Cấu Tạo Và Sự Nhân Lên Của Plasmid (phần 2)

(Tiếp theo phần 1) Plasmids (thường) là các phân tử DNA mạch đôi dạng vòng nằm ngoài DNA nhiễm sắc thể. Chúng thường hiện diện trong vi khuẩn, đôi khi cũng có ở sinh vật có nhân thật (eukaryote) (ví dụ như vòng 2 micrometre ở Saccharomyces cerevisiae). Chúng có kích thước khoảng từ 1 đến hơn 400 kilobase pairs (kbp). Chúng có thể hiện diện chỉ một bản sao, đối với plasmid lớn, cho tới vài trăm bản sao trong cùng một tế bào. 1. Cấu tạo của plasmid

Tất cả mọi loại plasmid của vi khuẩn đều là ADN 2 sợi khép kín tạo thành vòng tròn. Không có plasmid nào chứa ARN được tìm thấy trong vi khuẩn, mặc dù có một số plasmid của nấm hoặc một vài thực khuẩn thể có thể có thêm thành phần ARN.

Số lượng bản plasmid có trong từng loại tế bào vi khuẩn chủ thông thường thay đổi. Chúng ta cần phân biệt thế nào là bản plasmid (copy number). Một số plasmid (ví dụ plasmid F, loại sản xuất cầu tiếp hợp) chỉ có một bản duy nhất nằm trong nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn. Một số plasmid khác có phân tử lượng nhỏ hơn, thường tồn tại nhiều bản (thậm chí đến 500) trong cùng một tế bào. Trong quá trình nhân lên của tế bào (theo lối trực phân) plasmid cũng nhân lên, và cho số bản plasmid tương tự như tế bào mẹ.Hầu như tất cả các plasmid của vi khuẩn đều tồn tại dưới dạng CCC (covalently-closed circle), tức là 2 sợi ADN (sợi dương và sợi âm) được xoắn vào nhau và nối với nhau tạo thành một vòng khép kín gọi là dạng vòng đơn (circular form) (Hình 2.1). Nếu bị phân cắt ở một điểm nào đó, vòng ADN của plasmid sẽ bị duỗi thẳng, tạo nên dạng thẳng (hay còn gọi là dạng hở) (linear form). Rất nhiều ADN của plasmid phân lập từ vi khuẩn thường xoắn lại thành dây hình số 8 nhiều vòng gọi là dạng vòng xoắn (super-coiled form). Ví dụ, một loại plasmid nhỏ của E. coli (chứa 3.200 nucleotit), có phân tử lượng 2,1x106 có đến 19 vòng xoắn số 8.

Khi được ly tâm trong gradien nồng độ của đường sucrose (5% - 20%), mỗi một dạng tồn tại của plasmid có một hệ số lắng khác nhau. Trên cùng là ADN của plasmid dạng thẳng, dưới cùng là ADN plasmid dạng vòng xoắn số 8, và ở giữa là ADN plasmid dạng vòng đơn.

Phân tử lượng của plasmid cũng biến động lớn, từ 1 x 106 đến 200 x 106. Đối với vi khuẩn E. coli, ADN của plasmid chiếm khoảng 0,04% đến 8% thành phần ADN có trong tế bào vi khuẩn. Phân tử lượng của ADN của plasmid ở E. coli cao nhất, là 2,7 x 109 và có độ dài khoảng 1,3 mm.

Vòng ADN của plasmid, hay còn gọi là hệ gen của plasmid bao gồm 3 phần chính :

- Một vùng ADN gọi là phần nhân lên, là ký hiệu là ori (origin) hay còn gọi là vùng mầm, chỉ bao gồm vài trăm nucleotit và có một điểm mầm ở giữa, bao gồm 3 nucleotit. Khi nhân lên, ADN của plasmid bắt đầu ở điểm mầm này.

- Phần ADN khác lớn hơn được gọi là phần chức năng, đó là tổ hợp chứa các gen chức năng (hoặc các operons) bao gồm nhiều gen và chiếm một phần khá lớn vòng ADN của plasmid. Đó là vùng gồm nhiều gen chịu trách nhiệm sản xuất những sản phẩm cần thiết thực hiện chức năng chuyển giao ADN của plasmid (ví dụ: vùng chứa tổ hợp gen tra trong plasmid F, sản xuất sản phẩm protein tạo nên cầu tiếp hợp, nối tế bào vi khuẩn “cho” với tế bào vi khuẩn “nhận”).

