phage lên E. coli ñược nuôi trong môi trường có chứa chất dinh dưỡng 32P  Phage ñược sinh ra có DNA mang32P 20
  • 21. 21 GV. TS.VoõMinh Trí THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)  Nhiễm phage ñã ñánh dấu 35S và 32P lên E. colinuôi trong môi trường không chứa ñồng vị phóng xạ  Tách phần gắn của phage lên bề mặt E. coli bằng cách lắc mạnh  Ly tâm ñể làm lắng E. coli ở ñáy ống ly tâm  Thu E. coli ở cặn lắng (cặn ly tâm, precipitant) ñáy ống ly tâm và thu dịch không lắng (dịch nổi, supernatant) chứa phage
  • 22. 22 GV. TS.VoõMinh Trí THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)  Xác ñịnh hàm lượng ñồng vị phóng xạ 35S và 32P ở phần cặn (chứa E. coli) và phần dịch nổi (chứa phage):  Tế bào E. coli (phần cặn) chứa 70% tổng 32P  Dịch nổi chứa phage chiếm 80% tổng 35S  Kết luận:  DNA của phage ñược chuyển vào trong tế bào E. coli, cho phép nhân bản tạo nhiều phage mới trong E. coli  Vật chất di truyền của phage là DNA
  • 23. GV. TS.VoõMinh Trí THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952) 23
  • 24. GV. TS.VoõMinh Trí THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC DNA  Thành phần hóa học và ñặc ñiểm DNA sợiñơn  Mô hình cấu trúc DNA mạch ñôiWatson-Crick  ðặc tính ñối songsong  Các cấu hình DNA  Cấu trúc bậc cao của DNA ở tếbào tiền nhân (prokaryote)  Cấu trúc bậc cao của DNA ở tếbào nhân thật (eukaryote) 24
  • 25. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ðƠN PHÂN TRONG DNAVÀ RNA GV. TS.VoõMinh Trí 25
  • 26. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ðƠN PHÂN TRONG DNAVÀ RNA GV. TS.VoõMinh Trí 26
  • 27. GV. TS.VoõMinh Trí 27
  • 28. SỰ HÌNH THÀNH NUCLEOSIDE VÀ NUCLEOTIDE GV. TS.VoõMinh Trí 28
  • 29. CÁC DẠNG NUCLEOTIDE MONOPHOSPHATE TỪ ADENINE: AMP,cAMP GV. TS.VoõMinh Trí 29
  • 30. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ðƠN PHÂN TRONG DNAVÀ RNA GV. TS.VoõMinh Trí Các dạng deoxyribonucleotide 30
  • 31. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ðƠN PHÂN TRONG DNAVÀ RNA GV. TS.VoõMinh Trí Các dạng ribonucleotide 31
  • 32. PHÂN LOẠI NUCLEOTIDE VÀ NUCLEIC ACID GV. TS.VoõMinh Trí 32
  • 33. GV. TS.VoõMinh Trí SỰ TẠO THÀNH PHÂN TỬ POLY-(RIBO)NUCLEOTIDE BẰNG LIÊN KẾT PHOSPHODIESTER 33
  • 34. GV. TS.VoõMinh Trí SỰ SẮP XẾP BASE, RIBOSE VÀ PHOSPHATE TRONGMẠCH NUCLEICACID  Khung: mạch ribose và liên kết phosphodiester  ðầu chứa gốc phosphate tựdo: ñầu 5’ phosphate (ñầu5’)  ðầu chứa gốc hydroxyl tựdo: ñầu 3’ hydroxyl (ñầu3’)  Các base gắn vuông gốc với mặt phẳng ñường ribose  Mạch nucleic acid có tính ñịnh hướng 34
  • 35. LIÊN KẾT HYDROGEN GIỮA CÁC CẶP BASE PURINE-PYRIMIDINE TRONG NUCLEIC ACID MẠCH KÉP GV. TS.VoõMinh Trí 35
  • 36. TÍNH ðỐI SONG SONG CỦA HAI MẠCH TRONG PHÂN TỬ DNA GV. TS.VoõMinh Trí 36
  • 37. MÔ HÌNH DNA KÉP CỦA WATSON-CRICK(1953) GV. TS.VoõMinh Trí 37
  • 38. GV. TS.VoõMinh Trí CÁC CẤU HÌNH CỦA DNA TRONG TẾBÀO  DNA tồn tại ở nhiềucấu hình khác nhau:  Bán kính phân tử (r)  Khoảng cách giữa 2 nucleotide (h)  Các cặp nucleotide/vòng xoắn (n)  Dạng B: trong ñiều kiện sinh lý bình thường  Các dạng khác (A, C,…, Z): các ñiều kiện môi trường, nội môi trường khác nhau 38
  • 39. CÁC THÔNG SỐ ðẶC TRƯNG CỦA DNA DẠNG A, B, Z GV. TS.VoõMinh Trí 39
  • 40. KÍCH THƯỚC PHÂN TỬ DNA GV. TS.VoõMinh Trí 40
  • 41. KÍCH THƯỚC PHÂN TỬ DNA GV. TS.VoõMinh Trí 41
  • 42. CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở PROKARYOTE GV. TS.VoõMinh Trí 42
  • 43. CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở PROKARYOTE GV. TS.VoõMinh Trí 43
  • 44. CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở EUKARYOTE GV. TS.VoõMinh Trí 44
  • 45. CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở EUKARYOTE GV. TS.VoõMinh Trí 45
  • 46. 46 CƠ CHẾ SAO CHÉP DNA GV. TS.VoõMinh Trí  Sao chép theo khuôn, bán bảo tồn  Cơ chế phân tử của sự sao chép  So sánh sao chép ở prokaryote và eukaryote
  • 47. CÁC MÔ HÌNH SAO CHÉP DNA GV. TS.VoõMinh Trí  Sao chép (sao mã, replication) 47
  • 48. THÍ NGHIỆM CỦA MESELSON-STAHL (1958) GV. TS.VoõMinh Trí 48
  • 49. THÍ NGHIỆM CỦA MESELSON-STAHL (1958) GV. TS.VoõMinh Trí 49
  • 50. THÍ NGHIỆM CỦA MESELSON-STAHL (1958) GV. TS.VoõMinh Trí 15N-15N 15N-15N 15N-15N 15N-14N 14N-14N 50
  • 51. SAO CHÉP THEO KHUÔN, BÁN BẢO TG ỒV.T NS.VoõMinh Trí 51
