FLOWCYTOMETRE Kỹ Thuật Phân Tích Tế Bào Dòng Chảy (FC)

Có thể bạn quan tâm

Tải bản đầy đủ (.docx) (40 trang)

Trang chủ

Luận Văn - Báo Cáo

Khoa học tự nhiên

FLOWCYTOMETRE Kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy (FC)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.26 MB, 40 trang )

MỤC LỤCTHUẬT NGỮ SỬ DỤNGThuật ngữ chuyên ngànhCompensation : Chạy chuẩn máy, thiết lập bù trừ quang phổ tự động.CS&T (Cytometer Setup and Tracking) : Thiết lập điều kiện chuẩn máy.Blast cell: Tế bào nonErythroblast: Các nguyên hồng cầu nói chung là những hồng cầu non cónhân chỉ ở trong tủy xương tạo máu, bình thường không ở máu ngoại vi.Megacaryoblast: Nguyên mẫu tiểu cầu.Monoblast: Nguyên bạch cầu mono đơn nhân.Lymphoblast: Nguyên bạch cầu lymphoCD (Cluster of differentiation: nhóm biệt hóa): kháng thể đặc hiệu.AL (Acute Leukemia): Bệnh bạch cầu cấp.AML (Acute Myeloid Leukemia): Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy.ALL (Acute lymphoblastic Leukemia): Bệnh bạch cầu cấp dòng lymphoCác chữ viết tắtRPM: Tốc độ ly tâm (vòng/phút).FC: Flow Cytometry ( Phân tích tế bào dòng chảy)BCC: Bạch cầu cấp.DAMDTB: Dấu ấn miễn dịch tế bào.FC: Máy đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometry)FITC: Fluorescein Isothiocyanante.PE: Phycoerythrin.PerCP: Peridin chlorophyll.PE-Cy7: Phycoerythrin-cyanine 7.APC: Allophycocyanin.1CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬPBỆNH VIỆN UNG BƯỚU ĐÀ NẴNG1. Bệnh viện ung bướu Đà Nẵng – bệnh viện ung bướu lớn nhất nước mangdấu ấn ông Nguyễn Bá Thanh.1.1. Giới thiệu chungBệnh viện ung bướu Đà Nẵng được đánh giá lớn nhất cả nước không chỉ quy môgiường bệnh, công tác khám và điều trị mà còn bởi quang cảnh sạch đẹp, hiện đại.Ngày 28/3/2009, Bệnh viện ung thư Đà Nẵng khởi công xây dựng trên diện2tích 15 ha tại phường Hoà Minh, quận Liên Chiểu (Đà Nẵng). Gần 4 năm sau,bệnh viện này chính thức tiếp nhận khám chữa cho bệnh nhân ung thư tại khuvực miền Trung. Chính thức từ ngày 1/9/2015 bệnh viện ung thư Đà Nẵng đổitên thành bệnh viện ung bướu Đà Nẵng và trực thuộc sở y tế thành phố Đà Nẵng .Với tổng kinh phí 1.500 tỷ đồng từ các tổ chức, cá nhân có tấm lòng hảo tâm,cùng với nguồn từ xổ số kiến thiết của thành phố và hỗ trợ của Chính phủ, dự ánđược cho là có công lớn của Nguyên Bí thư Nguyễn Bá Thanh với lời kêu gọi ủnghộ đầy tâm huyết của ông.Chức năng chính của bệnh viện là tiếp nhận khám và phát hiện sớm bệnhnhân ung thư, chẩn đoán chính xác điều trị có hiệu quả mọi bệnh lý ung thư, dựphòng bệnh ung thư cho nhân dân thành phố Đà Nẵng và khu vực miền Trung, triểnkhai các chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ và tham gia đào tạo nhân lựcchuyên ngành.Bệnh viện được đánh giá là lớn nhất cả nước không chỉ quy mô giường bệnh,công tác khám và điều trị mà bởi quang cảnh sạch đẹp, hiện đại.Tổng diện tích sàn bệnh viện là 60.000 m2, đạt 120 m2 mỗi giường bệnh, thiết kếtheo mô hình bệnh viện khách sạn với cảnh quan hài hòa, tiện nghi và thân thiện,không gian xanh bao phủ khắp nơi. Quy mô 500 giường bệnh điều trị và nội trú.Cụ Lê Thị Bốn 83 tuổi (ngụ tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam) điều trị ungthư gan tại Khoa chăm sóc điều trị và giảm nhẹ của bệnh viện hơn 3 tháng nay.3Nguyễn Thị Á, cho biết tình trạng bệnh của mẹ chồng chị đã thuyên giảm, sức khoẻcũng đã tốt lên nhiều. Bệnh nhân có bảo hiểm y tế và bệnh nhân khám chữa bệnhtheo yêu cầu đều được đón nhận khám chữa và điều trị như nhau.Với các thiết bị chẩn đoán hình ảnh hiện đại nhất hiện nay tại Việt Nam nhưmáy MRI 3,0 Tesla (cả nước chỉ có 3 