Báo Cáo Thực Hành Hóa Sinh - Tài Liệu Text - 123doc

Có thể bạn quan tâm

Tải bản đầy đủ (.docx) (35 trang)

Trang chủ

Luận Văn - Báo Cáo

Công nghệ - Môi trường

Báo cáo thực hành hóa sinh

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.22 MB, 35 trang )

1TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍMINHKHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG – THỰCPHẨMBÁO CÁOTHỰC HÀNH HÓA SINHGVHD: ThS. Trịnh Thị Lan AnhNhóm 3- 14DSH04Sinh Viên: Nguyễn Thanh HiếuNguyễn Thị Thu ThủyTrần Minh NhiTrương Ngọc PhânNguyễn Minh LuânLê Huỳnh Phương TrúcMSSV: 1411100748MSSV: 1411100788MSSV: 1411100761MSSV: 1411100733MSSV: 1411100758MSSV: 1411100738BÀI 1: GIỚI THIỆU PHÒNG THÍ HÓA SINH, CÁCH PHACHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG PHÒNG THÍNGHIỆM HÓA SINHLý thuyếtQuy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm hóa sinhI.a. An toàn khi làm việc với axit và kiềm An toàn khi làm việc với axit- Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng vớicác axit tự do-Khi pha loãng luôn phải cho axit vào nước . An toàn khi làm việc với kiềm-Kiềm có thể làm cháy da-Mang găng tay , khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm-Thao tác trong tủ hút, mang mặc nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềmb. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm Hóa chất thí nghiệm:- Các hóa chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, trong phòng thínghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm. Nhãn hiệu hóa chất :- Hóa chất được bảo quản trong chai lọ, thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi tên hóachất, công thức hóa hoc, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng phân tử, nơisản xuất , điều kiện bảo quản. Cách sử dụng và bảo quản hóa chất:- Khi làm việc với hóa chất , nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sứccẩn thận tráng gậy những tai nạn đáng tiếc cho mình cũng như cho người khác.2-Bao giờ cũng đổ axit hay bazơ vào nước khi pha loãng .- Không hút axit hay bazơ bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riệng như: ống bóp cao su.II.Cách pha chế các dung dịch trong thí nghiệm hóa sinh: Dung dịch :- Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hổ với nhau về mặt vật lívà hóa học. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi . Các đơn vị nồng độ dung dịch:Nồng độ phần trăm, (% )• Nồng độ phần trăm – khối lượng, % (w/w): là số gam chất tan có trong 100g dung dịch.•Nồng độ trăm khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch.• Nồng độ phần trăm thể tích – thể tích , % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml dungdịch.•Nồng độ gam – lít, (g/L): là số g chất tan có trong 1 lít dung dịch.• Nồng độ phân tử g hay nồng độ mol, (mol/L): là số phân tử g ( hay số mol) chất tan trong 1lít dung dịch.• Nồng độ đương lượng (N); là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lít dungdịch.Số đương lương chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z)- Hệ số đương lượng (z) : phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà chất đótham gia. Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tan cómặt trong dung dịch. Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng :-Nồng độ mg/mL : số mg chất tan trong 1mL dung dịch-Miligam phần trăm , mg% : mg chất tan trong 100g dung dịch-Phần nghìn ,0/00 : số gam chất hòa tan trong 1000g dung dịch-Phần triệu , ppn : số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lịt dung dịch-Phần tỷ , ppb : sồ µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch Cách pha dung dịch có nồng độ xác địnha. Pha dung dịch có nồng độ theo khối lượng ,% (w/w)- Chất tan là chất rắn khan- Chất tan là chất rắn ngậm nước ( CuS04.5H2O..)Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn.b. Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơnc.Pha dung dịch bão hòa :Lấy chất tan cần pha vào becher , thêm một ít nước cất và khuấy cho tan . Nếu saukhi khuấy , chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịchbão hòa. Nếu chất tan tan hết , thêm chất tan và tiếp tục khuấy , cứ như thế cho đến khichất tan không còn tan được nào.d. Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích :-Chất tan là chất rắn khanCân lượng chất tan cần thiết , chuyển sang bình định mức , dùng nước cất hòa tan vàđịnhmức đến thể tích đúng.-Chất tan là chất rắn ngậm nướcKhi pha dung dịch ta cần phải tính lượng kết tinh có sẵn giống như phần a-Chất tan dạng lỏng : một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H2S04…Ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha chế theo nồng độ khới lượng- thểtích (w/v).i.Pha dung dịch nồng độ phân tử gam:- Chất tan là chất rắn khan :Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó , ta tính khối lượng phân tử chấtđó theo đơn vị gam. Cân chính xác lượng chất tan , qua phễu cho vào bình định mức códung tích 1 lít . Cho vào từng lượng nước cất nhỏ , lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nướccất tới mức . Chuyển dunh dịch sang bình chứa, lác để trộn đều đồng nhất.Khi phải đun dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có tỏa nhiệt thì phải chờnhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch định mức.- Chất tan là chất rắn ngậm nước : khi tính lượng chất tan cần cân phải tính luôn cả khốilượng các phân tử nước.- Chất tan dạng lỏng: nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vào nồng độ dungdịch đó. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch.a. Dung dịch chuẩn.Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và đượcdùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. Cách pha dung dịch từ ống chuẩn:- Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức, dùng bình tiarửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm nước cất vừa lắc vàđưa nước cất tới vạch mức.- Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl, AgNO3, acidoxalic,.. có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha, phaloãng và định mức tới thể tích đúng.- Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3,..không thể pha ngay được dung dịch chuẩn,do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậy sau khi phaphải hiệu chỉnh lại nồng độ.b. Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịchĐối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung dịch cónồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnh nồng độ củadung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp.Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lạiphải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịchXét một phản ứng trung hòa acid – base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gamOH-. Do đó:C1V1 =C2V2Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch ta cóhệ số hiệu chỉnh K:K = Cp/Ct = Vp/VtIII.Dung dịch đệma. Định nghĩa dung dịch đệmDung dịch đệm là dung dịch có pH không thay đổi nhiều lắm khi 1 lượng axit (H+ )hoặc bazơ (OH-) . Vậy, dung dịch đệm gồm 1 cặp axit bazơ liên hợp ( axit yếu và muốicủa axit yếu này hoặc bazơ yếu và muối của bazơ này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết địnhpH dung dịch.Trong cơ thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng ví dụ như ổn định pHcủa máu bằng các hệ đệm cacbonat và phosphat.b. Cách pha một số dung dịch đệm thường dùng-Dung dịch đệm boratDung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 3,6)Dung dịch đệm phosphate( pH = 5,7 – 8,0)Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (Ph = 5,0 – 8,0)Dung dịch đệm glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6)Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6)Dung dịch đệm axetat (pH = 3,6 – 5,6)Dung dịch đệm vạn năng 0.1 MCÂU HỎI ÔN TẬPCâu 1:Pha 1L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân X=(40x1000)/100=400(g) NaOH khô.Câu 2:Nồng độ mol của H2SO4 đđ là:CM = (10.d.C%)/M = (10x97x1.84)/98 = 18.2 (mol)Thể tích H2SO4 cần sử dụng là:VH2SO4 = (VH2SO4 2M. CMH2SO4)/CMH2SO4 đđ = (2x500)/18.2 = 54.91(ml)Lượng nước cần bổ sung là: 500 – 54.91 = 445.09 (ml)Câu 3:Pha 250ml dung dịch CuSO4 1M, cân m = n.M = 0.25 x 250 = 62.5 (g)CuSO4.5H2OCâu 4:H2SO4 2M = H2SO4 4NC1.V1 = C2.V2  V2 = (1000 x 0.1)/4 = 25 (ml)Câu 5:-Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X= ( 10x500)/100 = 50 (g)-Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y = (100x50)/40 = 125 (g)-Lượng nước cất thêm vào: 500 – 125 = 375 (g)Câu 6:-Lượng HCl cần để pha dung dịch 2% là: X = (2x500)/100 =10 (g)-Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là: Y = (100 * 10)/37 = 27.03 (g)=> 27.03 /1.19 = 22.71 (ml)-Lượng nước cất thêm vào : 500 – 22.71 = 477.29 (ml)BÀI 2 : ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNGPHÁP ACID DINITRO-SALICYLIC (DNS)LÝ THUYẾT Nguyên tắcPhương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thửacid dinitrosalicylic (DNS) .Cường độ màu của hỗn hợp phản tỉ lệ thuận với nồng độđường khử trong một phạm vi nhất định.THỰC HÀNHI.Dụng cụ -Hóa chất:1. Dụng cụ-Máy đo màu-Cuvette d = 1 cm, V = 4ml-Ống nghiệm có nắp và các dụng cụ thủy tinh khác-Bếp điện2. Hóa chất-Mẫu rau quả chứa đường (dứa)--Thuốc thử DNS--Dung dịch glucose chuẩn 1mg/ml (bảo quản lạnh)II.Tiến hành1. Chiết xuất đường trong thực vật-Chuẩn bị mẫu thơm 20g-Giã nhỏ-Vắt lấy nước cho vào bình định mức-Thêm nước cất đủ 100ml-Pha loãng mẫu hệ số n (20,50,100,200 lần)2. Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đườngHóa chấtỐng ĐCỐng 1Ống 2Ống 3Ống 4Ống 5Mẫu 1 Mẫu 2Glucose10mg/ml (ml)Nước cất (ml)11111111Nồng độ(mg/ml)00.20.40.60.81.0DNS (ml)333333Phaloãng100lần33OD540nm00.1720.3460.5220.6840.8580.248-Đo ở bước sóng 540nm-CHÚ Ý : tiến hành các mẫu dựng đường chuẩn và thí nghiệm đồng thờiPhương trình hồi quy tuyến tính: y = 0.855x + 0.0034, với hệ số tương quan r2 = 0.9998Thay OD của mẫu vào phương trình ta được ymẫu = 0.215Vậy với tỉ lệ pha loãng 100 lần ta được nồng độ đường khử trong mẫu chưa pha loãng là:[đường khử]mẫu = 0.215*100 = 21.5 mg/mlCÂU HỎI ÔN TẬPCâu 1: Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc ketone (-CO) nhưglucose , fructose ,arabinose , maltose , lactose (saccharose , trehalose không phải đườngkhử.Câu 2: Áp dụng phương pháp đo đường khử trong trường hợp phân tích nồng độđường khử trong dung dịch.Câu 3 : Sai số hệ thống do những lý do:-Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không được chuẩn.Do vận chuyển mẫu không đúng cáchThao tác đo không chính xácGhi không chính xác chỉ sốỞ dụng cụ cuvete khi đo OD-Hút hóa chất không chính xácCâu 4 : Khi đo OD máy báo over là do mẫu quá đậm đặc cần phải pha loãng lại.Gía trị OD nằm trong khoảng từ 1 đến 5 .Vì nếu cao quá hoặc thấp quá đường chuẩn sẽbị lệch.Câu 5: Trong bài thực hành chọn đường glucose để dựng đường chuẩn .điều nàykhông luôn đúng .vì đường khử có nhiều loại như fructose, maltose…..12BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNGPHÁP KJELDAHL1. Định nghĩa:- Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số. Nitơ cótrong các thành phần amino acid của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong thànhphần protein như của các muối NH4+, các amino acid tự do, các peptide, urea và cácdẫn xuất của urea, các alkaloid, các base purin và pyrimidine,….. là nitơ phi proteinNitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein- Đạm tổng số hay protein tổng số là nitơ tổng số nhân với hệ số chuyển đổi. Hệ số nàyphụ thuộc vào hàm lượng nito trong protein. Thông thường nito chiếm 16% protein nênhệ số chuyển đổi thường sử dụng là 100/16 = 6.25- Đạm tổng số = Nito tổng số X hệ số chuyển đổi- Bảng dưới đây biểu diễn hệ số chuyển đổi cụ thể cho nhiều đối tượng mẫu khác nhau.MẪUNguồn gốc động vậtHạt bôngĐậu phộngĐậu nànhHạt hướng dươngCơm dừaHạt mèBắpGạoLúa mìHỆ SỐ CHUYỂN ĐỔI6.255.305.465.715.35.35.36.255.955.832. Nguyên tắc:a) Vô cơ hóa mẫu.- Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Cácphản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:2H2SO4  2H20 + 2SO2 + O2- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nito dướitác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành amini acid,cacbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O, còn nito được giải phóng dướidạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4- Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,……chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO,MgO,……b) Chưng cất đạm:- Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH (NH4)2SO4+ 2NaOH  Na2SO4 + H2O + 2NH3- NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứaH2SO4 0.1N2NH4OH + H2SO4  (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 (dư)c) Chuẩn độ H2SO4 dưChuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.1NH2SO4 (dư) + NaOH  Na2SO4 + H2Od) Tính kết quả Hàm lượng % nito tổng số được tính theo công thức:N(%) = {1.42/1000*(V1 – V2)*100/m}*nTrong đó:- V1: số ml H2SO4 cho vào trong bình- V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ- m: số gam mẫu hay ml mẫu sau khi chuẩn độ lại- n: hệ số pha loãng mẫu khi vô cơ hóa mẫu để đưa vào chưng cất3.2 Tiến hành--B1: Lấy 4ml mẫu + 0,5g xúc tác (K2SO4, CuSO4.5H2O = 3:1) + 10ml dung dịchH2SO4 đđ to dung dịch có màu trắng +H2O định mức đến 50ml.B2: Chưng cất đạmCho 50ml mẫu B + 3 giọt Tashiro + 50ml NaOH 40% vào bình cất đạm, cho 30mlH2SO4 0,1 vào erlen + 3 giọt tashiro → lắp đặt hệ thống Kjeldahl và vận hành cho đếnkhi không còn NH4OH sinh ra.B3: Chuẩn độ H2SO4 0,1N dư trong Erlen bằng NaOH 0,1N.Tính kết quả:Hình 1: hệ thống Kjendahl có mẫu đã được vô cơ hóa và phản ứng với NaOH, phía dướilà bình tan giác chứa H2SO4 để cố định NH3 sinh ra.- Hình 2: các bình tam giác chứa H2SO4- Hình 3: bình tam giác sau khi thực hiện quá trình Kjendahl, chứa muối (NH4)2SO4- Hình 4: bình tam giác sau khi chuẩn độ chuyển sang màu xanh nhạt hơn.CÂU HỎI ÔN TẬPCâu 1) Giải thích ý nghĩa các bước trong thí nghiệma) Vô cơ hóa mẫu.- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitodưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3.NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành(NH4)2SO4 tan trong dung dịch.2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4b) Chưng cất đạm:- Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH- (NH4)2SO4 + 2NaOH  Na2SO4 + H2O + 2NH3- NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứaH2SO4 0.1Nc)-2NH4OH + H2SO4  (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 (dư)Chuẩn độ H2SO4 dưChuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.1NH2SO4 (dư) + NaOH  Na2SO4 + H2OCâu 2. Thảo luận các yếu tố dẫn đến sai số.• Hút không chính xác mẫu• Chuẩn độ không chính xác• Sai số của máy chưng cấtCâu 3. Vì sao phải bảo đảm NaOH trong bình chưng cất đạm dư?Vì NaOH dư thì sẽ chuyển tất cả (NH4)2SO4 thành NH3Câu 4. Nếu thay H2SO4 trong bình hứng bằng acid boric (H3BO3) thì kết quả có thayđổi gì không?Ta có: 0.1N H2SO4 = 0.05M H2SO4Ta chuyển qua phương trình và 1.42 là hệ số nito, cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòaNH4OH thì tương đương với 1.42mg nito. Vì lấy 1ml nên nhân thêm cho 10-3•2NH4OH+H2SO40.1*10-3 (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 (dư)0.05*10-3 mN=0.1*10-3 * 14.23NH4OH+0.15*10-3*14.2H3BO3  (NH4)3BO3 + 3H2O + H3BO3Dư0.05*10-3 mN=0.15*10-3 * 14.2= 2.13*10-3Vì vậy nếu thay thành acid boric thì hệ số sẽ là 2.13Câu 5. Nếu chuẩn độ bằng NaOH 0.05N thì kết quả N tổng số thay đổi thếnào? Áp dụng công thức: C1V1 = C2V2V1, C1 cố định và V2 phải chuẩn độMà C2 giảm 1 nữa thì V2 tăng thể tích gấp đôi  Công thức thay đổiBÀI 4. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁPBRADFORDLý thuyết1. Nguyên tắcPhương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộmCoomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid,khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm; khikết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thụ ởbước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein.Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dungdịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là bovineserum albumin (BSA) . Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màusẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kếta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với nướccất (OD0). Lấy giá trị OD = ODx - OD0. Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xácđịnh bằng cách chấm trên đường chuẩn theo OD, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành.Đó chính là lượng protein mẫu trong dung dịch đo.Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250THỰC HÀNH1. Dụng cụ - hóa chất1.Dụng cụ-Máy đo quang phổ- Ống nghiệm (14)- Pipette 5ml, 1ml (có thể thay bằng pipetteman)- Đồng hồ bấm giây- Giấy thấm- Giá để ống nghiệm- Bình tia đựng cồn2. Hóa chất- Cồn 900- Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích, pha trong 1 ml nướccất, lắc đều cho tan. Giữ ở -200C. Khi dùng pha loãng ra 100 lần, được dung dịch có nồngđộ 0,1 mg/ml.- Dung dịch thuốc thử Bradford: dd thuốc thử có thành phần trong 100ml như sau:Coomassie Brilliant Blue: 0,005gMethanol: 4,7gPhosphoric acid 85%: 8,5gPhẩm màu Coomasie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong một chaiđựng màu tối có nắp. Bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Lắcđều, giữ ở 40C- Dung dịch cần xác định hàm lượng protein (phòng thí nghiệm cung cấp)2. Tiến hành- Thu dịch trích ly protein như trong bài enzyme (5 g malt trích ly bằng nước thu được V =100 ml). Pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để được mẫu phân tích (mẫu X).- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu cần phân tíchX- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 0, lắcđều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc đều để yên,... cứtiếp tục cho đến hết.Ống nghiệmNước cất, mlAlbumin chuẩn (0,1mg/ml), ml01010.90.120.80.230.70.340.60.450.50.5TT Bradford, mlNồng độ Albumin(µg/ml)OD595nm505105205305405500.0960.1790.2400.3110.370X0Thayalbuminchuẩnbằngmẫuphaloãng100 lần50.003- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bướcsóng 595 nm. Ta có giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1),... tương tự cứcách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD.3. Tính kết quả:-Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quangOD595nm- Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độODquangOD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein P ở trong mẫu phân tích X.595nm20Y = 10,514X + 0.0015⇒X=Y − 0,00150,045 −0,001510,51410,514== 4,14 . 10−3� = X . n = 4,14 . 10−3. 25 = 0,1035Để tính tóan hàm lượng protein trong 1g mẫu cân:Protein (µg/g) = � ∗��= 0,1035 ∗10100= 1.035CÂU HỎI ÔN TẬP:1. Giải thích ý nghĩa các bước trong thí nghiệm.- Pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để được mẫu phân tích→ Phải giảm bớt nồng độ protein trong mẫu, để khi đo nồng độ quang không bị vượtquá giới hạn cho phép.- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu cầnphân tích X.→ Phải pha các nồng độ khác nhau để lập đường chuẩn. Để xác định protein trongmẫu.- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ốngnghiệm 0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ốngnghiệm 1, lắc đều để yên,... cứ tiếp tục cho đến hết.→ Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộmCoomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein.- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ởbước sóng 595 nm. Ta có giá trị OD 0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD 1),...tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD→ Trong 20 phút thuốc nhuộm kết hợp với protein khi đó thuốc nhuộm hấp thu cựcđại ở bước sóng 595 nm.232. Thảo luận các yếu tố dẫn đến sai số. Do sai thao tác trong tiến hành thí nghiệm. Mẫu protein chuẩn bị không được chuẩn. Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không được chuẩn. Do vận chuyển mẫu không đúng cách Lấy mẫu không đúng theo thể tích yêu cầu Ghi không chính xác chỉ số. Thao tác đo không chính xác Máy đo OD không chuẩn.3. Áp dụng phương pháp bradford cho trường hợp nào Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốcnhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein.Hình thành hợpchất màu có khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệvới nồng độ protein trong dung dịch. Tiết kiệm thời gian và dễ thực hiện. Cường độ màu tỉ lệ nồng độ protein trong dung dịch nồng độ càng cao thìmàu xanh càng đậm không phụ thuộc nồng độ acid amin của dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát phát hiện tới vài protein 5-200 µg/ml Nhạy hơn phường pháp Lowry gấp 4 lần. Ít bị ảnh hưởng bởi các chất thường gặp trong tế bào gặp chẳng hạn như muối.4. Trường hợp mẫu ở thể rắn cần phải xử lý mẫu như thế nào?Cân m = 5-10g mẫu rắn đã nghiền nhỏ, cho vào bình nón dung tích 250ml, bổ sung 50mlnước cất và 10ml dung dich đệm phosphat pH = 4,9. Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30oC trongthời gian 1 giờ có khuấy đảo định kỳ. Lọc, rửa thu hồi dung dịch sao cho V = 100ml. Bảoquản dung dịch gốc ở 2 – 4oC trong thời gian một ngày.BÀI 5: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYMELÝ THUYẾT:I.Enzyme và đơn vị đo hoạt tính của enzyme.a. Định nghĩaEnzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao. Mỗienzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. Hoạt động hayhoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sảnphẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính xúctác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sảnphẩm phản ứng.Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau:Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thờigian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất haysản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định.Để thực hiện được mục đích trên, nhiều phương pháp phân tích khác nhau được sửdụng: phương pháp đo quang phổ, đo độ phân cực, áp suất, độ nhớt, phương pháp sắc kývà phương pháp hóa học.Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. Một đơn vị họattính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp.b. Đơn vị hoạt tính của enzyme:Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U)Do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) địnhnghĩa:Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 �mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 U = 1 �mol sản phẩm = 1 �mol cơ chất (10-6 mol)/phútKatal:Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vịcơ bản của hoạt tính enzyme.Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điềukiện tiêu chuẩn.1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 �mol/ phút = 6 x 107U 1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16,67 nKat (nanokatal)Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI).Đơn vị tự đặt: đơn vị hoạt tính dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng, vídụ sự thay đổi độ đục, độ nhớt ...trong một đơn vị thời gian. Trường hợp cơ chất và sảnphẩm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này.II.Hoạt tính riêng của enzyme.Hoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đăc trưng cho độ tinh sạch của chế phẩmenzyme. Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg protein ( U/mgprotein) hoặc (Kat/kg protein), trong đó hàm lượng protein được xác dịnh bởi phươngpháp Lowry hoặc Bradford.III.Phương pháp xác định hoạt tính enzyme.Chú ý:- Cần trách những yếu tố có thể biến tính protein enzyme.- Các thông số nhiệt độ , pH, nồng độ ion và thành phần dung dịch đệm ảnh hưởng lên hoạttính enzyme. Thử hoạt tính enzyme phải được tiến hành trong điều kiện thích hợp nhưđiều kiện sinh lý, đk tồn trữ thực phẩm hoặc đk mà hoạt lực có thể đạt tối ưu.- Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất ổn định thì phải cho các chất này vàoenzyme trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng.- Nồng độ cơ chất ở giới hạn thích hợp, đủ thừa để bão hòa enzyme, không quá cao để kìmhãm enzyme, cơ chất được chuyển hóa 20%-30%.

Tài liệu liên quan

Báo cáo thực hành hoa sinh
- 34
- 8
- 40
Báo Cáo Thực Hành hóa Sinh - ENZYME
- 5
- 22
- 379
Báo cáo thực hành hóa sinh pdf
- 12
- 10
- 7
Báo cáo thực tập Hóa sinh lâm sàng “Quá trình thực hành và kết quả đạt được khi thực hành lâm sàng tại Khoa xét nghiệm Sinh hóa – Bệnh viện Nhi TW
- 33
- 7
- 26
Báo cáo thực hành hóa sinh
- 31
- 7
- 24
Báo cáo thực hành hóa lý: xác định hằng số tốc độ của phản ứng bậc hai
- 6
- 15
- 77
hướng làm dẫn báo cáo thực hành hóa sinh thực phẩm
- 16
- 1
- 1
Báo cáo thực hành vi sinh
- 57
- 1
- 0
báo cáo thực hánh hóa sinh thực phẩm
- 18
- 3
- 16
Báo cáo thưc hành tinh sinh
- 31
- 970
- 0