CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA HPLC ...

Có thể bạn quan tâm

Tải bản đầy đủ (.ppt) (59 trang)

Trang chủ

Luận Văn - Báo Cáo

Kỹ thuật

CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA HPLC-FPLC

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.58 MB, 59 trang )

SINH VIÊN THỰC HiỆNLỚPGIÁO VIÊN HƯỚNG DẪNĐỀ TÀICẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA HPLC-FPLCHPLC-FPLCMÃ SỐ SINH VIÊNMở đầuTừ khi được nhà thực vật học người Nga Mikhail Semyonovich Tsvet phát minh ra đến nay, kĩ thuật sắc kí đã phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc kí Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc kí khác nhau1872–1919Mở đầuMở đầuHigh-performance liquid chromatography-HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) xuất hiện từ những năm 1960 như là nhánh của sắc ký lỏng thực hiện trên cột,trong đó công nghệ chế tạo cột và các bộ phận của thiết bị đã được cải tiếnMở đầuSo với sắc ký lỏng cột áp suất thấp truyền thống, HPLC có những ưu điểm vượt trội hơn như:Tốc độ nhanhĐộ phân giải được cải thiện tốt hơnĐộ nhạy tốt hơnKhả năng tái sử dụng cộtLý tưởng cho những ion hoặc phân tử lớnThu hồi mẫu dễCác ứng dụng của HPLC trong thời kỳ đầu gồm có phân tích dư lượng thuốc trừ sâu trong rau quả, các acid hữu cơ, lipid, acid amin, chất độc và vitamin. Ngày nay, sắc ký lỏng hiệu năng cao tiếp tục được ứng dụng để phân tích nhiều loại vật liệu sinh học khác.Trong đó có kỹ thuật phân tích protein FPLC (Fast protein liquid chromatography)Mở đầuViệc nghiên cứu cấu tạo, nguyên lý hoạt động của HPLC-FPLC nhằm ứng dụng trong phân tích sinh học rất cần thiết cho hoạt động nghiên cứu về sau của sinh viênCẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA HPLC-FPLCHPLC-FPLCđó chính là lý do em chọn đề tài…Sắc ký là khái niệm chung áp dụng cho nhiều kỹ thuật tách đa dạng dựa vào sự phân đoạn hoặc phân bố của mẫu (chất tan) giữa pha di chuyển (pha động) và pha cố định (pha tĩnh)TỔNG QUAN1.1 Phương pháp sắc kýChương IChương I1.1.1 Sắc ký là gì?Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này1.1.1 Sắc ký là gì?Kết quả là các thành phần có trong mẫu sẽ được tách ra thành từng dãi trong pha động1.1.1 Sắc ký là gì?Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến sự phân bố trong hai pha như khả năng hòa tan các thành phần trong 2 pha,khả năng hấp phụ, trao đổi ion, kích thước các phân tử… nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc kýCó nhiều tiêu chí để phân loại các phương pháp sắc ký, trong đó tiêu chí được sử dụng nhiều nhất là phân loại theo hệ pha, tức là chất phân tích phân bố giữa hai pha là gìSắc ký giấy1.1.1 Sắc ký là gì?1.1.2 Phân loại sắc kýPhương pháp sắc kýSắc ký lỏngHPLCSK khí-rắn SK khí-lỏngSắc ký phân bố lỏng-lỏngSắc ký rắn-lỏngSắc ký khíSK phẳngSắc ký điện di mao quảnSắc ký điện di lớp mỏng1.1.3 Phân loại sắc ký1.1.4 Các lực liên kết trong hệ sắc ký Trong hệ sắc ký, chất phân tích có thể là các ion, phân tử trung hoà hay các chất phân cực; đối tượng tác động của nó cũng có thể là ion, phân tử trung hoà hay chất phân cực. Từ đó chúng tương tác với nhau theo các lực liên kết khác nhau. Người ta chia các lực liên kết thành 4 loạiLực liên kết ionLực phân cựcLực Van der WaalsLực tương tác kỵ nước1.2 Sắc ký lỏng trên cột1.2 Sắc ký lỏng trên cộtCấu tạo hệ thống HPLC:Bình chứa pha động.Bộ phận khử khí (degasse)Bơm cao ápBộ phận nạp mẫuCột sắc ký (pha tĩnh)Đầu dò ( detector)Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thốngIn dữ liệu•Thông thường máy HPLC có 4 bình chứa pha động. Mục đích: Tạo nồng độ pha động theo gradient để thực hiện rửa giải trong quá trình sắc ký.•Không sử dụng hết 4 bình khi dùng máy.Bình chứa pha độngVai trò: loại trừ các bọt nhỏ có trong dòng pha động.Các hiện tượng khi không khử sạch bọt khí : + Tỷ lệ pha động cuả các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho pic không chính xác. + Nếu lượng bọt khí quá lớn, bơm sẽ không bơm được pha động, máy ngừng làm việc.Bộ phận khử khíBơm cao ápMục đích: vận chuyển pha động qua hệ thống sắc ký.