  • 52. 52 CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA SỰ SAO CHÉP DNA GV. TS.VoõMinh Trí  ðiều kiện của phản ứng tổng hợp DNA (saochép):  Cần khuôn mạch ñơn  Xúc tác bởi DNApolymerase  Cần ñoạn mồi (primer): ñoạn RNA ngắn bổ sung với khuôn  Cơ chất: dATP, dCTP, dTTP, dGTP (dNTP)  Mạch mới ñược tổng hợp bằng cách kéo dài mồi theo chiều 5’ -> 3’: ñầu 5’-phosphate của nucleotide mớisẽ gắn vào ñầu 3’-OH của ñường ribose trong oligonucleotide  Các nucleotide ñược nối với nhau bằng liên kết phosphodiester giữa 5’-P và 3’-OH
  • 53. CÁC DNA POLYMERASE Ở E. coli GV. TS.VoõMinh Trí 53
  • 54. CƠ CHẤT CỦA PHẢN ỨNG TỔNG HỢP RNA, DNA GV. TS.VoõMinh Trí 54
  • 55. KHUÔN, MỒI VÀ TỔNG HỢP THEO CHIỀU 5’ ->3’ GV. TS.VoõMinh Trí 55
  • 56. GV. TS.VoõMinh Trí KHUÔN, MỒI VÀ TỔNG HỢP THEO CHIỀU 5’ -> 3’ 56
  • 57. 57 GV. TS.VoõMinh Trí BA BƯỚC TRONG QUÁ TRÌNH SAO CHÉP (SAOMÃ)  Khởi sự (Initiation): hình thành phức hợp sao chép (replisome) ở trình tự khởi sự sao chép ori, hình thành khuôn mạch ñơn, hình thành chẻ ba sao chép (replication fork), tạo primer  Tổng hợp (kéo dài, Elongation): kéo dài primer, tổng hợp sợi DNA theokhuôn  Kết thúc (Termination): giải thể phức hợp replisome, kết thúc sao mã
  • 58. GV. TS.VoõMinh Trí CÁC PROTEIN CẦN CHO QUÁ TRÌNH SAO CHÉP (SAO MÃ) 58  DnaA: nhận diện, gắn vào ori, cảm ứng tách mạch, cảm ứng gắn DnaB, DnaC  DnaB: tạo phức hợp với DnaC  DnaC: giúp gắn DnaB vào khuôn  DnaG: primase  SSB: gắn và ổn ñịnh DNA mạchñơn  DNA gyrase: giải xoắn DNA  DNA polymerase III: kéo dài primer, tạo mạch DNAmới, có hoạt tính 3’=> 5’exonuclease ñể loại bỏ nucleotide sai  DNA polymerase I: thủy phân mồi RNA vàthay bằng DNA  DNA ligase: nối các ñoạnOkazaki
  • 59. GV. TS.VoõMinh Trí GẮN DnaA VÀO OriC VÀ HÌNH THÀNH KHUÔN MẠCH ðƠN Ở E. coli 59
  • 60. GV. TS.VoõMinh Trí KHỞI SỰ SAO CHÉP (SAO MÃ) 60
  • 61. GV. TS.VoõMinh Trí VỊ TRÍ VÀ HOẠT ðỘNG CỦA CÁC PROTEIN TRONG SAOCHÉP 61
  • 62. GV. TS.VoõMinh Trí TƯƠNG TÁC CHẶT CHẼ GIỮA CÁC DNA POLYMERASE GIỮA HAI KHUÔN TRONG SAO CHÉP 62
  • 63. GV. TS.VoõMinh Trí TỒNG HỢP LIÊN TỤC Ở MẠCH TRƯỚC VÀ KHÔNG LIÊN TỤC Ở MẠCH SAU 63  Mạch trước: tổng hợp liên tục, hướng ñi vào ngã ba sao chép  Mạch sau: tổng hợp không liên tục theo từng ñoạn Okazaki (1000-2000bp), theo hướng ñi ra khỏi ngã ba sao chép  Tốc ñộ sao chép ở E. coli 5 x 104 nu/phút
  • 64. GV. TS.VoõMinh Trí VAI TRÒ CỦA DNA POLYMERASE I VÀ LIGASE Ở TỔNG HỢP MẠCH SAU 64
  • 65. GV. TS.VoõMinh Trí VAI TRÒ CỦA DNA POLYMERASE I VÀ LIGASE Ở TỔNG HỢP MẠCH SAU 65
  • 66. GV. TS.VoõMinh TríVAI TRÒ CỦA DNA POLYMERASE I VÀ LIGASE Ở TỔNG HỢP MẠCH SAU 66
  • 67. GV. TS.VoõMinh Trí TỔNG HỢP THEO MỘT VÀ HAI CHẺ BA SAOCHÉP 67
  • 68. GV. TS.VoõMinh Trí SAO CHÉP VÀ PHÂN TÁCH DNA CON Ở PROKARYOTE 68
  • 69. GV. TS.VoõMinh Trí KẾT THÚC SAO CHÉP Ở E. coli 69
  • 70. GV. TS.VoõMinh Trí PHÂN TÁCH DNA CON KHI HOÀN TẤT SAO CHÉP 70
  • 71. GV. TS.VoõMinh Trí SAO CHÉP Ở EUKARYOTE  Sao chép phức tạp và chậm hơn so với prokaryote (3000nu/phút)  Nhiều ñiểm xuất phát sao chép (replicon) trên 1 nhiễm sắc thể  Cơ chế kiểm soát sự sao chép lặp lại trên 1 ori 71
  • 72. GV. TS.VoõMinh Trí SAO CHÉP ðỒNG THỜI TRÊN NHIIỀU REPLICON Ở EUKARYOTE 72
  • 73. GV. TS.VoõMinh Trí CƠ CHẾ SỬA SAI VÀ BẢO VỆDNA  Các dạng ñột biến trên DNA  Sửa sai trong sao chép  Sửa sai các ñột biến  Các hệ thống bảo vệ DNA 73
  • 74. 74 GV. TS.VoõMinh Trí CÁC DẠNG ðỘT BIẾN TRÊNDNA  ðột biến do sai sót trong saochép  ðứt mạch do cơhọc  Thủy phân liên kết N-glycoside làm mất base  Methyl hóa trên base dẫn ñến bắt cặp sai  Mất nhóm amine dẫn ñến bắt cặp sai  Chuyển dạng enol-keto, amino-imino dẫn ñến bắt cặp sai  Tạo dimer thymine trên cùng một mạch do tia UV
  • 75. GV. TS.VoõMinh Trí THỦY PHÂN LIÊN KẾT N-GLYCOSIDE LÀM MẤTBASE  Xảy ra với tỷ lệ cao ñối với purine so với pyrimidine  1/105 purine/ngày/tế bào người trong ñiều kiện bình thường 75
  • 76. GV. TS.VoõMinh Trí MẤT NHÓMAMINE 76
  • 77. GV. TS.VoõMinh Trí CHUYỂN DẠNG ENOL-KETO, AMINO-IMINO 77
  • 78. GV. TS.VoõMinh Trí TẠO DIMER THYMINE TRÊN CÙNG MỘT MẠCH DO TIAUV 78
  • 79. 79 GV. TS.VoõMinh Trí HỆ THỐNG SỬASAI DNAðẢM BẢO TÍNH ỔN ðỊNH CỦA VẬT LIỆU DI TRUYỀN DNAQUACÁC THẾ HỆ  Tần số sai sót của sao chép in vitro: 10-5  Tần số sai sót của sao chép in vivo: 10-9  Hệ thống sửa sai DNA:  Sửa sai trong sao chép: DNA polymerase III, DNA polymerase I  Sửa sai do ñột biến