- Một phần ADN khác của plasmid gọi là phần đặc hiệu, chứa một hay nhiều gen quyết định những tính chất cơ bản mà plasmid trợ giúp cho tế bào vi khuẩn chủ (như tính kháng thuốc, tính sản xuất kháng sinh, tính sản xuất độc tố v.v...). Các gen này nằm trên một phân đoạn ADN dễ tách rời khỏi hệ gen plasmid và chuyển vị trí đến nơi khác, rồi gắn vào, do vậy vùng này còn gọi là vùng chuyển vị tạo nên hiện tượng chuyển vị đã sơ bộ trình bày ở phần trước (transposon và transposition).

2. Phân lập và tách chiết ADN của plasmid

Do trong một tế bào vi khhuẩn cùng lúc có 2 hệ gen cùng tồn tại, đó là hệ gen của nhân tế bào và hệ gen của plasmid, nên việc phân lập và tách chiết ADN của plasmid làm sao không tạp lẫn với ADN của nhân tế bào là điều cần phải chú ý trước tiên.

Về nguyên tắc, ADN của plasmid được tách chiết phải thuần nhất và phải thu được với lượng nhiều nhất mà chúng ta có thể thu được. Công đoạn đầu tiên là phải phá vỡ màng tế bào, giải phóng ADN của plasmid và ADN của hệ gen của nhân. Sau đó ly tâm lấy các thành phần tế bào đã được giải phóng, trong đó có ADN hệ gen của cả nhân và plasmid. Lúc này phải tránh sao không bỏ sót plasmid và loại bỏ chúng do sơ suất. Bước tiếp theo là tách ADN khỏi các thành phần khác và cuối cùng là thu nhận ADN của plasmid riêng biệt và loại bỏ ADN của nhân tế bào.

Hình 2.1: Phân lập ADN của plasmid ColE1 qua cột lọc gradien nồng độ. Các dạng cấu trúc của plasmid có hệ số lắng khác nhau (dạng thẳng: 15S; dạng vòng đơn: 17S và dạng vòng xoắn: 20S. Khi lọc trong cột lọc gradien nồng độ của đường sucrose, chúng sẽ lắng ở các vị trí khác nhau, và theo đó người ta có thể dùng kim xuyên qua thành ống để ly trích thu nhận chúng.

Gần đây có rất nhiều phương pháp tách chiết ADN của virus và ty thể (mitochondria) được hoàn thiện, và được sử dụng cho việc tách chiết ADN của plasmid. Tất cả hệ gen của virus, plasmid và ty thể đều chứa ADN ở dạng vòng tròn. Thông thường, trong điều kiện bình thường, plasmid tồn tại trong tế bào dưới dạng vòng (covalently-closed circle (CCC)), và thường xoắn lại thành dạng vòng xoắn (super-coiled form).Về nguyên lý, quá trình phân lập và tách chiết ADN của plasmid tuần tự theo các bước sau đây:

a- Phá vỡ màng tế bào (lysis method): Có rất nhiều cách phá vỡ màng tế bào để giải phóng thành phần của chúng. Trước hết, loại hóa chất sử dụng phải là loại không gây tác hại ADN và không bẻ gãy cấu trúc vòng của ADN của plasmid. Đối với vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae (chủ yếu là E. coli), quá trình này bắt đầu bằng việc xử lí tế bào bằng hóa chất EDTA (ethylene-diamine-tetraacetic acid), kết hợp với men lyzozim phân giải vách tế bào. EDTA phá vỏ ngoài màng tế bào, tạo điều kiện cho lyzozim tiếp xúc và xâm nhập vào các thành phần trong tế bào. Một loại hóa chất khác dùng kèm theo nhằm duy trì áp suất thẩm thấu trong tế bào là muối natrium lauryl-sarkosinate, hay còn gọi là SDS.

b-Ly tâm (centrifugation): Bằng cách ly tâm, các thành phần bên trong tế bào và đại thành phần cấu trúc khác sẽ lắng xuống đáy và được loại bỏ. ADN của plasmid nằm trong phần nước trong trên được thu nhận, còn các tiểu phần tế bào, kể cả ADN của nhân (vì có trọng lượng phân tử lớn hơn) sẽ lắng xuống đáy được loại bỏ. Tuy vậy, một số đoạn gãy ADN của hệ gen nhân và một số lipo-protein phân tử lượng bé có thể còn sót lại cùng với ADN của plasmid.

c-Tách chiết và tinh khiết ADN của plasmid (plasmid DNA extraction and purification): Có nhiều cách tách ADN của plasmid thông thường tồn tại dưới dạng CCC ra khỏi huyễn dịch ly tâm đã được thu nhận như đã trình bày ở trên, trong đó phương pháp lý học và hóa học, sau đó dùng phương pháp phenol-chloroform để tinh khiết được áp dụng nhiều nhất.