Đặc điểm: Lưu lượng dòng chảy trong bơm thường là 1ml/phút Được kiểm soát đảm bảo tính đúng và chính xác Hai loại bơm thường được sử dụng vận hành ở chế độ: áp suất không đổi hoặc thể tích không đổi. Cấu tạo: Bơm áp suất không đổi có thiết kế dạng pittong hoặc dạng bơm tiêm.Dạng pittong tạo dòng chảy có xung động, vì vậy phải có bộ phận khử xung cơ học hoặc điện tử để loại trừ dao động của áp suất. Bộ phận khử xung cơ học gồm 1 bộ phận có thể thay đổi thể tích tương ứng sự thay đổi áp suất ( ví dụ như kim loại dễ biến dạng, ống chứa đầy chất lỏng dễ nén…)Dạng tiêm trục vít tạo ra dòng chảy không có xung nhưng thể tích bơm hạn chế.Bộ phận nạp mẫuVai trò: Đưa mẫu vào dòng pha động để nạp vào cột sắc ký. Ngày nay, hầu như tất cả hệ thống HPLC đều sử dụng van nạp mẫu. Bơm tiêm sẽ đưa mẫu đến van nạp mẫu để nạp mẫu vào cộtCấu tạo của van nạp mẫu•Van nạp mẫu là van 6 cổng, trong đó có 1 cổng để nạp mẫu vào vòng nạp mẫu.•Vòng nạp mẫu(sample loops) có thể tích cố định ở áp suất thường. Thể tích vòng nạp thường dùng là 10-100 microlit•Van có thể điều chỉnh để xoay theo các vị trí LOAD và INJECTNguyên tắc hoạt động của van nạp mẫu: Khi van nạp ở vị trí LOAD: mẫu được nạp qua bơm tiêm vào vòng ngoài, lúc đó pha động chảy trực tiếp vào cột sắc ký.Khi van nạp xoay đến vị trí INJECT: vòng chứa mẫu trở thành 1 bộ phận trong dòng chảy của pha động và mẫu sẽ theo pha động vào cột.Cột sắc ký Vai trò: Là công cụ chính để tách riêng các cấu tử có trong mẫu.Cấu tạo: Gồm 2 phần chính: +Phần cứng +Vật liệu nhồi cộtCột phân tích: Kích thước cột thường dùng có đường kính trong 4, 5, 6 mm; chiều dài cột là 10, 15, 25cm. Cột được nhồi bằng các hạt 3, 5, 10 mm, vận hành ở điều kiện lưu lượng 1-2ml/phút.Cột sắc kýPhần cứngDạng ống bằng thép không rỉ, thủy tinh silica nung chảy, titan, nhựa PEEK (polyether ether ketone); có 1 đầu nối với bộ nạp mẫu, 1 đầu nối với detector của hệ thống.Cột precolumn: Là các cột phụ kiện đặt trước cột phân tích HPLC. 2 loại cột phổ biến nhất là cột precolumn bão hòa và cột bảo vệ:•Cột precolumn bão hòa: chứa những hạt silica trầncos kích thước lớn. Cột được đặt giữa bơm và bộ nạp mẫu để bão hòa pha động với silica, nó giúp làm chậm quá trình hòa tan các vật liệu nhồi trên nền silica trong quá trình sử dụng pha động chứa nước.•Cột bảo vệ: Được phủ bên trong bằng lớp mỏng pha liên kết hoặc vật liệu nhồi vi hạt giống cột phân tích. Cột được đặt giữa bộ nạp mẫu và cột phân tích để bảo vệ cột phân tích khỏi bị nhiễm bẩn bởi những thành phần có tính hấp thụ mạnh. Cột bảo vệ cần được nhồi lại hoặc thay thế khi năng lực liên kết bị giảm đáng kể và tạp chất bắt đầu xâm nhập vào cột phân tích.Vật liệu nhồi cột HPLCCác yêu cầu chung của vật liệu nhồi cột + Vật liệu nhồi cột có chức năng chính là làm chất mang của hệ thống sắc ký. Trong sắc ký lỏng-lỏng cổ điển, vật liệu nhồi chỉ có chức năng làm chất mang cho pha tĩnh. Trong sắc ký loại trừ kích thước, sự tương tác giữa chất tan và vật liệu nhồi cột là không cần thiết ( do quá trình tách chỉ dựa trên sự khác biệt về kích thước phân tử). Trong sắc ký hấp thụ ( sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực) vật liệu nhồi thực hiện đồng thời cả chức năng là chất mang và chức năng của pha tĩnh. Do đó, có thể thấy, vật liệu nhồi có thể có liên quan đến quá trình tách thật sự hoặc không. + Vật liệu nhồi phải là sẵn có với kích thước hạt chính xác, đồng đều, ít thay đổi. + Độ bền cơ học đủ lớn để chống lại áp suất tạo ra trong quá trình nhồi cột và sử dụng. + Độ bền hóa học cao, tránh bị ăn mòn nhanh chóng.Vật liệu nhồiChất nhồi cột dựa trên nền silica 1. Silica rỗng: +Đáp ứng khá tốt các yêu cầu của vật liệu nhồi cột. Các hạt silica có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau tùy mục đích sử dụng cột sắc ký mà ta chọn loại hạt cho thích hợp. +Các