  • 80. GV. TS.VoõMinh Trí HỆ THỐNG SỬA SAI TRÊN DNA Ở E. coli 80
  • 81. MẠCH DNA MẸ VÀCON GV. TS.VoõMinh Trí PHÁT HIỆN NUCLEOTIDE SAI TRÊN MẠCH CON 81
  • 82. GV. TS.VoõMinh Trí THAY ðOẠN CHỨA NUCLEOTIDE SAI BẰNG ðOẠN MỚI 82
  • 83. THAY ðOẠN CHỨA NUCLEOTIDE MẤT BASEBẰNGG ðV. OTS. ẠV NoõM Minh ỚTr Ií  Vị trí apurinic  Vị trí apyrimidinic 83
  • 84. GV. TS.VoõMinh Trí THAY BẰNG ðOẠN MỚI 84
  • 85. 85 GV. TS.VoõMinh Trí HỆ THỐNG BẢO VỆ DNA  Hệ thống sửa sai  Hệ thống SOS  Hệ thống giới hạn-biến ñổi
  • 86. HỆ THỐNG SOS (SOS REGULATORY SYGV S.T TS. EVo MõMin )h Trí 86
  • 87. GV. TS.VoõMinh Trí HỆ THỐNG GIỚI HẠN – BIẾN ðỔI 87 (RESTRICTION – MODIFICATION SYSTEM  Giúp vi khuẩn phân biệt DNA chính mình vớiDNA ngoại lai (phage) và thủy phân DNA ngoạilai  ðặc ñiểm:  Nhận diện một trình tự nucleotide chuyên biệt (trình tự nhận biết) có tính ñối ngẫu (palindrome, trình tự 5’ => 3’ của hai sợi ñồng nhất)  Có hoạt tính methyl hóa một nucleotide trên trình tự nhận biết: hoạt tính methylase  Có hoạt tính cắt liên kết phosphodiester tại trình tự nhận biết, hoặc một vị trí nhất ñịnh so với trình tự nhận biết: hoạt tính endonuclease  Hoạt tính endonuclease chỉ có ñối với trình tự nhận biết không bị methyl hóa
  • 88. GV. TS.VoõMinh Trí HỆ THỐNG GIỚI HẠN – BIẾN ðỔI (RESTRICTION – MODIFICATION SYSTEM 88
  • 89. 89 GV. TS.VoõMinh Trí BIỂU HIỆN GEN: PHƯƠNG THỨC SỬ DỤNG THÔNG TIN DI TRUYỀN TRONG TẾ BÀO  Học thuyết trung tâm  DNA và mã di truyền  Phiên mã ở prokaryote  Phiên mã ở eukaryote  ðặc ñiểm, chức năng các sản phẩm phiên mã(RNA)  Dịch mã  Biến ñổi sau dịch mã
  • 90. 90 GV. TS.VoõMinh Trí HỌC THUYẾT TRUNG TÂM  Gen và tính trạng  Nguyên tắc truyền thông tin di truyền trong tế bào và qua các thế hệ  Các bước trong quá trình biểu hiện của gen
  • 91. SAI HỎNG CỦA GEN DẪN ðẾN CÁC SAI HỎNGGV. ST IS. NVo HõMin HhT Órí A  Bệnh niệu alkaptonuria (Garrod, 1908): ñột biến lặn liên quan ñến homogentisic acid oxidase  Các bệnh di truyền ñột biến lặn khác trong chu trình phenylalanine 91
  • 92. GV. TS.VoõMinh Trí 1 GEN – 1 ENZYME  Beadle, Tatum (1941): thí nghiệm trên mốc vàng Neurospora crassa  Tạo các chủng mốc ñột biến khuyết dưỡng (mất khả năng tự tổng hợp một nhu cầu dinh dưỡng, ví dụ 1 acid amin  Xác ñịnh mỗi chủng ñột biến liên quan ñến 1 gen: giả thuyết “1 gen-1 enzyme”  Mở rộng khái niệm:  1 gen - 1 protein  1 gen - 1 polypeptide  1 gen - 1 ñại phân tử sinh học 92
  • 93. NGUYÊN TẮC TRUYỀN THÔNG TIN DI TGV R.T US.V YoõM Ềin Nh Trí TRONG TẾ BÀO VÀ QUA CÁC THẾ HỆ Truyền thông tin giữa 2 thế hệ Truyền thông tin trong tế bào 93 Functional protein
  • 94. Ý NGHĨA VÀ ðẶC ðIỂM CỦA CÁC BƯGV Ớ.TS C.VoõMinh Trí 94 TRUYỀN THÔNG TIN  Phiên mã (transcription):  Chọn lựa phần thông tin di truyền cần sử dụng từ bộ gen  Chuyển thông tin di truyền từ DNA thành RNA  Kích thước RNA nhỏ 1/1000 lần so với DNA  RNA kém bền do có C2’-OH, chỉ tồn tại trong một thời gian nhất ñịnh trong tế bào  Phương thức mã hóa thông tin không thay ñổi  Bản chất hóa học và kiểu kiên kết hầu như không thay ñổi
  • 95. Ý NGHĨA VÀ ðẶC ðIỂM CỦA CÁC BƯGV Ớ.TS C.VoõMinh Trí 95 TRUYỀN THÔNG TIN  Dịch mã (translation):  Thông tin di truyền ñược dịch thành trình tự các amino acid có bản chất hóa học và kiểu liên kết khác  Các sản phẩm phiên mã ñược dịch mã ở mức ñộ khác nhau  Sản phẩm dịch mã có cấu trúc và chức năng ña dạng  Protein không bền vững và bị phân hủy sau một thời gian nhất ñịnh  Biến ñổi sau dịch mã (post-translational modification)  Giúp kiểm soát ở mức ñộ cao hơn sự biểu hiện của gen  Thực hiện bằng những biến ñổi cộng hóa trị và không cộng hóa trị
  • 96. CHỨC NĂNG ðA DẠNG CỦAPROTEGV I.T NS.VoõMinh Trí 96
  • 97. DÒNG THÔNG TIN Ở TẾ BÀO PROKARYOTE VÀ EGV U.T KS. AVo RõM Yinh OTr Tí E  Prokaryote: DNA=>RNA=>protein=>functional protein  Eukaryote: DNA=>pre-mRNA=>RNA=>protein=>functional protein 97
  • 98. GV. TS.VoõMinh Trí MÃ DI TRUYỀN (CODON) 98
  • 99. GV. TS.VoõMinh TríPHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE  Là phản ứng sinh tổng hợp RNA trong tế bào từ DNA khuôn.  ðiều kiện của phiên mã in vivo:  RNA polymerase có hoạt tính (tạo liên kết phosphodiester giữa các rNTP dựa theo khuôn DNA mạch ñơn) 99  Có ñủ rNTP (rATP, rGTP, rCTP, rUTP)  Gen ñược mở  Sự phiên mã ñược thực hiện theo từng ñơn vị phiên mã  Sự tổng hợp RNAluôn theo chiều 5’ =>3’.
