Bài Giảng Thư Viện DNA Bộ Gene - Nguyễn Vũ Phong - TaiLieu.VN

Thư viện DNA bộ gene (DNA genomic library)

• Tập hợp tất cả các đoạn DNA của bộ gene sinh

vật.

• Các đoạn DNA được tạo dòng trong các vector • Sử dụng nhằm phân lập một đoạn DNA hoặc xác định vị trí của đoạn DNA trên bộ gene

DNA genomic library là gì?

RE Siêu âm -----------

Thực hiện (phage hoặc cosmid)

• Sử dụng các RE có trình tự nhận biết gồm 4 nu • Cắt từng phần để thu được lượng lớn gene

nguyên vẹn.

• Sử dụng DNA tách từ các loại mô khác nhau • Cắt vector với cùng RE để tạo đầu cố kết • Có thể sử dụng 2 RE để tránh tự kết nối.

B1. Cắt bộ gene bằng RE

• Plasmid: hạn chế đối với đoạn DNA kích thước

lớn, hiệu suất biến nạp tương đối thấp. • Phage : phổ biến nhất, mang DNA ~ 20 kb • Cosmid: mang đoạn DNA ~ 40 – 50 kb • BAC : hữu hiệu nhất

– Mang đoạn DNA lớn 100 – 300 kb – Ít hình thành thể khảm – Hiệu quả trong tạo dòng và thu hồi DNA – Duy trì sự ổn định của DNA gắn trong vector

• YAC : nhận đoạn DNA lớn, khó thao tác.

B2. Tạo dòng

• Hóa biến nạp • Điện biến nạp • Đóng gói DNA tái tổ hợp (phage  hoặc

cosmid) và cho xâm nhiễm tế bào vi khuẩn

B3. Chuyển nạp vào tế bào chủ

cDNA library

Tại sao cần xây dựng thư viện cDNA ?

Tách chiết, tinh sạch và phân tích RNA

1) Tách chiết RNA tổng số

- Nguyên lý: tách rời RNA ra khỏi hỗn hợp DNA ,

protein,… Kiểm soát ribonuclease (RNase) = chất ức chế

-

2) Tách chiết mRNA - Đuôi poly A - -

Tách bằng sắc ký ái lực oligo dT Thu nhận bằng ly tâm

Tổng hợp cDNA theo pp RNaseH

Tổng hợp cDNA self priming

Tổng hợp cDNA đuôi trùng hợp

Tạo dòng cDNA = hệ thống dG:dC

Tạo dòng cDNA bằng 1 linker

Tạo dòng cDNA bằng 2 linker

Tạo dòng cDNA bằng adapter

HindIII

Tạo dòng cDNA bằng primer-adapter

Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid

– Mẫu dò tương đồng (100 %, đã biết trình tự) – Mẫu dò tương đồng từng phần (từ loài kế cận đã

biết trình tự DNA quan tâm)

– Mẫu dò tổng hợp nhân tạo (từ trình tự protein đã

biết)

Mẫu dò nhân tạo từ trình tự protein đã biết

Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid VD: Southern blotting

Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid VD: Southern blotting

Phóng xạ tự ghi

Digoxygenin dUTP

Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid Lai tại chỗ (In situ hybridization)

a) Đánh dấu ở đuôi bằng đồng vị phóng xạ

Tạo probe

b) Dịch chuyển điểm đứt (Nick translation)

Tạo probe

c) Tổng hợp đoạn bổ sung

Tạo probe

Sàng lọc dòng DNA bằng thử miễn dịch (immunochemical screening)

Sàng lọc dòng DNA bằng thử hoạt tính protein

lipase

chitinase

chitin

Trioleoylglycerol + thuốc nhuộm huỳnh quang

Dòng DNA có đúng là dòng mong muốn?

1. Open reading frame. 2. Dự đoán trình tự và chức năng 3. Đánh giá chức năng của sản phẩm DNA 4. Xem xét sự biểu hiện của DNA ở các loại mô

khác nhau

5. Đột biến và đánh giá chức năng