hạt silica hạt chứa nhiều lỗ nhỏ, có thành phần chủ yếu là SiO2 với mỗi nguyên tử nằm ở tâm tứ diện đều. Tại bề mặt hạt, một hóa trị còn lại thường được nhóm OH chiếm, và gọi đó là silanol, có tác dụng biến tính bề mặt của hạt silica do tính chất hoạt động của nó.2. Pha liên kết: được tạo ra nhờ liên kết đồng hóa trị của nhóm hydrocacbon vào bề mặt silica qua các nhóm silanol tại bề mặtNhược điểm chính của chất nhồi trên nền silica : bộ khung silica hòa tan dần trong dung dịch có nước khi pH>8. Một số vật liệu được sử dung thay thế: alumina, zirconia, titania, cacbon graphit rỗng, hydroxyapatite.3. Vật liệu nhồi có màng mỏng: Tạo bằng cách phủ lớp mỏng lên bề mặt của vi hạt trơ, thường không rỗng. Vật liệu làm lõi có thể có bản chất như hạt silica hoặc polymer, latex. Các nhóm chức như các vị trí trao đổi ion chỉ có ở bề mặt, lõi chỉ đảm nhận làm tăng độ bền cơ học. Nhược điểm chính: lớp phủ bề mặt làm mất đi số lượng tâm tương tác làm hiệu quả liên kết giảm.Chất nhồi cột polymer: - Bền - Có thể thay đổi các đặc tính tương tác qua biến đổi hóa học trực tiếp. Có 2 dạng vật liệu polymer:1. Vi lỗ: các hạt tồn tại ở dạng gel, mỗi loại hạt có 1 độ xốp nhất định, chúng có thể trương nở hoặc co lại khi có sự thay đổi pha động, tuy nhiên có thể gây vỡ hạt, truyền khối kém, trở lực dòng chảy lớn…2. Lỗ lớn: Có nhiều liên kết ngang(>50%), gồm 1 mạng các hạt gel tiểu cầu liên kết nhau tạo thành 1 hạt lớn. Thường được dùng trong HPLC hơn dạng vi lỗ.DetectorVai trò: Nhận biết sự thay đổi nồng độ trong dung dịch ra khỏi cột và biểu hiện ở dạng tín hiệu điện.Lựa chọn detector dựa vào: bản chất, nồng độ chất tan, độ nhạy, phạm vi tuyến tính của detector, tính tương thích với dung môi và chế độ chạy của pha động ( đẳng dòng hay theo gradient) sử dụng, và cả tính kinh tế, chi phí vận hành…Các loại detector được sử dụng rộng rãi nhất : detector quang phổ khả kiến-tử ngoại,phổ huỳnh quang đo chỉ số khúc xạ phân tích điện hóaDetector đo dộ hấp thụ UV-VIS Sử dụng khi hợp chất có chứa nhóm mang màu: chất không no như ketone, hợp chất có nối đôi liên hợp, vòng thơm, một số ion vô cơ và các phức chất khác. Độ lớn của tín hiệu hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích theo định luật Beer: A= e x d x CDetector UV-VIS có 3 kiểu thiết bị khác nhau: + Bước sóng đo cố định + Bước sóng đo thay đổi được + Sử dụng mảng diodeDetector có bước sóng đo cố định:• Là kiểu thiết kế đơn giản nhất, vận hành ở bước sóng cố định.• Sử dụng 1 kính lọc để tách vạch bức xạ đơn từ nguồn bức xạ (như đèn thủy ngân…)• Dễ vận hành, không đắt tiền• Khả năng ứng dụng bị hạn chế.Detector có bước sóng thay đổi được:• Được sử dụng phổ biến nhất• Đơn giản, vận hành ở các bước sóng có thể điều chỉnh được.• Nguồn bức xạ là đèn tungsten hoặc deuterium, việc lựa chọn bức xạ được thực hiên nhờ máy đơn sắc. Detector sử dụng màng diode:• Là phương pháp hiện đại, đem lại nhiều thông tin hơn về thành phần mẫu.• Cho phép nhận biết các hợp chất có trong 1 hỗn hợp và có thể dùng để đánh giá độ tinh khiết.• Chi phí lớn.• Ở thiết bị này, toàn bộ ánh sáng từ đèn deuterium được trải thành 1 phổ trên một mảng các photodiode gắn trên 1 con chip silic. Thiết bị đo đồng thời độ hấp thụ tại tất cả các bước sóng và máy tính xử lý số liệu.Detetor huỳnh quang: Sử dụng cho các hợp chất hữu cơ có khả năng trả lại 1 phần bức xạ UV-VIS tại 1 bước sóng dài hơn: hiện tượng phát huỳnh quang, ví dụ như: vitamin trong thực phẩm, thuốc; các hydrocacbon thơm trong nước thải… Đối với những hợp chất có khả năng phát huỳnh quang thì việc đo dễ dàng. Đối với các hợp chất không có khả năng phát huỳnh quang thì ta phải biến đổi hợp chất ban đầu thành các dẫn xuất có khả năng phát huỳnh quang. Đây là phương pháp có tính chọn lọc và độ nhạy rất cao, là detector lý tưởng để phân tích lượng vết. Có giới hạn nhận biết đối với cùng 1 hợp chất nhỏ hơn 100-1000 lần so với phổ hấp thụ, dễ bị nhiễu nền do bức xạ bên ngoài.