  • 100. ðƠN VỊ PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTEGV.TS.VoõMinh Trí  ðơn vị phiênmã:  Promoter: trình DNA nơi RNA polymerase gắn vào  Trình tự mang mã: gồm trình tự các bộ ba mã hóa (codon) bắt ñầu bằng ATG và kết thúc bằng bộ ba kết thúc  Terminator: trình tự mã hóa cấu trúc kết thúc phiên mã  RNA polymerase gắn với promoter thôngqua nhân tố sigma 100
  • 101. 101 PROMOTER VÀ SỰ NHẬN DIỆN BỞI SIGGVM.TS.AVoõMinh Trí  Promoter: vùng chứa trình tự bảo tồn ở các nucleotide -10 (TATAAT) và -35 (TTGACA) so với ñiểm bắt ñầu +1.  Nhân tố sigma nhận diện và gắn với promoter tại vùng -10 và -35.  Sigma gắn với promoter ở cả hai mạch, mạch xuôi 5’ => 3’chứa trình tự bảo tồn ñược nhận diện là mạch mang mã, mạch ñối diện là mạch khuôn dùng ñể tổng hợp RNA.  Trình tự ribonucleotide của RNA tương tự với trình tự nucleotide của mạch mang mã.
  • 102. CÁC SỰ KIỆN TRONG KHỞI SỰ PHIÊN MGVÃ.TS.VoõMinh Trí 102
  • 103. BA BƯỚC TRONG SỰ PHIÊN MÃ: KÉGOV.TDS.VÀoõMIinhTrí 103
  • 104. BA BƯỚC TRONG SỰ PHIÊN MÃ: KẾTGVT.TSH.VÚoõMCinhTrí 104
  • 105. BA BƯỚC TRONG SỰ PHIÊN MÃ: KẾTGVT.TSH.VÚoõMCinhTrí 105
  • 106. GV. TS.VoõMinh Trí PHIÊN MÃ THEO CÁC ðƠN VỊ PHIÊN MÃ Maïch DNAkhuoân Maïch DNA mang maõ 106
  • 107. GV. TS.VoõMinh TríPHIÊN MÃ THEO CÁC ðƠN VỊ PHIÊN MÃ 107
  • 108. GV. TS.VoõMinh Trí SO SÁNH PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE  Prokaryote:  Một loại RNA polymerase tổng hợp tất cả các loại RNA 108  mRNA thường chứa nhiều ORF (nhiều gene, polycistron)  Eukaryote:  Vùng mang mã di truyền của gene (exon) bị gián ñoạn bởi các ñoạn không mang mã (intron)  mRNA ñược tổng hợp qua hai bước: tiền mRNA (pre mRNA) và mRNA trưởng thành (mature mRNA)  Pre mRNA có chứa chóp 7-methyl-guanosine ở ñầu 5’và chứa ñuôi polyA (100-200 adenine) ở ñầu 3’  Pre mRNA ñược chế biến (splicing) ñể loại bỏ intron và nối các exon lại trước khi ñi vào tế bào chất  mRNA trưởng thành trong tế bào chất chứa thông tin liên tục
  • 109. GV. TS.VoõMinh Trí SO SÁNH PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE  Eukaryote:  mRNA chỉ chứa 1 ORF (một gen, monocistron)  RNA polymerase I và III: tổng hợp rRNA, tRNA và các RNA nhỏ khác 109  RNA polymerase II: tổng hợp mRNA
  • 110. GV. TS.VoõMinh Trí PHIÊN MÃ Ở EUKARYOTE 110
  • 111. GV. TS.VoõMinh Trí GẮN CHÓP 5’, ðUÔI POLYAVÀ SPLICING TRONG PHIÊNMÃ Ở EUKARYOTE 111
  • 112. CÁC VÙNG CHỨC NĂNG VÀ ðỘ BỀN CỦAGmV.TRS.NVoAõMinhTrí  Các vùng chức năng:  5’-UTR (untranslated region): vùng 5’ không dịchmã  Vùng dịch mã: một hay nhiều khung dịch mã (ORF, open reading frame)  3’-UTR: vùng 3’ không dịchmã  Terminator: cấu trúc kết thúc  ðộ bềnmRNA: Phụ thuộc vào cấu trúc bậc cao ở ñầu 5’và 3’, mũ 5’và ñuôi polyA mRNA của prokaryote có cấu trúc ñơn giản, thờigian bán phân ngắn (phút) mRNA của eukaryote có thời gian bán phân dài (30 phút – 24giờ) Vùng 5’không dịch mã 112 Vùng dịch mã, ORF Vùng 3’không dịch mã
  • 113. ðƠN VỊ PHIÊN MÃ CỦA OPERON RNA ỞPROGKV.ATSR.VYoõOMinThETrí 113
  • 114. GV. TS.VoõMinh Trí RNA RIBOSOME (rRNA) 114
  • 115. GV. TS.VoõMinh Trí CẤU TRÚC BẬC 2 CỦA rRNA 115
  • 116. GV. TS.VoõMinh Trí RNA VẬN CHUYỂN (tRNA) 116
  • 117. SỰ GẮN CHUYÊN BIỆT AMINO ACID LÊN tRNATƯGV Ờ.T NS. GVoõM Ứin Nh GTrí  Liên kết ester hình thành giữa 3’-OH của tRNA và –COOH của amino acid tương ứng nhờ sự xúc tác của aminoacyl-tRNA synthetase tương ứng 117
  • 118. MÔ HÌNH PHÂN TỬ MINH HỌA TÍNH CHUYÊN BG IV Ệ.T TS.V Goõ IM Ữin AhTrí ENZYME, AMINO ACID VÀtRNA 118
  • 119. GV. TS.VoõMinh Trí DỊCH MÃ 119  Là quá trình sinh tổng hợp protein trong tế bào trên khuôn mRNA và ribosome.  ðiều kiện của dịch mã in vivo:  Có ñủ amino acid và aminoacyl-tRNA (tRNAgắn amino acid)  Có ñủ các nhân tố dịch mã  Ribosome hoạt ñộng và mRNA  Sự dịch mã ñược thực hiện theo từng ñơn vị là ORF  Sự dịch mã luôn theo chiều 5’ => 3’ của mRNA, ñầu 5’ tương ứng với -NH2 (ñầu N), ñầu 3’ tương ứng với -COOH (ñầu C) của polypeptide
  • 120. GV. TS.VoõMinh Trí DỊCH MÃ TRÊN POLYSOME ðỒNG THỜI VỚI PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE 120
  • 121. GV. TS.VoõMinh Trí BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KHỞI SỰ 121  Gồm các sự kiện lắp ghép có trực tự của mRNA, các tiểu phần ribosome, tRNA-fMet tại codon khởi sự trước khi hình thành một liên kết peptide  Ribosome hoàn chỉnh có ba vị trí:  A: nơi tiếp nhận tRNA gắn amino acid  P: nơi tiếp nhận tRNA-fMet và nơi chứa tRNA-peptide  E: vị trí thoát của tRNA  ðược kiểm soát bởi các nhân tốkhởi sự dịch mã IF (Initiation factor)
