Điện DI GEL AGAROSE Và ứng Dụng - Tài Liệu Text - 123doc

Tải bản đầy đủ (.doc) (19 trang)

1. Trang chủ
>>
2. Kỹ Thuật - Công Nghệ
>>
3. Điện - Điện tử

Điện DI GEL AGAROSE và ứng dụng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (812.79 KB, 19 trang )

EBOOKBKMT.COMTRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌCNHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌCBài báo cáo:ĐIỆN DI GEL AGAROSE VÀ ỨNG DỤNGGiảng viên:TS Võ Minh TríDanh sách nhóm:Phan Duy LuânMSSV: 0853010470Đoàn Thị Thiên Trang MSSV: 0853010961TP Hồ Chí Minh, ngày 28, tháng 10, năm 20101EBOOKBKMT.COMMỤC LỤCI. GIỚI THIỆU CHUNG1.Điện di2. Phân loại3. Nguyên tắc thực hiệnII. ĐIỆN DI TRÊN AGAROSE GEL1.Giới thiệu về agarose2. Agarose gel3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel3.1. Kích thước của phân tử3.2. Nồng độ agarose3.3. Cấu hình của DNA4.Thành phần thực hiện điện di4.1. Agarose4.2. Lược4.3. Khuôn gel4.4. Máy điện di5. Phương pháp điện di agarose gel5.1. Đệm pH5.2. Chuẩn bị agarose gel5.3. Nhuộm DNA trong agarose gel5.4. Thu hồi DNA từ agarose gel5.4.1. Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting temperature)5.4.2. Ly tâm5.4.4. Dùng hạt thủy tinh5.4.3. Điện di vào bẫy6. Các bước thực hiện6.1. Chuẩn bị gel agarose6.2. Tiến hành điện di6.3. Nhuộm DNA bằng EtBr6.4. Kiểm tra băng ANDIII.ỨNG DỤNG2EBOOKBKMT.COM1. Những trường hợp sử dụng điện di gel agarose2.Tinh sạch và thu nhận mẫu3. Định tính và định lượng thô nucleic acid4. Một số ví dụI. GIỚI THIỆU CHUNG1.Điện di:- Là hiện tượng dịch chuyển các vật thể mang điện tích dưới tác động của điệntrường. Sự dịch chuyển này do phần lực điện trong lực Lorentz. Điện di trên gel (gelelectrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử DNA, RNA, Protein dựa trên các đặcđiểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng tích (isoelecticpoint). Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điệntrường đều. Một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chấtchất nhuộm khác nhau (ethumdromide, xanh coomassie, bạc…) để phát hiện vị trí cácphân tử gel sau khi điện di.- Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tửđặc biệt là các protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước khối lượng, điện tíchvà cấu hình của chúng.- Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyểnhướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Ngược vớiprotein, loại phân tử có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, các nucleic acid có mộtđiện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình, và vì thế chỉ dịch chuyểnhướng đến cực dương.- Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ(support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamidegel. Trong đó gel của agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất. Thôngthường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp (loading) mẫu.Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và mộtvài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi tương đối.2. Phân loạiGel được cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử được liên kết chéo với nhau tạo thành mộthệ thống mạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phântử và phản ứng tạo liên kết chéo. Các kiểu điện di: Điện di trên gel agarose: khả năng phân tách gel 50bp – 20kb Điện di trên gel polyacrylamide : khả năng phân tách gel 5bp – 1kb Ngoài ra còn điện di trong trường xung (PFGE _ Pulse Field GelElectrophonesic)3EBOOKBKMT.COM3. Nguyên tắc thực hiện- Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tửtích điện và kích thướt lỗ của thể nền (gel).- Các phân tử âm hay dương trong một điện trường sẽ di chuyển trong gel với vận tốckhác nhau nhờ vào sự khác nhau của: Lực điện trường tác động lên chúng(nếu các phân tử tích điện khác nhau) Kích thước của phân tử so với kích thước của lỗ gel Hình dạng, độ cồng kềnh của phân tửII. ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE1.Giới thiệu về agarose- Agarose (polysaccharide) có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da là một trong haithành phần chính của agarose chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếmkhoảng 30%. Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốcxen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose. Agarose gel là một chất trongsuốt (transparent) hoặc trong mờ (transluent) giống như agar, được tạo thành khi hỗnhợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100 oC và sau đó đượclàm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45 oC. Agarose gel được ứng dụng rộng rãiđể làm giá thể cho các nucleic acid trong kỹ thuật điện di ngang (horizontalelectrophoresis) hoặc làm giá thể cho môi trường nuôi cấy bacteriophage (topagarose).- Agarose được tách ra ở dạng thạch từ một số loài biển đỏ tảo, hoặc rong biển , đượctìm thấy tại California và miền đông châu Á. Agar, một thuật ngữ có nguồn gốc từ chữthạch agar-Malay, có nghĩa là sữa ong chúa, là thường bắt nguồn từ các chi Gelidiumrong biển. Nó bao gồm cả phân tử agarose và agaropectin và cung cấp hỗ trợ cho cácthành tế bào trong tảo biển.Agar được sử dụng như một chất làm đặc thức ăn, giốngnhư gelatin, hoặc một phương tiện cho vi khuẩn phát triển, nấm, hoặc các vi sinh vậtkhác.4EBOOKBKMT.COMHình : Cấu trúc phân tử củaagarose. Đơn vị agarobiose (ví dụ: hai phân tử đường) là một monomer trongagarose polymer. Có khoảng 400 monomer trên một chuỗi polymer.2. Agarose gel- Agarose gel là một loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thườngdùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0.5 – 20 kb. Gel được đổtrên một giá thể nằm ngang và được điện di được thực hiện theo phương nằm ngang.- Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi dichuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế vàcường độ thích hợp. Kỹ thuật này đơn giản và thực hiện nhanh. Hơn nữa, vị trí củaDNA trong gel được xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel được nhuộm ở nồngđộ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) và có thể phát hiệndưới ánh sáng tử ngoại (ultraviolet-UV).- Mặt khác, để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel agarose,người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (monocular weigth marker– MWN). Đó là một trình tự DNA có kích thước đã biết (thang DAN – DNA ladder),thông thường người ta sử dụng thang DNA là thực thể  được thủy giải bởi enzymegiới hạn HindIII5EBOOKBKMT.COM3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel3.1. Kích thước của phân tửCác phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các tốc độ tỷ lệ nghịch vớihàm log10 của khối lượng phân tử của chúng. Do đó, các phân tử DNA có kích thướccàng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm.3.2. Nồng độ agaroseĐoạn DNA mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau quacác bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.Như vậy, dùng gel ở các nồng độ khác nhau có thể phân tách được các đoạn DNA cókích thước khác nhau). Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn DNAnhỏ, trong khi đó nồng độ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn DNA lớn hơn.Bảng: Các thông số điện di DNA bằng agarose gel3.3. Cấu hình của DNACác DNA dạng vòng đóng (form-I), vòng đứt (form-II) và mạch thẳng (form-III) cócùng một khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau.Nhìn chung, DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA củaplasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng. Hầu hết plasmid mạch vòng chứa ítnhất hai dạng DNA có cấu trúc không gian khác nhau là dạng vòng đóng (siêu xoắn)và vòng đứt.4.Thành phần thực hiện điện di4.1. AgaroseAgarose là dẫn xuất polysaccharide từ agar (thạch) có độ tinh khiết