Trích đoạn

HPLC trao đổi ion

Tài liệu liên quan

Tìm hiểu nguyên tắc hoạt động và cấu tạo của robot CleanMate 365 của hãng Metapo,USA
- 67
- 3
- 5
cấu tạo, thành phần hóa học và ứng dụng của rong biển trong các chu trình công nghệ chế biến thực phẩm
- 32
- 5
- 11
tìm hiểu nguyên tắc hoạt động và cấu tạo của thiết bị không dây có hỗ trợ hồng ngoại
- 19
- 1
- 0
Nghiên cứu về cấu tạo, nguyên lý hoạt động và các dạng hỏng hóc của tổ hợp đầu quay di động top drive Varco TDS-8SA trên giàn khoan biển
- 69
- 1
- 8
Cấu tạo, nguyên lý hoạt động và quy trình sửa chữa tổ hợp đầu quay di động Topdrive PS2-500/500 trên giàn khoan Tam Đảo-01 Vietsovpetro
- 89
- 1
- 5
Tìm hiểu cấu tạo, nguyên lý hoạt động và hiệu quả sử dụng bơm ly tâm điện chìm dùng trong khai thác dầu khí
- 83
- 1
- 10
Tài liệu Đề tài: Tìm hiểu nguyên tắc hoạt động và cấu tạo của robot CleanMate 365 của hãng Metapo,USA doc
- 68
- 959
- 0
hoạt động và ứng dụng của atm trong mạng b-isdn
- 38
- 624
- 0
báo cáo thực hành tại xưởng nghiên cứu cấu tạo nguyên lý hoạt động và chế tạo máy điện
- 22
- 709
- 2
CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG, GIẢI THÍCH HIỆN TƯỢNG CỦA LÒ VI SÓNG VÀ BẾP ĐIỆN TỪ,VẬT LIỆU SIÊU DẪN, CÁC ĐẶC TÍNH CỦA VẬT LIỆU SIÊU DẪN pot
- 9
- 3
- 29