  • 122. TƯƠNG TÁC GIỮA 16S rRNA VÀ TRÌNH TGV Ự.TS. SVo HõM Iin NhT Erí - DALGARNO Ở ðẦU 5’CỦA mRNA 122
  • 123. BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KÉOG DV. ÀTS. IVoõMinhTrí  Các nhân tố kéo dài dịch mã EF (elongation factor) giúp ñưa tRNA mang amino acid vào vị trí A và cảm ứng sự xúc tác hình thành liên kết peptide 123
  • 124. BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KÉOG DV. ÀTS. IVoõMinhTrí  Ribosome di chuyển 1 bộ ba theo chiều 5’ => 3’của mRNA  Vị trí của các tRNAtrên ribosome thay ñổi  Năng lượng ñược cung cấp từ sự thủy phân GTP 124
  • 125. BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KÉOG DV. ÀTS. IVoõMinhTrí 125
  • 126. HÌNH THÀNH LIÊN KẾT PEPTIDE VÀ SGV Ự.TS D.Vo ỊõM Cin Hh Trí CHUYỂN CỦA RIBOSOME TRONG DỊCH MÃ 126
  • 127. 127 BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KẾT TG HV.T ÚS. CVoõMinhTrí  Vị trí A củaribosome gặp codon kết thúc  Nhân tố kết thúc dịch mã RF (releasing factor) gắn vào  Thủy phân liên kết ester giữa peptide và tRNA  Hai tiểu phần ribosome tách ly và rời khuôn mRNA
  • 128. BIẾN ðỔI SAU DỊCH MÃ (POST-TRANSLATIONALMODG IV F.T IS C.V Ao TõM Ii Onh NTr )í  Biến ñổi cộng hóa trị: gắn thêm ñường, phosphate, methyl…  Biến ñổi không cộng hóa trị:  Gắn với một hợp chất phân tử lượng nhỏ (tác nhân biến cấu)  Gắn với một protein khác  Tương tác với chaperon phân tử 128
  • 129.  ðột biếnñiểm: ðỘT BIẾN (MUTATION) LÀM THAY ðỔI KIỂU GENE VGÀV.KTSI.ỂVUoõMHinÌhNTrHí  Thêm hoặc mất một nu: làm lệch khung dịch mã  Thay thế nu này bằng nu khác: ñột biến lệch nghĩa (mis-sense), ñột biến trung tính (neutral) hay lặn (silent), ñột biến mất nghĩa (non-sense)  Hồi biến (reverse mutation): ñột biến ñiểm trở lại nu ban ñầu  ðột biến mất ñoạn, thêm ñoạn, ñảo ñoạn, chuyểnvị: làm bất hoạt gen và mất khung dịch mã  Tần số ñột biến tự nhiên:  ðột biến trong sao chép: 10-4-10-8/thế hệ  ðột biến mất nghĩa: 10-6-10-8/thế hệ  Chuyển vị gene: 10-4/thế hệ  Tác nhân gây ñột biến: tia xạ, hóa chất, sinh học…129
  • 130. ðỘT BIẾN (MUTATION) LÀM THAY ðỔI KIỂU GENE VGÀV.KTSI.ỂVUoõ MHinÌhNTrHí 130
  • 131. ðỘT BIẾN (MUTATION) LÀM THAY ðỔI KIỂU GENE VÀG KV. IT ỂS. UVo HõM Ìin Nh HTrí 131
  • 132. GV. TS.VoõMinh Trí ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦAGENE VÀ SỰ PHÁT TRIỂN 132  Hiện tượng ñiều hòa biểu hiện của gene  ðặc ñiểm cơ bản của sự ñiều hòa biểu hiệncủa gene ở prokaryote và eukaryote  Các mức ñiều hòa sự biểu hiện của gene  Kiểm soát dương và kiểm soát âm ở prokaryote  Cấu trúc protein ñiều hòa  ðặc ñiểm kiểm soát phiên mã của gene ởeukaryote  ðiều hòa biểu hiện của gene trong biệt hóavà phát triển
  • 133. 133 HIỆN TƯỢNG ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CGV Ủ.TS A.Vo Gõ M Einh NTrí E  ðáp ứng thích nghi của tế bào, cá thể về hìnhthái, sinh lý, sinh hóa… ñối với sự thay ñổi của môi trường  Sự biểu hiện nối tiếp, có chương trình của các gene ở vi sinh vật  Sự biệt hóa thành nhiều tế bào có chức năng khác nhau trong cơ thể ña bào bậc cao
  • 134. ðẶC ðIỂM BIỂU HIỆN CỦA GENE ỞPROG KV. ATS. RVo YõMi OnhT Trí E  Sự biểu hiện của gene ñáp ứng theo thay ñổi của môi trường  Hầu như không có biệt hóa 134
  • 135. ðẶC ðIỂM BIỂU HIỆN CỦA GENE ỞEUKGV A.T RS.V Yoõ M Oinh TT Erí  Phương thức ñiều hòa phức tạp hơn và có sự biệt hóa 135
  • 136. 136 CÁC MỨC ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦGV A.TS G.Vo Eõ M Ninh ETrí  Mức DNA:  Thay ñổi cấu trúc bậc cao  ðột biến, sắp xếp lại DNA  Mức phiên mã: tăng cường hay ức chế phiên mã tạo mRNA  Mức dịch mã:  Tính ổn ñịnh và cấu trúc mRNA  Hiệu quả tổng hợp protein  Mức sau dịch mã:  Hình thành cấu hình tự nhiên  Chức năng và hoạt tính protein
  • 137. GV. TS.VoõMinh Trí ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦA GENE MÃHÓA ENZYME Ở MỨC PHIÊN MÃ, DỊCH MÃ VÀ SAU DỊCH MÃ 137
  • 138. ðIỀU HÒA SỰ TỔNG HỢP ENZYMEVÀGV. HTS O.Vo ẠõMi TnhTrí TÍNH ENZYME 138
  • 139. GV. TS.VoõMinh Trí BIẾN ðỔI SAU DỊCH MÃ BẰNG CƠ CHẾ BIẾN CẤU (BIẾN ðỔI LẬPTHỂ) 139
  • 140. 140 ðIỀU HÒA PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTEGV:.TKS.VIoỂõMMinh Trí SOÁT ÂM (NEGATIVE CONTROL)  Liên quan tới repressor và operator  Khi repressor gắn vào operator => không tạo mRNA  Repressor ñược ñiều hòa sau dịch mã => trạng thái có hoạt tính và không có hoạt tính:  Repressor ñược hoạt hóa bởi Effector và gắn vào operator: sự biểu hiện của trp operon bị ức chế (repression) bởi tryptophane  Repressor bị bất hoạt không gắn vào operator: sự biểu hiện của lac operon ñược cảm ứng (induction) bằng lactose