Các phương pháp chung bao gồm:

Phương pháp lý học dựa trên ly tâm siêu tốc (ultra-centrifugation) trong gradien nồng độ với sự có mặt của một loại hóa chất gắn thuận nghịch với ADN (đó là: ethidium bromide) và một loại thuốc nhuộm màu vàng đỏ. ADN của plasmid lắng xuống và dễ dàng tách chiết khỏi các thành phần khác (Hình 2.1). Cụ thể quá trình này được trình bày như sau. Vì ADN của plasmid có tỷ trọng tương tự với các phân đoạn ADN của hệ gen nhân có thành phần cytosine (C) và guanine (G) tương ứng, nên chúng thường tồn tại cùng nhau, nên rất khó tách khỏi nhau bằng phương pháp ly tâm đơn thuần. Tuy nhiên, dựa vào đặc tính liên kết khác nhau của một loại hóa chất có tên gọi là ethidium bromide (EtBr) đối với ADN dạng vòng xoắn và dạng mạch thẳng, người ta dễ dàng tách biệt 2 loại ADN này. EtBr gắn vào ADN mạch vòng (dạng vòng xoắn) một cách bền vững không cho ADN mở vòng xoắn một cách dễ dàng. Trong khi đó, các phân đoạn ADN mạch hở (có nguồn gốc từ ADN của nhân) liên kết với EtBr yếu hơn, và dễ bị mở vòng xoắn hơn. Khi ly tâm siêu tốc trong gradien nồng độ của clorua cesium (CsCl2), chúng ta sẽ thu được một tầng lắng gần đáy của ống ly tâm gồm 2 lớp kề nhau. Lớp nằm phía dưới là ADN của plasmid, lớp phía trên là các thành phần ADN mạch hở khác. Nếu ly tâm trong ống nhựa, chúng ta có thể dùng kim chọc qua thành ống và thu nhận ADN của plasmid (Hình 2.1). Vì ADN của plasmid có tạp lẫn hóa chất EtBr, và các thành phần tế bào khác nên cần phải được tinh khiết. Phương pháp đơn giản nhất và thông dụng nhất là xử lý với các hợp chất hữu cơ là dùng phenol và chloroform, còn gọi là phương pháp phenol-chloroform (xem giới thiệu tiếp).

Phương pháp hóa học là phương pháp dựa trên nguyên tắc dùng hóa chất kết tủa và sau đó ly tâm loại bỏ tạp chất. Màng tế bào vi khuẩn được phá vỡ như đã trình bày. Sau khi ly tâm loại bỏ phần cặn, huyễn dịch chứa ADN của cả plasmid và của hệ gen nhân được kết tủa bằng muối axêtát, rồi ly tâm loại bỏ chất kết tủa, mà phần lớn là chứa ADN của nhân. Sau khi ly tâm một lần nữa loại bỏ cặn, phần trong phía trên được hỗn hợp với cồn tuyệt đối (ethanol absolute) theo tỷ lệ sao cho nồng độ cuối cùng của cồn là khoảng 70% (giữa 65% - 75%). Trong nồng độ này, ở nhiệt độ lạnh (4oC), ADN của plasmid sẽ bị kết tủa, và được thu nhận sau khi ly tâm siêu tốc (13.000 - 14.000 vòng/phút, trong 15-30 phút).

Phương pháp phenol-chloroform được dùng để tinh khiết ADN, loại bỏ các tạp chất lipit và protein, cũng như các thành phần khác như ethidium bromide và thuốc nhuộm. phenol và chloroform hoặc được dùng riêng biệt, hoặc được trộn lẫn vào nhau. Về nguyên tắc, phenol có tác dụng kết tủa protein, còn chloroform có tác dụng phá hủy lipid và các chất béo. Do vậy, phenol được dùng trước để kết tủa protein, sau khi ly tâm, loại thải phần đã kết tủa, thu nhận phần trong bên trên có chứa ADN, và tiếp tục dùng chloroform để phá hủy lipit và các hợp chất béo còn lại. Sau khi ly tâm một lần nữa, phần trong bên trên có chứa ADN được tinh khiết tiếp bằng cách cho kết tủa trong nồng độ cồn khoảng 70%, như đã trình bày ở trên. ADN của plasmid rất bền, có thể bảo quản hàng năm trong điều kiện lạnh âm (-20oC) để sử dụng lâu dài.

Ngày nay, ADN của plasmid được thu nhận nhanh hơn, thuận lợi hơn và tinh khiết hơn bằng các loại KIT (tức là bộ dụng cụ hỗn hợp các hóa chất tách chiết và tinh khiết ADN của plasmid), do các Công ty các chế phẩm sinh học cung cấp (ví dụ: bộ KIT có tên gọi là QIAprepâ Spin Miniprep của Hãng QIAGEN (USA) chẳng hạn).