cao. Có rất nhiềuloại agarose khác nhau về độ điện môi, nhiệt độ nóng chảy, độ trong, độ cứng. agarose6EBOOKBKMT.COMthường được cung cấp dưới dạng bột khô. Khi cho vào đệm sôi nó sẽ tan và giữ đượctrạng thái lỏng cho đến khi tạo gel khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 40°C. Khi đã đônggel ổn định ở nhiệt độ thấp hơn. Kích thước mạng lưới và đặc tính sàn lọc phụ thuộcvào nồng độ agarose trong gel. Nồng độ càng cao, mạng lưới càng nhỏ. Nồng độ thíchhợp là 0,4% đến 4%.4.2. LượcDùng để tạo ra các giếng trong bản gel4.3. Khuôn gel:Nơi đổ gel lênHình: Thành phần thực hiện điện di4.4. Máy điện di- Buồng đệm được tạo nên bằng cách tách hai bản kính giữa hai thanh spacer (tạo bềdày) ở hai đầu, sau đó trám các đầu và đáy gel để tạo buồng kín (H. 1.4). Gel bản cókích thước từ 2,5 cm2 (giữa hai lamen của kính hiển vi) đến 30.15 cm2 và độ dày từ<0,05 mm đến > 10 mm.- Điện cực.- Máy điện di7EBOOKBKMT.COMHình ảnh về thiết bị điện di agarose5. Phương pháp điện di agarose gel5.1. Đệm pHMột số đệm điện di thích hợp cho DNA sợi đôi thường được dùng là Tris-acetateEDTA (TAE), Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độkhoảng 50 mM và pH 7,5-7,8. Thường do thói quen, TAE được sử dụng nhiều nhất,nhưng khả năng đệm của nó lại thấp. Đệm TBE và TPE đều có khả năng hòa tan tốtcác đoạn DNA và có khả năng đệm cao hơn một cách rõ rệt. Các đoạn DNA sẽ dịchchuyển với các tốc độ hơi khác nhau một chút trong ba loại đệm trên do sự khác nhauvề cường lực ion của đệm. Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cungcấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn (conductivity). Nếu chúng ta dùng nước thay vì làđệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có sự dịch chuyển cần thiết của DNA tronggel. Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ: dung dịch stock ×10), thìnhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm nóng chảy nó.5.2. Chuẩn bị agarose gelCó nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di, loại agarose dùng tốt nhấttrong thí nghiệm là type-II-agarose có nội thẩm thấu thấp (low-endo-osmotic). Nó dêdàng chảy ra và tạo thành một dung dịch trong suốt, kết quả là gel đàn hồi thậm chí ởcác nồng độ thấp. Tuy nhiên, type-II-agarose dê bị bẩn bởi sulphate polysaccharides8EBOOKBKMT.COM(SP), hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase, polymerase và RE. Vì thế, cácđoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được làm sạch cẩn thận trước khi chúngđược dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất cho các enzyme này.5.3. Nhuộm DNA trong agarose gelPhương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộmhuỳnh quang EtBr. EtBr được dùng để phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn. Tuynhiên, ái lực (affinity) của thuốc nhuộm đối với nucleic acid sợi đơn là tương đối thấpvà có hiệu suất huỳnh quang không cao. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa cácbase của nucleic acid và cho phép phát hiện dê dàng chúng ở trong gel. Mặc dù tínhlinh động điện di của DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng15%), nhưng khả năng xác định gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suốt quá trìnhđiện di hoặc ở giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt. Tuy nhiên, nếu cần có thể chạy điện digel không có EtBr và chỉ nhuộm DNA hoặc RNA sau khi điện di xong. 45Gel đượcngâm trong đệm điện di hoặc H2O chứa EtBr (0,5 phút ở nhiệt độ phòng).Chú ý : Ethidium bromide là một tác nhân gây đột biến mạnh, chất độc gây ung thư,vì vậy cần luôn luôn đeo găng tay khi cầm gel hoặc dung dịch chứa thuốcnhuộm,tránh tiếp xúc trực tiếp vào cơ thể và phải có nơi đựng chất thải riêng sau khisử dụng, không được thải ra ngoài môi trường khi chưa được xử lý thích hợp.Cấu trúc ethidium bromide5.4. Thu hồi DNA từ agarose gelNhiều phương pháp đã được xây dựng để thu hồi DNA từ agarose gel, nhưng khôngcó phương pháp nào là hoàn toàn tối ưu. Có hai vấn đề chính: thứ nhất đa số các loạiagarose đều bị nhiêm bẩn bởi sulphate polysaccharides, các sản phẩm sau đó đượcchiết từ gel cùng với DNA, chúng là nhân tố ức chế có hoạt tính của nhiều loại9EBOOKBKMT.COMenzyme (RE, ligase, kinase, polymerase) dùng trong các bước tạo dòng tiếp theo sau;thứ hai hiệu suất chiết DNA từ agarose gel phụ thuộc vào khối lượng phân tử của nó,các đoạn DNA có chiều dài 20 kb đượcthu hồi kém (khoảng hơn 20% sản lượng). Có nhiều phương pháp thu hồi và tinh sạchDNA từ agarose gel, dưới đây là một vài phương pháp chính:5.4.1. Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting temperature)Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt rakhỏi bản gel và cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M, sauđó được nóng chảy ở 70oC để hòa tan hoàn toàn trong đệm. Dung dịch gel có DNAđược chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa. Lưu ý DNA được tách chiết bằngphương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiệndiện của các nhân tố ức chế trong agarose.5.4.2. Ly tâmMẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm chiết, làmnóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp (màng) bôngthủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại 0,5 mL (còn gọi là spincolumn). Cột này được cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốcđộ cao 10.000-15.000 rpm trong 10-15 phút. DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịchđệm sẽ đi qua lớp bông thủy tinh vào tube vi ly tâm. Cho đệm rửa vào cột và rửa cộtvài lần bằng cách ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vàocột và ly tâm để dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube. Dung dịch DNA thuđược có thể được tinh sạch thêm nếu cần. Cũng có thể đông lạnh mẫu gel trước khidùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA.5.4.3. Điện di vào bẫyMột cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của băng DNA quantâm. Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di nhanh trở lại đểchuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện di có thể được kiểmsoát bằng UV). Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng pipette. Hoặc sau khiđiện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng DNA quan tâm và đặttrong khe một mẫu giấy loại NA-45. Gel sau đó được điện di trở lại và băng DNAquan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy. Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA đượcdung ly trong đệm bằng cách đun nóng mẫu giấy tới 70oC. DNA sau đó có thể đượctách chiết bằng phenol và kết tủa.5.4.4. Dùng hạt thủy tinh10EBOOKBKMT.COMMẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI (một loại chaotropic salt)ở nồng độ khoảng 4M. Các hạt thủy tinh sau đó được bổ sung vào dung dịch để liênkết hiệu quả với các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI. RNA,protein và các tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh. Tiếp theo là các chukỳ rửa và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệmmuối thấp. Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạmvi tối ưu hẹp. Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và cácđoạn lớn (>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA cóthể bị phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa.6. Các bước thực hiện6.1. Chuẩn bị gel agarose- Cho lượng thích hợp agarose và dung dịch đệm vào bình tam giác.- Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút trong nồi hấp cao áp ở 115 °C hoặc bằng vi sóng.Chú ý khi dùng lò vi sóng cần quan sát để tránh trào gel ra ngoài, nên chờ đến khi gel11EBOOKBKMT.COMsôi thì cắt điện, lấy ra (coi chừng bỏng) lắc đều rồi cho vào làm sôi lần nữa. Lặp lại balần cho agarose tan hoàn toàn.- Cho vào chậu bảo ôn ~50°C cho đến khi dịch gel đạt đến khoảng 50 60 °C (tay chạm vào được) thì cho vào gel một lượng dung dịch ethidiumbromide để có hàm lượng cuối cùng của chất màu này là 50 μg/ml. (Nếukhông cho ethidium bromide vào gel lỏng trước khi rót gel vào khuôn thìngâmbảngelvàodungdịchnàysaukhiđã điệndi).- Rót gel vào khuôn đã được chắn hai đầu bằng băng dán hoặc bằng kẹp, đã cài sẵnlược và đặt trên mặt phẳng- Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩn thận tháo lược ra khỏi gel.6.2. Tiến hành điện di- Tháo bản gel ra khỏi kẹp hoặc băng chắn, đặt khuôn gel trong chậu điện di ngang,rót dung dịch đệm vào cho ngập gel, chú ý đầu có lỗ lược nằm ở phía cathode.- Pha nucleic acid cần điện di với dung dịch màu tải mẫu (điện di) 6× hoặc bằng hợpchất màu tương tự. Dịch màu có tỷ trọng cao này giúp nucleic acid không bị xáo độngbởi dòng đối lưu của dung dịch nên khi tải vào lỗ răng lược thì nằm gọn trong đó vàcó màu rõ ràng. Dung dịch màu tải mẫu 6× (dịch nạp mẫu) chứa 30% glycerol, 0,25%bromophenol blue (BPB) và 0,25% xylencyanol (XC).- Bằng micropipet hút mẫu DNA nhỏ vào lỗ răng lược.12EBOOKBKMT.COM- Bật điện một chiều để thực hiện điện di. Cường độ dòng điện khoảng 50 đến 150 Vtùy loại thiết bị điện di. Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ lớn của DNA,nồng độ agarose của gel và cường độ dòng điện. Chú ý lượng DNA có thể điện ditrong mỗi lỗ răng lược nhiều ít tùy kích thước răng lược, nếu quá nhiều sẽ xuất hiệnhiện tượng "tailing" (kéo đuôi) khó phân li.13EBOOKBKMT.COM6.3. Nhuộm DNA bằng EtBrSau khi chạy điện di xong lấy nhẹ bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịchEtBr nồng độ 0,5 gian 30-45 phút, tốt nhất trên một máy lắc nhẹ (độ 10 vòng/phút ).Đổ dịch nhuộm EtBr vào một bình riêng để xử lý và rửa bản gel bằng cách ngâmtrong nước cất hai lần, mỗi lần 15-20 phút. EtBr thường pha sẵn ở dạng đậm đặc 5mg/mL và giữ ở 4oC trong tối.6.4. Kiểm tra băng ADN- Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh = 302 nm. Dùng thiết bịchuyên dụng để phân tích và lưu trữ hình ảnh DNA (Gel Documentation System).Chú ý: không nhìn vào ánh sáng tử ngoại nếu không có kính lọc thích hợp.- Nếu điện di DNA trong gel có pha sẵn ethidium bromide thì chiếu tia tử ngoại (UV)nucleid acid sẽ hiện hình dưới dạng những vạch màu đỏ cam.14EBOOKBKMT.COM- Nếu không cho trước ethidium bromide thì sau khi điện di cần ngâm gel30 - 60 phút trong dung dịch thuốc nhuộm này ở nồng độ 0,5 μg/ml.- Nếu cần chụp ảnh lưu tư liệu thì có thể dùng máy ảnh pollaroid với ốngkính có phin lọc ánh sáng thích hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng thiếtbịphântíchgelsốhóa(geldocumentationsystem).Chú ý: Đèn tử ngoại (UV) có hai loại bức xạ với bước sóng 254 nm(UV sóng ngắn) và 366 nm (UV sóng dài). UV sóng ngắn giúp quan sát rõDNA nhưng làm tổn hại cấu trúc chất này, cho nên nếu cần thu hồi DNAtừ gel thì không nên áp dụngHệ thống chụp ảnh điện di geldoc XP của Biorad15EBOOKBKMT.COMA. Kết quả điện di trên gel agarose chụp bằng ánh sáng UVB. Kết quả Western blot chụp bằng ánh sáng trắngIII. ỨNG DỤNG- Agarose gel điện là một phương pháp sử dụng rộng rãi việc chia tách các phân tửtrên cơ sở tính phí điện, kích thước và hình dạng. Phương pháp này đặc biệt hữu íchtrong việc tách các phân tử sinh học tính quan trọng như DNA (deoxyribonucleicacid), RNA (ribonucleic acid), và protein.- Agarose gel là một chất được sử dụng trong khoa học cho điện gel và sắc ký loại trừkích cỡ. Sử dụng agarose gel để tách và phân tích protein và DNA . Phương tiện baogồm một bột agarose tinh khiết đã được đun sôi trong một dung dịch đệm và sau đólàm lạnh.1. Những trường hợp sử dụng điện di gel agarose:- Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế(ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng...).- Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu ditruyền...).- Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNAtrước khi thẩm tích Northern.16EBOOKBKMT.COMƯu điểm của phương pháp này là gel được rót dê dàng, không gây biến tính mẫu, vàbền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dê thu hồi.Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bịtiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định.2. Tinh sạch và thu nhận mẫuNguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi hướng điện trường trong quá trình điện di. Mỗilần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA phải tự định hướng lại. Sau khiđiện di các vạch tương ứng với DNA cần tinh sạch được phát hiện và thu nhận lạitheo một trong những phương pháp: Phương pháp 1: phần agarose chứa các vạch đó được cắt ra và DNA đượcthu nhận sau khi đã khuếch tán phân tử gel agarose vào một dung dịch đệmthích hợp. Phương pháp 2: một “giếng” nhỏ được khoét trong agarose ngay trước vạchDNA. “giếng” này được bơm đầy dung dịch đệm và điện trường được táilập. DNA di chuyển vào giếng chứa đầy dung dich đệm và được thu nhậnlại. Phương pháp 3: Điện di được thực hiện trong một gel agarose đặc biệt (nhưNusieve hay Seaplaque) có điểm nóng chảy rất thấp (65°). Sau điện di vạchDNA được cắt ra, ủ trong một dung dịch đệm ở 65°. Khi agarose đã hoàntoàn tan chảy, DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và tủa.3. Định tính và định lượng thô nucleid acidSau khi thu nhận nucleid acid ở dạng sạch, người ta tiến hành phân tích định tính vàđịnh lượng chúng: Định tính: sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thướt… Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng4. Một số ví dụ4.1. Ví dụ 1:Điện di trên gel agarose 1% kiểm tra ADN tổng số tách từ các chủngB. THURINGIENSIS var. kurstaki phân lập: từ kênh (1-10) theo thứ tự (47S, 50S,H22, H15, 29S, T58, H8, H3, 28S, H13 ).17EBOOKBKMT.COMQua ảnh điện di các mẫu ADN tổng số tách được từ 10 chủng B. thuringiensiskurstaki phân lập đều có một dải băng sáng tập trung rõ nét ở phía trên của bản gel,không có các vạch phụ, các mẫu ADN tách được là nguyên vẹn và không bị đứt gãy,đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.4.2.Ví dụ 2:Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCRđặc hiệu của gen cry1Ab cắt bằng EcoR I.Chú thích:Kênh 1: Sản phẩm PCR của đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1AbKênh 2,3,5: Plasmid cắt bằng EcoR IKênh 4: Slasmid của khuẩn lạc xanhKênh 6: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng Hind III và EcoR I , từ trên xuống 21226,5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp).Kết quả ở hình cho thấy khi plasmid tái tổ hợp được cắt bởi enzym EcoR I đoạn ADNđặc hiệu của gen cry1Ab được tách ra khỏi plasmid có kích thước đúng bằng với sảnphẩm PCR của đoạn ADN này ( Kênh 1 và 2, 3, 5). Kênh 2 cho thấy plasmid củakhuẩn lạc xanh không mang đoạn ADN ngoại lai, và chỉ có một băng duy nhất có kíchthước vào khoảng 3,9kb là trọng lượng phân tử của plasmid.18EBOOKBKMT.COM19

Tài liệu liên quan

• Đề cương điện tử công suất và ứng dụng
  • 3
  • 1
  • 6
• điện tử công suất và ứng dụng
  • 3
  • 652
  • 5
• Tài liệu Thiết bị điện tử công suất và ứng dụng pptx
  • 21
  • 795
  • 1
• Bài 10 Phương pháp nghiên cứu di truyền người và ứng dụng trong y học pptx
  • 7
  • 957
  • 11
• Điện tử công suất và ứng dụng điều chỉnh tốc độ động cơ 1 chiều kích từ độc lập
  • 79
  • 910
  • 1
• Sắc ký điện di, điện di mao quản và ứng dụng
  • 25
  • 1
  • 10
• điện di gel agarose và ứng dụng
  • 19
  • 536
  • 2
• Nghiên cứu đặc tính điện hóa của fenofibrat và ứng dụng trong phân tích
  • 59
  • 875
  • 0
• Thuật toán Dijkstra Fibonacci heap, thuật toán ACO tìm đường đi tối ưu và ứng dụng (LV thạc sĩ)
  • 74
  • 279
  • 1
• Điện DI GEL AGAROSE và ứng dụng
  • 19
  • 1
  • 9

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(1.15 MB - 19 trang) - Điện DI GEL AGAROSE và ứng dụng Tải bản đầy đủ ngay ×