  • 141. XÚC TÁC SỰ THỦY PHÂN LACTOSE BỞI -GALACTOSIDASE 141
  • 142. KIỂM SOÁT ÂM SỰ BIỂU HIỆN CỦA OPERON LGV A.T CS. TVo OõM Sin Eh Trí 142
  • 143. KIỂM SOÁT ÂM SỰ BIỂU HIỆN CỦA OPERON TRG YV. PTS T. V Ooõ PMi Hnh ATr Ní E 143
  • 144. 144 GV. TS.VoõMinh Trí ðIỀU HÒA PHIÊN MÃ: KIỂM SOÁTDƯƠNG (POSITIVE CONTROL)  Liên quan tới activator và activator-binding site (hoặc enhancer)  Activator gắn vào enhancer => tăng cường tạo mRNA  Activator ñược ñiều hòa sau dịch mã: trạng thái có hoạt tính và không có hoạt tính  Activator ñược hoạt hóa bởi effector (cAMP) ñể gắn vào activator-binding site: trường hợp lac operon, mal operon
  • 145. ðIỀU HÒA KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở lac OPEROG NV.TS.VoõMinhTrí 145
  • 146. ðIỀU HÒA KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở lacOG PV. ETS. RVo OõMi Nnh Trí 146
  • 147. ðIỀU HÒA KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở malOGV P.T ES. RVoõ OMin Nh Trí 147
  • 148. VAI TRÒ CỦA ACTIVATOR TRONG KIỂM SOÁTGV D.TS Ư.V ƠoõM Nin Gh Trí 148
  • 149. GV. TS.VoõMinh Trí TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN VÀ NUCLEIC ACID  Tương tác không chuyên biệt: histone-DNA  Tương tác chuyên biệt: protein là dimer, mỗi monomer gắn vào một trình tự xác ñịnh trên một sợi DNA  ðặc ñiểm của trình tự gắn protein: lặp lạiñảo ngược (trên một mạch) 149
  • 150. GV. TS.VoõMinh Trí TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN VÀ NUCLEIC ACID 150
  • 151. 151 GV. TS.VoõMinh Trí ðẶC ðIỂM CẤU TRÚC CỦA DNA-BINDINGPROTEIN  Cấu trúc bậc 2 (xoắn -helix), phần ổn ñịnh cấu hình và phần chứa trình tự nhận diện (nơi gắn)  Xoắn-gập-xoắn (Helix-turn-helix motif)  Ngón tay gắn kẽm (zinc finger)  Dây kéo leucine (leucine zipper)
  • 152. GV. TS.VoõMinh Trí MỘT SỐ CẤU TRÚC DNA BINDING PROTEIN 152
  • 153. 153 GV. TS.VoõMinh Trí ðẶC ðIỂM ðIỀU HÒA PHIÊN MÃ Ở EUKARYOTE  Phương thức ñiều hòa phức tạp hơn  Promoter bao gồm: TATAbox và UPE (upstream element)  Hầu hết các gene ñược ñiều hòa bởi ñồng thời nhiều trình tự ñiều hòa  ðiều hóa theo cơ chế kiểm soát dương bởi activator và các enhancer nằm cách xa về phía thượng lưu hoặc hạ lưu của promoter  ðiều hòa theo cơ chế kiểm soát âm bởirepressor và trình tự ñiều hòa (repressor-binding site)
  • 154. GV. TS.VoõMinh Trí PROMOTER Ở PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE 154
  • 155. GV. TS.VoõMinh Trí ENHANCER VÀ KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở EUKARYOTE 155
  • 156. GV. TS.VoõMinh Trí 156
  • 157. 157 GV. TS.VoõMinh Trí ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦA GENE TRONGQUÁ TRÌNH BIỆT HÓA VÀ PHÁTTRIỂN  Các tế bào khác nhau ở cơ thể ña bào ñều có lượng DNA như nhau và có khả năng bắt cặp bổ sung với nhau  Các tế bào biệt hóa khác nhau có hàm lượng, chủng loại mRNA và protein khác nhau  Các gene ñược biểu hiện theo chương trình thời gian  Phiên mã là cơ chế chủ yếu của sự ñiều hòa biểu hiện của gene trong biệt hóa và phát triển
  • 158. 158 MỘT SỐ ENZYME CƠ BẢN DÙNG TRG OV. NTS G.VoõMinhTrí SINH HỌC PHÂN TỬ  DNApolymerase:  Taq polymerase  Pfu polymerase  Enzyme cắt hạn chế:  Enzyme cắt ñầu dính  Enzyme cắt ñầu bằng  Enzyme nối DNA:  T4 DNAligase
  • 159. GV. TS.VoõMinh Trí Taq polymerase  DNA polymerase chịu nhiệt, nhiệt ñộ hoạtñộng thích hợp ở 70-80oC  Chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng  Tốc ñộ tổng hợp chuỗi oligonucleotide khoảng 1000-1500nu/phút  ðược sử dụng ñể tổng hợp ñoạn DNA invitro  Taq polymerase sẽ gắn các dNTP vào ñầu 3’OH của nucleotide nằm trong oligonucleotide dựa theo mạch khuôn 159
  • 160. GV. TS.VoõMinh Trí Taq polymerase 160  Taq polymerase sẽ gắn thêm một nucleotide adenine (A), làm cho mạch mới tổng hợp sẽ dư một Aso với mạch khuôn (75% sản phẩm PCR)  ðộ chính xác không cao (10-4errors/bp)  Phản ứng ñược xúc tác bởi Taq polymerase phải có ñầy ñủ các thành phần sau:  Mạch DNA ñơn làm khuôn  Mồi-là một ñoạn oligonucleotide ngắn (5-150 nu) phải bổ sung với mạch DNAkhuôn  dNTP: dTTP, dATP, dGTP và dCTP  Dung dịch ñệm chứa phần muối và pH thích hợp ñể duy trì hoạt tính của Taq polymerase
