Các Phương Pháp Xác định Hoạt Tính Kháng Oxy Hóa Của Dịch Chiết ...

dịch chiết từ thực vật.

+ Phương pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity): Xác định hoạt tính chống oxi hóa so với khả năng chống oxi hóa của

+ Phương pháp DPPH (Scavenging ability towards DPPH

radicals): Khả năng khử gốc tự do DPPH.

+ Phương pháp ORAC (oxygen radical absorbance capacity): xác định khả năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động.

+ Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential): Khả năng chống oxi hóa bằng cách bẫy các gốc tự do.

+ Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power): lực

chống oxi hóa bằng phương pháp khử sắt.

+ Phương pháp reducing power: lực chống oxy hóa bằng phương pháp khử Fe

+ Phương pháp FTC: (ferric thiocyanat ):

+ Phương pháp Conjugated Diene: khảo sát nối đôi liên hợp.

 Phương pháp TEAC:

Cation ABTS+ [2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-

sulfonate)(ABTS)] là một gốc tự do bền. Đây là một chất phát quang màu

xanh, được đặc trưng ở độ hấp thu 734 nm. Khi cho chất chống oxi hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chống oxi hóa sẽ khử ion này thành

ABTS. Đo độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734nm để xác định hoạt tính của chất chống oxi hóa trong sự so sánh với chất chuẩn

Trolox [6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid]. Trong

môi trường kali persulfate, gốc ABTS+ có thể bền 2 ngày ở nhiệt độ phòng trong tối.

 Phương pháp DPPH:

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu

tía và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm. Khi có mặt chất chống

oxi hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine(DPPH-H), có

màu vàng. Đo độ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxi hóa.

Hình 1.4: Phản ứng giữa DPPH và một chất chống oxi hóa

 Phương pháp ORAC:

Phương pháp này đo mức độ phân hủy do bị oxi hóa của fluorescein

khi có sự hiện diện của gốc peroxy. Phản ứng trong điều kiện này được so

sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin

E) và trong hiện diện của mẫu chứa chất chống oxi hóa cần xác định hoạt

tính. Khi fluorescein bị oxi hóa, cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi.

Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục trong 35 phút sau khi thêm chất oxi hóa vào. Khi có mặt chất chống oxi hóa, sự phân rã fluorescein sẽ chậm hơn. Xây dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ

giảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để

tính toán. Kết quả tính toán là mmol Trolox/g mẫu.

Ưu điểm của phương pháp ORAC là xác định được có hoặc không có

sự trễ pha trong mẫu chứa các chất chống oxi hóa. Đây là một điều rất

thuận lợi khi đo các mẫu thực phẩm chứa cả những hợp chất chống oxi hóa

Hình 1.5 : Đồ thị mô tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian

 Phương pháp TRAP:

Phương pháp TRAP sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ 2,2’- azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). Khi cho AAPH vào

môi trường plasma, các chất khử sẽ bị oxi hóa. Quá trình oxi hóa này được đo đạt thông qua hàm lượng oxi tiêu thụ bằng một điện cực. Khi có mặt

chất chống oxi hóa trong môi trường plasma, quá trình oxi hóa sẽ xảy ra

chậm hơn. Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm được tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu so với độ dài pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của

chất chuẩn là dung dịch Trolox. Kết quả tính toán là mmol Trolox/kg mẫu

rắn hoặc mmol Trolox/L mẫu lỏng.

 Phương pháp (FRAP):

Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxi hóa của phương pháp này là

dựa trên khả năng của các chất chống oxi hoá trong việc khử phức Fe3+- TPTZ [2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+-TPTZ (màu xanh) ở pH thấp. Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm

lượng chất chống oxi hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu

này được đo ở bước sóng 593nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (Butylated Hydroxy Toluene).

Khi cho phức Fe3+-TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxi hóa,

các chất chống oxi hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+- TPTZ. Kết quả tính toán là mmol Fe2+/ g chất khô. Do đó, khi kết quả tính

toán ra lớn thì chúng ta có thể suy đoán rằng trong môi trường phản ứng đó, số lượng các phân tử có thể nhường điện tử là cao. Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng vì một phân tử chất chống oxi hóa có thể khử nhiều

phức Fe3+-TPTZ cùng lúc. Đây là một hạn chế của phương pháp FRAP.

 Phân tích lipid:

Phương pháp này đánh giá sự khác biệt trong tốc độ oxi hóa acid

linoleic bởi gốc ABAP trong mối quan hệ với chất chuẩn là tocopherol.

Trước và trong suốt quá trình xảy ra phản ứng, nhiệt độ của hỗn

hợp[70 µL of linoleic acid (2,3 mmol/L)]; 100 mL đệm phosphate 0,05M

(Natri phosphate hòa tan trong nước; 2.88 g SDS; pH 7.4)} được điều

chỉnh và duy trì ở 40oC. Lấy 2µl của dung dịch này cho vào 0,01 ml ABAP(0,04M). Sau 2-5 phút phản ứng, lấy 0,02 ml dịch trích ly cho vào hỗn hợp này. Đo độ hấp thu của hỗn hợp ở 236nm. Xây dựng đường chuẩn

là tocopherol.

 Phương pháp FTC:

Mục đích của phương pháp này là khảo sát khả năng làm giảm sự

peroxide hỗn hợp lipid của chất chống oxy hóa

Trong khảo nghiệm này, hydroperoxide sinh ra bởi acid oleic thêm vào hỗn hợp phản ứng bị oxy hóa bởi không khí và nhiệt độ kèm trong thời gian thử nghiệm được đo gián tiếp. Sắt (II) clorua và ammonium thiocyanate phản ứng với nhau để tạo ra ferric thiocyanate (màu đỏ) nhờ

hydroperoxide. Hỗn hợp thí nghiệm gồm có: 0,1 mL mẫu chất chống oxy

hóa, 1 mL acid oleic 200 mg/mL, 5 mL đệm phosphat 0,04 M; 5 mL EtOH

75%, 2 mL nước cất và giữ ở 45°C, trong bóng tối. Hỗn hợp này cũng được chuẩn bị thêm phản ứng không có acid oleic để làm đối chứng. . Sau khi mẫu có màu đỏ, độ hấp thu được đo ngay lập tức ởbước sóng 500 nm (Trần Thị Việt Hoa et al., 2007). Sử dụng ethanol để hiệu chỉnh máy quang phổ về

 Tổng năng lực khử:

Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxi hóa của phương pháp này là

dựa trên khả năng của các chất chống oxi hoá trong việc khử phức

K3Fe(CN)6 thành phức K4Fe(CN)6, phức này tác dụng với FeCl3 thành K3[Fe(CN)6] (xanh Pruss). Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxi hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 690nm.

 Conjugated Diene:

Mục đích của phương pháp này là khảo sát khả năng làm giảm sự

peroxide hóa lipid của chất kháng oxy hóa.

Bảng 1. Tóm tắt các đặc điểm các phương pháp đo

hoạt tính kháng oxy hóa STT Phương pháp Đặc diểm phương pháp Trang thiết bị Tính khả thi trong các hệ thống sinh học 1 ORAC + + + + + + 2 TRAP - - - - - + + + 3 FRAP + + + + + + - 4 TEAC + + - 5 DPPH + + - 6 FTC + + + + + + -

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU