Chương Bảy Phản ứng Kháng Nguyên-kháng Thể Và Lựa Chọn Kỹ Thuật

BỆNH NHIỄM TRÙNG

ENGLISH

MIỄN DỊCH HỌC - CHƯƠNG BẢY PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ VÀ LỰA CHỌN KỸ THUẬT

Gene Mayer, Ph.D Emertius Professor of Pathology, Microbiology and Immunology University of South Carolina

Biên dịch: Nguyễn Văn Đô, MD., PhD., Bộ môn Sinh lý bệnh-Miễn dịch, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội, Việt Nam

TURKISH

FRANCAIS

PORTUGUES

SHQIP

Let us know what you think FEEDBACK

SEARCH

SHARE BOOKMARK PRINT THIS PAGE

Logo image © Jeffrey Nelson, Rush University, Chicago, Illinois and The MicrobeLibrary

MỤC TIÊU GIẢNG DẠY

Mô tả bản chất của phản ứng kháng nguyên-kháng thể So sánh ái tính và háo tính của kháng thể

Mô tả sự đặc hiệu của kháng thể và phản ứng chéo

Thảo luận về nguyên tắc các xét nghiệm thường được sử dụng của các phản ứng kháng nguyên kháng thể

Hình 1

BẢN CHẤT CỦA PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ

Khái niệm chìa khóa và ổ khóa

Vị trí kết hợp của một kháng thể nằm ở phần Fab của phân tử và được cấu tạo từ các vùng cực kỳ thay đổi của các chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Nghiên cứu về hình ảnh tinh thể qua X-quang của tương tác kháng nguyên-kháng thể cho thấy quyết định kháng nguyên nép vào một cái khe được hình thành bởi các vị trí kết hợp của kháng thể như minh họa trong Hình 1. Như vậy, khái niệm của chúng ta về phản ứng kháng nguyên-kháng thể là chìa khóa (tức là kháng nguyên) phù hợp với ổ khóa (ví dụ như các kháng thể).

Liên kết không đồng hóa trị

Tất cả các liên kết để giữ các kháng nguyên vào các vị trí kết hợp kháng thể đều có bản chất là liên kết không đồng hóa trị. Chúng bao gồm liên kết hydro, liên kết điện, lực Van der Waals và liên kết kỵ nước. Đa liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể làm cho các kháng nguyên liên kết chặt chẽ với các kháng thể. Tính thuận nghịch

Vì phản ứng kháng nguyên-kháng thể được thực hiện bởi các liên kết không đồng hóa trị nên nó có tính chất thuận nghịch.

TỪ KHÓA Ái tính Háo tính Đặc hiệu Phản ứng chéo Sự ngưng kết Ngưng kết hồng cầu Ngưng kết tố Hiệu giá Tiền vùng Ngưng kết hồng cầu thụ động Xét nghiệm Coomb trực tiếp Xét nghiệm Coomb gián tiếp Ngăn ngưng kết hồng cầu Điểm tương đương Dư thừa kháng thể Dư thừa kháng nguyên Khuếch tán miễn dịch hình tròn Điện di miễn dịch Điện di miễn dịch ngược dòng Miễn dịch phóng xạ Xét nghiệm miễn dịch liên kết enzym RIA/ELISA cạnh tranh RIA/ELISA không cạnh tranh Miễn dịch huỳnh quang Đếm tế bào dòng chảy Cố định bổ thể

Hình 2

Hình 3

Hình 4

Hình 5

Ái tính

Ái tính của kháng thể là lực liên kết của phản ứng giữa một quyết định kháng nguyên và một vị trí kết hợp trên kháng thể. Nó là tổng hợp của các lực hút và lực đẩy được tạo ra giữa một quyết định kháng nguyên và vị trí kết hợp kháng thể như minh họa trong Hình 2. Ái tính là hằng định, mô tả phản ứng kháng nguyên-kháng thể được minh họa trong Hình 3. Hầu hết các kháng thể có ái tính cao đối với kháng nguyên của chúng.

Háo tính

Háo tính là tổng lực liên kết của một kháng nguyên mà có nhiều quyết định kháng nguyên với kháng thể đa hóa trị. Háo tính chịu ảnh hưởng bởi cả hóa trị của kháng thể và kháng nguyên. Háo tính lớn hơn tổng các ái tính riêng rẽ. Điều đó được minh họa trong Hình 4. Xin nhắc lại, ái tính là lực liên kết giữa một quyết kháng nguyên và một vị trí kết hợp kháng thể riêng biệt trong khi đó háo tính là tổng lực liên liên kết của các kháng nguyên và kháng thể đa hóa trị.

TÍNH ĐẶC HIỆU VÀ PHẢN ỨNG CHÉO

Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu là khả năng của một vị trí kết hợp kháng thể phản ứng với chỉ một quyết định kháng nguyên hoặc khả năng của một tập hợp các phân tử kháng thể phản ứng với chỉ một loại kháng nguyên. Nói chung, phản ứng kháng nguyên-kháng thể có tính đặc hiệu cao. Kháng thể có thể phân biệt sự khác nhau ở:

• Cấu trúc nguyên phát của một kháng nguyên
• Các loại đồng phân của một kháng nguyên
• Cấu trúc bậc hai và bậc ba của một kháng nguyên

Phản ứng chéo

Phản ứng chéo là khả năng một vị trí kết hợp kháng thể phản ứng với hơn một quyết định kháng nguyên hoặc là khả năng của một tập hợp các phân tử kháng thể phản ứng với hơn một loại kháng nguyên. Hình 5 minh họa các phản ứng chéo xảy ra như thế nào. Phản ứng chéo sinh ra do kháng nguyên có một epitop chung với các kháng nguyên gây miễn dịch hoặc nó có một epitop có cấu trúc tương tự như một epitop trong trong kháng nguyên gây miễn dịch (đa đặc hiệu).

CÁC KỸ THUẬT PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ

Các yếu tố ảnh hưởng đến đo lường phản ứng kháng nguyên-kháng thể

Chỉ có một cách để biết một phản ứng kháng nguyên-kháng thể đã xảy ra là phát hiện các phức hợp kháng nguyên-kháng thể hình thành bằng phương pháp trực tiếp hay gián tiếp. Việc phát hiện phản ứng kháng nguyên-kháng thể phụ thuộc vào một số yếu tố.

Ái tính

Ái tính của kháng thể với kháng nguyên càng cao thì sự tương tác giữa chúng càng ổn định. Háo tính

Phản ứng giữa các kháng nguyên và kháng thể đa hóa trị là ổn định hơn và do đó dễ phát hiện hơn.

Tỷ lệ của kháng nguyên với kháng thể

Tỷ lệ giữa kháng nguyên và kháng thể ảnh hưởng đến sự phát hiện phức hợp kháng nguyên-kháng thể bởi vì kích thước của các phức hợp được hình thành có liên quan đến nồng độ kháng nguyên và kháng thể. Điều này được mô tả trong Hình 6. Hình dáng vật lý của kháng nguyên

Hình dáng vật lý của kháng nguyên ảnh hưởng đến việc làm thế nào người ta phát hiện phản ứng của nó với một kháng thể. Nếu kháng nguyên là một hạt, nói chung người ta thiên về sử dụng phản ứng ngưng kết kháng nguyên bởi kháng thể. Nếu là kháng nguyên hòa tan, thường dùng phản ứng kết tủa của kháng nguyên sau khi tạo ra nhiều phức hợp kháng nguyên-kháng thể không hòa tan.

Kỹ thuật ngưng kết

Sự ngưng kết

Khi kháng nguyên ở dạng hạt, phản ứng của một kháng thể với kháng nguyên có thể được phát hiện bởi sự ngưng kết (vón cục) của kháng nguyên. Thuật ngữ ngưng kết được sử dụng để mô tả các kháng thể ngưng kết với các kháng nguyên dạng hạt. Khi kháng nguyên là một hồng cầu thì thuật ngữ ngưng kết hồng cầu được sử dụng. Về mặt lý thuyết tất cả các kháng thể có thể làm ngưng kết các kháng nguyên dạng hạt nhưng IgM, một loại kháng thể đa hóa trị và là loại kháng thể làm ngưng kết tốt và đôi khi người ta cho rằng đó là một kháng thể IgM nếu là kháng thể ngưng kết tốt. Ngưng kết định tính

Kỹ thuật ngưng kết có thể được sử dụng ở dạng định tính để tìm sự hiện diện của một kháng nguyên hoặc kháng thể. kháng thể được trộn với các kháng nguyên hạt và khi các hạt ngưng kết thì gọi kết quả là dương tính (Hình 7).

Ví dụ, hồng cầu của một bệnh nhân được trộn với kháng thể của một kháng nguyên nhóm máu để xác định nhóm máu của một người. Trong ví dụ thứ hai, huyết thanh của bệnh nhân được trộn với các tế bào hồng cầu của một người đã biết nhóm máu để tìm sự có mặt của kháng thể chống nhóm máu đó trong huyết thanh của bệnh nhân.

Ngưng kết định lượng Kỹ thuật ngưng kết cũng có thể được sử dụng để đo lường mức độ kháng thể liên kết với các kháng nguyên hạt. Trong thử nghiệm này, pha loãng mẫu cần xác định kháng thể theo một bậc nhất định và sau đó cho một lượng hồng cầu hoặc vi khuẩn hoặc các kháng nguyên khác vào các mẫu trên. Sau đó, xác định sự ngưng kết ở nồng độ pha loãng tối đa. Ở độ pha loãng tối đa mà vẫn nhìn thấy được sự ngưng kết thì gọi là hiệu giá. Các kết quả được ghi nhận khi đối chiếu các pha loãng tối đa cho phép nhìn thấy ngưng kết. Hình 8 minh họa một xét nghiệm ngưng kết hồng cầu định lượng.

Hiệu ứng tiền vùng (prozone) - Thỉnh thoảng, người ta quan sát thấy khi nồng độ kháng thể cao (tức là dung dịch pha loãng thấp hơn) thì không có ngưng kết và sau đó mẫu được pha loãng ngưng kết mới xảy ra (Xem bệnh nhân 6 trong Hình 8). Việc không ngưng kết ở nồng độ cao của các kháng thể được gọi là hiệu ứng prozone. Thiếu ngưng kết trong prozone là do dư thừa kháng thể làm tạo ra một phức hợp rất nhỏ mà không tạo thành ngưng kết lớn nhìn thấy được.

Các ứng dụng của kỹ thuật ngưng kết

i. Xác định nhóm máu hoặc kháng thể chống kháng nguyên nhóm máu. ii. Để đánh giá nhiễm khuẩn

Ví dụ: Sự tăng hiệu giá của một kháng thể với một loại vi khuẩn đó. Chú ý: Thường dùng độ pha loãng bậc 4 để xác định hiệu giá kháng thể.

Cân nhắc thực tế Mặc dù kỹ thuật rất dễ thực hiện, nhưng nó chỉ là bán định lượng.

Ngưng kết hồng cầu thụ động

Kỹ thuật ngưng kết chỉ được thực hiện với các kháng nguyên hạt. Tuy nhiên, có thể bao phủ hồng cầu với một kháng nguyên hòa tan (ví dụ như kháng nguyên của virút, một polysaccharid hoặc một hapten) và sử dụng các tế bào hồng cầu bao phủ đó cho một thử nghiệm ngưng kết của kháng thể với kháng nguyên hòa tan (Hình 9). Kỹ thuật này được gọi là ngưng kết hồng cầu thụ động. Kỹ thuật này được thực hiện giống như các kỹ thuật ngưng kết. Các ứng dụng bao gồm phát hiện kháng thể chống các kháng nguyên hòa tan và kháng nguyên của virút.

Kỹ thuật Coomb (kháng thể kháng kháng thể)

Kỹ thuật Coomb trực tiếp Khi kháng thể liên kết với hồng cầu, không phải lúc nào cũng có ngưng kết. Điều này có thể là kết quả của tỉ lệ các kháng nguyên và kháng thể chưa phù hợp, dẫn đến thừa kháng nguyên hoặc thừa kháng thể hoặc trong một số trường hợp sự tích điện trên hồng cầu làm cản trở liên kết của các tế bào. Các kháng thể liên kết nhưng không gây ra ngưng kết hồng cầu đôi khi được gọi là kháng thể không đầy đủ. Không có cách nào để chỉ ra rằng các kháng thể khác nhau về cấu trúc, mặc dù điều này đã từng được cho là một trường hợp đặc biệt. Đúng hơn, nó chỉ là một định nghĩa chức năng. Để phát hiện sự hiện diện của kháng thể không gây ngưng kết trên tế bào hồng cầu, chỉ đơn giản là thêm một kháng thể thứ hai chống lại các kháng thể đã phủ trên các hồng cầu. Kháng thể kháng kháng thể có thể liên kết các hồng cầu và kết quả là tạo ra ngưng kết. Thử nghiệm này được minh họa trong Hình 10 và được gọi là kỹ thuật Coomb trực tiếp.

Kỹ thuật Coomb gián tiếp

Kỹ thuật Coomb gián tiếp dùng để tìm xem một mẫu huyết thanh có kháng thể chống lại một loại hồng cầu đặc biệt và kỹ thuật này cũng xác định các kháng thể tiềm năng chưa làm ngưng kết trong mẫu cần tìm (Hình 11). Xét nghiệm này được thực hiện bởi ủ tế bào hồng cầu với mẫu huyết thanh, rửa để loại bỏ bất cứ kháng thể không liên kết và sau đó thêm một kháng thể thứ 2 chống kháng thể trên để tạo liên kết các tế bào. Ứng dụng

Các ứng dụng bao gồm phát hiện các yếu tố chống kháng thể Rh. Kháng thể chống yếu tố Rh thường không làm ngưng kết hồng cầu. Vì vậy, các hồng cầu Rh + của trẻ em được sinh ra từ người mẹ có Rh- (những người có kháng thể chống Rh) có thể được phủ với các kháng thể này. Để kiểm tra điều này, cần sử dụng kỹ thuật Coomb trực tiếp. Để biết xem người mẹ có kháng thể chống Rh trong huyết thanh của mình thì dùng kỹ thuật Coomb gián tiếp.

Ức chế ngưng kết hồng cầu

Kỹ thuật ngưng kết có thể được sửa chữa và dùng để xác định kháng nguyên hòa tan. Kỹ thuật này được gọi là ức chế ngưng kết hồng cầu. Nó được gọi là ức chế ngưng kết hồng cầu vì người ta đo khả năng kháng nguyên hòa tan ức chế sự ngưng kết hồng cầu đã phủ kháng nguyên bởi các kháng thể. Trong kỹ thuật này, một lượng kháng thể hằng định đã biết đối với một kháng nguyên cần tìm được trộn với một lượng hồng cầu nhất định đã phủ kháng nguyên (xem kỹ thuật ngưng kết hồng cầu ở trên). Cho vào hỗn hợp đó các lượng mẫu khác nhau của kháng nguyên cần tìm. Nếu mẫu có chứa kháng nguyên hòa tan, chúng sẽ cạnh tranh với các kháng nguyên phủ trên các tế bào hồng cầu để kết hợp với các kháng thể, do đó ức chế sự ngưng kết của các hồng cầu như minh họa trong Hình 12.

Bằng cách tuần tự pha loãng mẫu, người ta có thể định lượng kháng nguyên trong mẫu cần tìm bằng cách hiệu giá của nó. Kỹ thuật này thường được sử dụng để định lượng kháng nguyên hòa tan và cũng là kỹ thuật cần cân nhắc sử dụng trong thực tế giống như các kỹ thuật ngưng kết.

Các kỹ thuật tủa

Miễn dịch khuếch tán hình vòng tròn (Mancini)

Trong miễn dịch khuếch tán hình vòng tròn kháng thể được trộn trong gel thạch với một lượng kháng thể cố định. Cho dung dịch chứa kháng nguyên đã pha loãng ở các nồng độ khác nhau vào các lỗ trong gel thạch. Khi kháng nguyên khuếch tán vào gel, nó phản ứng với kháng thể, và khi đạt được điểm tương đương thì một vòng kết tủa được hình thành như minh họa trong Hình 13.

Đường kính của vòng tủa tỷ lệ với log của các nồng độ kháng nguyên vì lượng kháng thể là không đổi. Như vậy, bằng cách dùng nồng độ khác nhau của một kháng nguyên chuẩn, người ta có thể tạo ra được một đương chuẩn mà từ đó có thể định lượng được kháng nguyên trong mẫu cần tìm. Vì thế, đây là một kỹ thuật định lượng. Nếu có hơn một vòng xuất hiện có nghĩa là có hơn một kháng nguyên hoặc hơn một kháng thể đã phản ứng. Điều đó có thể là do một hỗn hợp của kháng nguyên hoặc kháng thể. Xét nghiệm này thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm lâm sàng để xác định nồng độ kháng thể trong các mẫu của bệnh nhân.

Điện di miễn dịch

Trong điện di miễn dịch, một hỗn hợp kháng nguyên được đặt trong một cái giếng đục lỗ của một gel thạch và kháng nguyên được điện di và chúng được tách ra theo điện tích của chúng. Sau khi điện di, người ta tạo một rãnh trong gel thạch để cho kháng thể vào. Khi các kháng thể khuếch tán vào thạch, một đường tủa xuất hiện tại vùng tương đương nơi phản ứng giữa một kháng nguyên và một kháng thể được minh họa trong Hình 14.

Kỹ thuật này được sử dụng để phân tích định tính một hỗn hợp kháng nguyên, tuy nhiên nó có thể dùng để định lượng thô (độ dày của đường tủa). Kỹ thuật này thường được sử dụng để phân tích các thành phần trong huyết thanh của bệnh nhân. Huyết thanh được đặt trong giếng và kháng thể kháng toàn bộ huyết thanh thì đặt ở trong rãnh. Bằng cách so sánh với huyết thanh bình thường, người ta có thể xác định xem có thiếu một hoặc nhiều thành phần trong huyết thanh hoặc dư thừa một số thành phần trong huyết thanh (độ dày của các đường tủa). Kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết của các protein huyết thanh đã được chiết tách.

Điện di ngược dòng

Trong kỹ thuật này các kháng nguyên và kháng thể được đặt trong giếng đục lỗ trên một gel thạch; các kháng nguyên và kháng thể được di chuyển từ 2 phía trong điện trường và chúng tạo thành một đường tủa khi gặp nhau được minh họa trong Hình 15. Kỹ thuật này chỉ được thực hiện trong điều kiện kháng nguyên và kháng thể có điện tích trái dấu. Đây là kỹ thuật định tính, tuy nhiên người ta có thể định lượng được từ độ dày của đường tủa. Ưu điểm chính của kỹ thuật là cho kết quả nhanh.

Hình 17

Miễn dịch phóng xạ (RIA) / Miễn dịch liên kết enzym (ELISA)

Miễn dịch phóng xạ (RIA) là kỹ thuật dựa trên các phép đo phóng xạ được liên kết với phức hợp miễn dịch. Trong bất kỳ kỹ thuật nào, phóng xạ có thể được đánh dấu ở kháng nguyên hay kháng thể. Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym (ELISA) là những kỹ thuật dựa trên việc đo lường một phản ứng enzym gắn với phức hợp miễn dịch. Trong bất kỳ xét nghiệm cụ thể nào, các enzym này có thể được liên kết với các kháng nguyên hoặc kháng thể.

Kỹ thuật RIA/ELISA cạnh tranh để phát hiện kháng nguyên

Phương pháp và nguyên lý của RIA và ELISA để xác định kháng nguyên được thể hiện trong Hình 16. Bằng cách sử dụng số lượng kháng nguyên chuẩn không đánh dấu, người ta có thể tạo ra một đường cong tương quan phóng xạ chuẩn (cpm) (Enzym) liên kết với kháng nguyên. Từ đường cong chuẩn này, người ta có thể xác định được lượng kháng nguyên trong một mẫu chưa biết.

Điểm cốt lõi của kỹ thuật là tách được phức hợp miễn dịch từ phần còn lại của hỗn hợp. Kỹ thuật này đã được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau và là cơ sở đặt tên cho kỹ thuật:

Kết tủa với sulfat amon

Sulfat amon (nồng độ cuối cùng 33 - 50%) sẽ làm kết tủa kháng thể nhưng không làm tủa nhiều loại kháng nguyên. Vì vậy, nó có thể được sử dụng để tách phức hợp miễn dịch của kháng nguyên ra khỏi kháng nguyên tự do. Kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật Farr Kháng thể chống kháng thể

Thêm một kháng thể thứ hai chống lại các kháng thể thứ nhất có thể dẫn đến các kết tủa của các phức hợp miễn dịch và do đó tách được phức hợp miễn dịch ra khỏi các kháng nguyên tự do. Cố định kháng thể

Các kháng thể có thể được cố định vào bề mặt của một hạt nhựa hoặc phủ lên bề mặt của một bản nhựa và do đó phức hợp miễn dịch có thể được tách ra dễ dàng từ các thành phần khác bằng cách rửa các hạt hoặc các bản nhựa (Hình 17). Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay và được gọi là RIA hoặc ELISA pha rắn. Ở phòng thí nghiệm lâm sàng, RIA và ELISA cạnh tranh thường được sử dụng để định lượng protein huyết thanh, hocmon, chất chuyển hóa của thuốc.

TUTORIAL ELIZA ASSAY HHMI Requires Flash

Hình 19

Kỹ thuật ELISA/RIA không cạnh tranh xác định kháng nguyên hoặc kháng thể

RIA và ELISA không cạnh tranh cũng được sử dụng để xác định kháng nguyên và kháng thể. Trong Hình 18, hạt được phủ với kháng nguyên và được sử dụng để phát hiện kháng thể trong mẫu chưa biết. Lượng kháng thể thứ hai đánh dấu có liên quan đến lượng kháng thể trong mẫu chưa biết. Kỹ thuật này thường được sử dụng để đo kháng thể lớp IgE đã kết hợp với các chất gây dị ứng đặc biệt bằng cách sử dụng một chất gây dị ứng đã biết như là một kháng nguyên và kháng thể chống IgE như là một thuốc thử đánh dấu. Kỹ thuật này được gọi là RAST (radioallergosorbent test). Trong Hình 19, hạt được phủ kháng thể và được sử dụng để xác định một kháng nguyên chưa biết. Lượng kháng thể thứ hai được đánh dấu kết hợp với phần kháng nguyên đã liên kết với kháng thể đầu tiên.

Các kỹ thuật với kháng nguyên tế bào

Miễn dịch huỳnh quang

Miễn dịch huỳnh quang là một kỹ thuật, trong đó kháng thể được gắn với một phân tử huỳnh quang (fluorescein hoặc Rhodamin hoặc một trong nhiều thuốc nhuộm huỳnh quang khác) được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên ở trong hoặc trên bề mặt tế bào hoặc mô bởi chất huỳnh quang phát ra từ các kháng thể đã kết hợp với kháng nguyên. Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

Trong miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, các kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên được gắn trực tiếp với fluorochrome (Hình 20).

Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Trong miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, các kháng thể đặc hiệu đối với kháng nguyên không được đánh dấu mà kháng thể thứ 2 chống lại kháng thể thứ nhất được gắn với fluorochrome (Hình 21). Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp nhạy hơn so với miễn dịch huỳnh quang trực tiếp do có khuếch đại các tín hiệu.

Đếm tế bào dòng chảy Đếm tế bào dòng chảy thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm lâm sàng để xác định và đếm các tế bào mang kháng nguyên đặc biệt. Các tế bào trong dịch lỏng được đánh dấu với một chất huỳnh quang bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp hoặc gián tiếp. Các tế bào này sau đó được phân tích trên máy đếm tế bào dòng chảy.