  • 161. GV. TS.VoõMinh Trí Taq polymerase - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ 3’-TGATCGAT-5’ 5’-ATCGGC-3’ 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTAA-3’ 3’-ATAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTAA-3’ 3’-ATAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 161
  • 162. 162 GV. TS.VoõMinh Trí Pfu polymerase  Là DNA polymerase chịu nhiệt, nhiệt ñộ hoạtñộng thích hợp ở 70-80oC  Chiết tách từ vi khuẩn cổ Pyrococcus furiosus sốngở suối nước nóng (nhiệt ñộ thích hợp 100oC )  Tốc ñộ tổng hợp chuỗi oligonucleotide khoảng 500-1000nu/phút  ðược sử dụng ñể tổng hợp ñoạn DNA invitro  Pfu polymerase sẽ gắn các dNTP vào ñầu 3’OH của nucleotide nằm trong oligonucleotide dựa theo mạch khuôn
  • 163. 163 GV. TS.VoõMinh Trí Pfu polymerase  Pfu polymerase không gắn nucleotide vào ñầu 3’OH  ðộ chính xác cao (10-6 errors/bp)  Phản ứng ñược xúc tác bởi Pfu polymerase phải có ñầy ñủ các thành phần sau (cũng tương tự Taq polymerase):  Mạch DNA ñơn làm khuôn  Mồi-là một ñoạn oligonucleotide ngắn (5-150 nu) phải bổ sung với mạch DNAkhuôn  dNTP: dTTP, dATP, dGTP và dCTP  Dung dịch ñệm chứa phần muối và pH thích hợp ñể duy trì hoạt tính của Pfu polymerase
  • 164. GV. TS.VoõMinh Trí Pfu polymerase 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ 3’-TGATCGAT-5’ 5’-ATCGGC-3’ 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 164
  • 165. GV. TS.VoõMinh Trí Enzyme cắt hạn chế  Là enzyme của vi khuẩn dùng ñể cắt DNAcủa bacteriophage (phage) xâm nhiễm vi khuẩn, nhờ ñó bảo vệ vi khuẩn khỏi bị phage tiêu diệt  Thủy phân liên kết phosphodiester trên sợi DNA tại vị trí chuyên biệt sẽ giải phóng sợi DNA có ñầu 5’P và 3’OH  Có nhiều loại enzyme cắt hạn chế  Sau khi cắt sản phẩm DNAcó thể ñầu dính hay ñầu bằng  Tên gọi của enzyme cắt hạn chế ñược gọi theo tên viết tắt của loài vi sinh vật ñầu tiên có enzyme cắt giới hạn ñó 165
  • 166. GV. TS.VoõMinh TríCác loại enzyme cắt hạn chế 166
  • 167. 167 GV. TS.VoõMinh Trí Tên gọi của enzyme cắt hạn chế HindIII: Haemophilus influenzae serotype d EcoRI: Escherichia coli RY13 BglII: Bacillus globigii
  • 168. GV. TS.VoõMinh Trí Vị trí cắt của enzyme cắt hạn chế  Trình tự ñối ngẫu: ñối xứng qua một trục  Cắt ñầu dính: 5’-G-3’OH 3’-CTTAA-5’P 5’P-AATTC-3’ 3’OH-G-5’ 5’-A-3’OH 3’-TTCGA-5’P 5’P-AGCTT-3’ 3’OH-A-5’ 168
  • 169. GV. TS.VoõMinh Trí Vị trí cắt của enzyme cắt hạn chế  Cắt ñầu bằng: 169 5’-CCC-3’OH 3’-GGG-5’P 5’P-GGG-3’ 3’OH-CCC-5’ 5’-AGG-3’OH 3’-TCC-5’P 5’P-CCT-3’ 3’OH-GGA-5’
  • 170. 170 GV. TS.VoõMinh Trí T4 DNAligase  ðược tìm thấy và chiết tách từ bacteriophageT4  Xúc tác sự hình thành phosphodiester giữa 3’OH của chuỗi DNA này với ñầu 5’P của một chuỗi DNAkhác  T4 DNA ligase có thể nối DNAsợi ñôi hoặc DNA sợi ñơn/RNA ñể tạo thành một phântử  Trong trường hợp DNA sợi ñôi, các ñoạnDNA ñã xử lý với enzyme cắt hạn chế thì T4 DNAligase chỉ có thể nối các ñoạn DNA cắt cùng loạienzyme
  • 171. GV. TS.VoõMinh Trí T4 DNA ligase 171
  • 172. Phân tử DNA 1 ñã xử lý vớiEcoRI 5’-ATATATACCGGAG-3’OH 3’-TATATATGGCCTCTTAA-5’P GV. TS.VoõMinh Trí Phân tử DNA 2 ñã xử lý vớiEcoRI 5’P-AATTCTTCCACCCCCGGAAGCTTGGGAAAT-3’ 3’OH-GAAGGTGGGGGCCTTCGAACCCTTTA-5’ T4 DNAligase 5’P3’OH 3’OH5’P 5’-ATATATACCGGAGAATTCTTCCACCCCCGGAAGCTTGGGAAAT-3’ - - - - - - 3’-TATATATGGCCTCTTAAGAAGGTGGGGGCCTTCGAACCCTTTA-5’ Liên kết hydro ñược tạo thành giữa các base nitơ bắt cặp bổ sung 5’-ATATATACCGGAGAATTCTTCCACCCCCGGAAGCTTGGGAAAT-3’ - - - - - - 3’-TATATATGGCCTCTTAAGAAGGTGGGGGCCTTCGAACCCTTTA-5’ T4 DNA ligase sẽ xúc táchình thành liên kết phosphodiester ở cả hai mạch tạo thành 1 phân tử DNA 172
  • 173. MỘT SỐ DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠG NV.T GS.V PoõM Hin Áh Tr Pí DÙNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ  Pipetman, eppendorf  Máy ly tâm, phương pháp ly tâm  ðiện di và phát hiện nucleic acid  Nhân bản DNA bằng phản ứngPCR  Xác ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch mẫu nucleic acid  Biến tính DNA  Lai DNA  Giải trình tự DNA  Tách chiết DNA bộ gene và plasmid  Thu nhận ñoạn DNA, gene 173
  • 174. GV. TS.VoõMinh Trí Pipetman Hút chính xác vi dung tích (µl) 174
  • 175. GV. TS.VoõMinh Trí Eppendorf  Chứa mẫu với dung tích nhỏ (0,5µ l –2ml)  Ống ly tâm  Ống thực hiện phản ứng PCR 175
  • 176. GV. TS.VoõMinh Trí Phương pháp ly tâm  Phân tách các thành phần rắn trong huyền phù dựa vào trong lượng phân tử dưới tác dụng của lực ly tâm F = mω2r RCF = (1.119 x 10-5)(rpm)2(r) 176
  • 177. GV. TS.VoõMinh Trí ðiện di DNA  Phân tách các ñoạn DNA có kích thước phân tử khác nhau dưới tác dụng của ñiện trường  Mẫu di chuyển từ cực âm sang cực dương  Bộ nguồn: cung cấp dòng ñiện  Bồn ñiện di: nơi chứa dung dịch ñiện di, giá thể ñiện di (agarose gel), nơi xảy ra quá trình di chuyển của các ñoạn DNA 177
  • 178. GV. TS.VoõMinh Trí ðiện di DNA Cách tiến hành:  Chuẩn bị giá thể ñiện di (agarose gel): ñun chảy agarose gel, chờ nguội, ñổ vào khuôn ñã gắn lược tạo giếng, chờ agarose gel ñông  Tháo lược ra khỏi agarose gel, lắp vào bồn ñiện di, thêm dung dịch diện di vượt qua mặt gel 178
  • 179. GV. TS.VoõMinh Trí ðiện di DNA Cách tiến hành:  Chuẩn bị mẫu ñiện di: mẫu DNA ñược trộn với dung dịch nạp mẫu  Chứa glycerol hoặc succrose: ngăn không cho mẫu DNA thoát ra khỏi giếng  Chứa phẩm màu: nhận biết mẫu ñiện di ñã di chuyển tới ñâu trong giá thể ñiện di  Mỗi mẫu DNA ñược nạp ở mỗi 179 giếng khác nhau  Giếng ñầu tiên ñược nạp với thang DNA  Chứa các ñoạn DNA ñã biết trước kích thước  ðậy nắp bồn ñiện di, bật nguồn ñể cung cấp dòng ñiện, quan sát sự di chuyển của vạch màu, tắt nguồn khi vạch màu di chuyển tới một vị trí thích hợp
  • 180. GV. TS.VoõMinh Trí ðiện di DNA 1.0 kb Cách tiến hành:  Ngâm gel vào dung dịch chứa ethidium bromide  Ethidium bromide có ái lực mạnh với nucleic acid và xen giữa hai base nitơ, phát sáng khi kích thích bằng tia UV, vì vậy trên gel agarose nơi có DNA thì ethidium bromide sẽ gắn vào vàphát ra vạch sáng  Xem kết quả trên hộp ñèn UV, chụp hình 1 2 3 4 5 1176 bp 0.5 kb 2148 bp 3.5 kb 3.0 kb 2.5 kb 180
  • 181. 181 Xác ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch mẫu nucleG iV c.TS a.V co iõM dinhTrí  Xác ñịnh nồng ñộ của dung dịch nucleic acid:  Dựa vào sự hấp thu của nucleic acid ở bước sóng 260nm  ðối với dung dịch DNA mạch ñôi: 1 ñơn vịOD260nm tương ứng 50µg/ml  ðối với dung dịch DNA mạch ñơn hoặc RNA: 1 ñơnvị OD260nm tương ứng 40µg/ml  Xác ñịnh ñộ sạch của mẫu nucleic acid:  Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm  OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2 => mẫu nucleic acid sạch protein
  • 182. Xác ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch mẫu nucleG iV c.TS a.V co iõM dinhTrí 182
  • 183. GV. TS.VoõMinh Trí Nhân bản DNA bằng phản ứngPCR  PCR (Polymerase Chain Reaction): là phản ứng nhân bản in vitro DNA dưới xúc tác của DNA polymerase chịu nhiệt  Gồm 3 bước: Biến tính DNA: phản ứng PCR ñược nâng nhiệt ñộ tới khoảng 95oC ñể hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau ra. Hai mạch này ñược sử dụng làm khuôn  Bắt cặp: Phản ứng PCR ñược hạ nhiệt ñộ xuống trong khoảng 50-65oC ñể mạch khuôn và mồi bắt cặp với nhau. Nhiệt ñộ bắt cặp tùy thuộc vào ñặc tính của mồi 183
  • 184. GV. TS.VoõMinh Trí Nhân bản DNA bằng phản ứngPCR  Kéo dài: Phản ứng PCR ñược nâng lên nhiệt ñộ thích hợp cho DNA polymerase chịu nhiệt hoạt ñộng khoảng 72oC ñể kéo dài mồi theo chiều 5’=> 3’bằng cách thêm nucleotide vào ñầu 3’OH và dựa vào mạch bổ sung  Ba bước này tạo thành một chu kỳ trong phản ứng PCR. Mỗi phản ứng PCR thường lặp lại khoảng 30 – 35 chu kỳ  Khuếch ñại số lượng bản sao ñoạn DNA lên 106 lần 184
  • 185. GV. TS.VoõMinh Trí Biến tính DNA  Liên kết hydrogen giữa hai mạch bổ sung có thể bị cắt ñứt khi xử lý với tác nhân hóa học-vật lý, giúp hai mạch tách rời nhau  Tm: nhiệt ñộ cần thiết ñể mạch ñôi của phân tử DNA tách thành mạch ñơn  Hai mạch DNA ñã tách có thể tái bắt cặp bổ sung ñể trở về dạng ban ñầu (phân tử DNA mạch ñôi) khi dung dịch ñược hạ nhiệt ñộ từ từ 185
  • 186. GV. TS.VoõMinh Trí Lai DNA (DNAhybridization)  Phương pháp lai Southern  Giúp phát hiện trình tự chuyên biệt trên một ñoạn DNA  Dựa vào sự bắt cặp bổ sung giữa trình tự cần xác ñịnh và mẫu dò (probe)  Probe: oligonucleotide với trình tự ñã biết và ñược ñánh dấu bằng ñồng vị phóng xa, chất phát huỳnh quang, một chất có khả năng tạo màu 186
  • 187. GV. TS.VoõMinh Trí Lai DNA (DNAhybridization) 187
  • 188. GV. TS.VoõMinh Trí 188 Giải trình tự DNA Dùng phương pháp Sanger với dideoxyribonucleotide (ddNTP) ñánh dấu  Trình tự DNA ñược ñọc dựa trên tổng hợp các sợi bổ sung bằng DNA polymerase bị gián ñoạn bởi một ddNTP nhất ñịnh ñược ñánh dấu  Tách các ñoạn DNA bằng ñiện di trên polyacrylamide gel  ðọc trìnhtự
  • 189. GV. TS.VoõMinh Trí Giải trình tự DNA 189
  • 190. GV. TS.VoõMinh Trí Thu nhận DNA bộ gene và plasmid  Tách chiết DNA bộ gene, plasmid từ tế bào  Phân tích bằng ñiện di  Kiểm tra ñộ sạch, nồng ñộ 190

Từ khóa » Slideshare Sinh Học