Hình 22 minh hoạ các nguyên tắc đếm tế bào dòng chảy. Trong buồng đếm tế bào dòng chảy, từng tế bào đi ra và được chiếu sáng bằng chùm tia laser. Lượng ánh sáng laser được tán xạ từ các tế bào khi chúng đi qua tia laser có thể đo được, và cho chúng ta các thông tin liên quan đến kích thước của các tế bào. Ngoài ra, tia laser có thể kích thích fluorochrome trên các tế bào và ánh sáng huỳnh quang phát ra bởi các tế bào có thể được đo bằng một hoặc nhiều đầu dò.

Dữ liệu thu được từ buồng đếm tế bào dòng chảy được thể hiện trong Hình 23. Trong biểu đồ một tham số, lượng huỳnh quang tăng lên (ví dụ huỳnh quang màu xanh lá cây) được thể hiện trên trục x và số lượng tế bào tham gia biểu thị lượng huỳnh quang được thể hiện trên trục y. Các nhóm tế bào có huỳnh quang có thể được xác định bằng cách tích hợp ở vùng phía dưới đường cong. Trong một biểu đồ hai tham số, trục x là một tham số (ví dụ huỳnh quang màu đỏ) và trục y là tham số thứ hai (ví dụ huỳnh quang màu xanh lá cây). Số lượng tế bào được biểu thị bởi đường viền và cường độ của màu sắc.

PowerPoint animation of figure 24 of this figure

Cố định bổ thể

Phức hợp kháng nguyên-kháng thể cũng có thể được đo bằng khả năng hoạt hoát bổ thể của chúng bởi vì phức hợp này sẽ "tiêu thụ" bổ thể nếu nó có mặt, trong khi đó kháng nguyên hoặc kháng thể tự do thì không hoạt hóa bổ thể. Kỹ thuật về phức hợp kháng nguyên-kháng thể dựa vào việc tiêu thụ bổ thể được gọi là kỹ thuật cố định bổ thể để định lượng phản ứng kháng nguyên kháng thể. Kỹ thuật này chỉ được thực hiện với các kháng thể hoạt hóa bổ thể (IgG và IgM là loại tốt nhất).

Nguyên lý của kỹ thuật hoạt hóa bổ thể được minh họa trong Hình 24. Kháng nguyên được trộn với huyết thanh cần tìm kháng thể và phức hợp kháng nguyên - kháng thể được hình thành. Một ống làm chứng không có kháng nguyên cũng được chuẩn bị. Nếu không có phức hợp kháng nguyên -kháng thể có mặt trong ống nghiệm, bổ thể sẽ không được hoạt hóa. Tuy nhiên, nếu phức hợp kháng nguyên -kháng thể có mặt, chúng sẽ hoạt hóa bổ thể và do đó làm giảm lượng bổ thể trong ống nghiệm. Sau khi bổ thể được hoạt hóa bởi bất kỳ phức hợp kháng nguyên-kháng thể nào, một lượng hồng cầu chuẩn đã được phủ kháng thể kháng hồng cầu được thêm vào. Số lượng hồng cầu phủ kháng thể được định trước sao cho vừa đủ để tiêu thụ hết các bổ thể đưa vào lúc ban đầu nếu chúng vẫn còn. Nếu tất cả bổ thể vẫn còn (tức là phức hợp kháng nguyên-kháng thể không hình thành), tất cả các hồng cầu sẽ bị ly giải. Nếu phức hợp kháng nguyên- kháng thể được hình thành, một số bổ thể sẽ bị tiêu thụ và do đó không phải tất cả hồng cầu được thêm vào bị ly giải. Vì thế chỉ cần đo lượng hồng cầu bị ly giải bằng cách đo sự giải phóng hemoglobin vào môi trường, qua đó gián tiếp định lượng phức hợp kháng nguyên-kháng thể trong ống nghiệm. Kỹ thuật cố định bổ thể được sử dụng phổ biến nhất để tìm kháng thể trong một mẫu thử nghiệm, nhưng chúng có thể được sửa đổi để đo kháng nguyên.

Trở về phần Miễn dịch của Vi khuẩn học và Miễn dịch học online