chiếc), CT-scan 128 lát..., người bệnh đãkhông còn phải cất công chuyển ra Hà Nội hoặc TP HCM để kiểm tra như trước đó.Với 76 bác sĩ chuyên khoa, trong đó 82% bác sĩ có trình độ từ thạc sĩ yhọc/BS chuyên khoa 1 trở lên, trong đó có 2 giáo sư và phó giáo sư y học, 8 tiến sĩy học và BS chuyên khoa II, 9 BS nội trú, 43 thạc sĩ y học và BS chuyên khoa I,mọi bệnh nhân đều được đảm bảo điều trị và chăm sóc tốt nhất có thể.1.2. Các bộ phận hoạt động1.2.1. Các phòng chức năng: 08 phòng1. Phòng Hành chính quản trị;2. Phòng Tổ chức cán bộ;43. Phòng Kế hoạch tổng hợp;4. Phòng Tài chính kế toán;5. Phòng Công nghệ thông tin;6. Phòng Điều dưỡng;7. Phòng Chỉ đạo tuyến và quản lý chất lượng bệnh viện;8. Phòng Vật tư, trang thiết bị y tế.1.2.2. Các khoa: 18 khoaCác khoa lâm sàng:1. Khoa Khám bệnh và cấp cứu;2. Khoa Chăm sóc giảm nhẹ;3. Khoa Hóa trị 1;4. Khoa Hóa trị 2;5. Khoa Huyết học;6. Khoa Gây mê hồi sức;7. Khoa Ngoại 1 (Tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục nam, mô mềm);8. Khoa Ngoại 2 (Thần kinh, đầu cổ, lồng ngực);9. Khoa Ngoại 3 (Vú và phụ khoa);10. Khoa Xạ trị;11. Khoa Dược;12. Khoa Y học hạt nhân;Các khoa cận lâm sàng:13. Khoa Chẩn đoán hình ảnh;14. Khoa Nội soi và thăm dò chức năng;15. Khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn;16. Khoa Xét nghiệm - Truyền máu;17. Khoa Giải phẫu bệnh;18. Khoa Kỹ thuật phóng xạ.Vì em được phân công thực tập tại khoa Xét nghiệm – Truyền máu nên sẽgiới thiệu rõ hơn về khoa này.2. Giới thiệu về khoa Xét nghiệm – Truyền máu52.1. Tên đơn vị, địa chỉ, điện thoại liên hệ:Khoa Xét nghiệm - Truyền máu được thành lập từ ngày 28/08/2015 theo quyếtđịnh thành lập bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng của UBND TP.Đà Nẵng. Trên cơ sởsáp nhập nguyên trạng giữa Khoa xét nghiệm, Khu truyền máu và Trung tâm nghiêncứu ung thư thuộc Bệnh viện Ung thư Đà Nẵng.- Địa chỉ: Tầng 2 – Khu nhà D – Bệnh Viện Ung bướu Đà Nẵng – Tổ 14 PhườngHòa Minh, Quận Liên Chiểu,TP Đà Nẵng.- Điện thoại: 05113.717361 (Hành chính)05113.717 362 (BS Lê Văn Hùng – Trưởng khoa)05113.717 364 (Labo Hóa sinh – Huyết học)05113.717 366 (Labo Vi sinh)2.2. Chức năng nhiệm vụa. Các xét nghiệm về Huyết học, Đông máu và Tế bào:- Đánh giá các chức năng đông máu Nội sinh và Ngoại sinh.- Tổng phân tích tế bào máu bằng máy đếm Laser.- Các xét nghiệm chuyên sâu về Huyết đồ, Tủy đồ, D-Dimer, Tế bào dịchb. Các xét nghiệm về Hóa sinh- Miễn dịch:- Các xét nghiệm hóa sinh cơ bản đánh giá chức năng gan, thận, chuyển hóa,biland lipid, calci, phospho, HbA1c, A.Uric, LDH…- Các xét nghiệm hóa sinh cao cấp như định lượng các kháng thể IgG, IgM,IgA, IgE, β2- Microglobulin, Pre-albumin, CK-MB…- Các xét nghiệm Hormon T3, FT3, T4, FT4, TSH, Estrogen, Testosteron,Cortisol, ADH…- Đặc biệt là các xét nghiệm dấu hiệu sinh học bướu nhằm giúp tầm soát vàchẩn đoán sớm các bệnh ung thư gan, phổi, đường tiêu hóa, thận,vú, buồngtrứng, cổ tử cung, tụy như: CEA, CA125, CA15-3, CA19-9, Cyfra 21-1, AFP,Pepsinogen I & II, Pro-GRP, PSA, SCC, HE 4, NSE …c. Các xét nghiệm nuôi cấy, định danh vi khuẩn, nấm và thực hiện kháng sinh đồ,xác định nồng độ ức chế tối thiểu … được thực hiện thường quy.2.3. Cơ cấu tổ chức:Cơ cấu tổ chức của khoa như sau:TRƯỞNG KHOAKTV TRƯỞNG6TỔCTM –ĐÔNG MÁUTỔ TẾ BÀO(HUYẾTTUỶ ĐỒ-TBDỊCH)TỔ HÓASINH –MIỄN DỊCHTỔ VI SINH– SINH HỌCPHÂN TỬTỔ LẤYMẪU-NHẬNVÀ XỬ LÝMẪU2.4. Cơ sở vật chất, trang thiết bị:Khoa XNTH được trang bị một hệ thống phân tích mẫu hoàn toàn tự động củacác hãng lừng danh trên thế giới như Abbott, Roche, Siemens, Becton, Dickinson.- Đối với các xét nghiệm Hóa sinh – Miễn dịch khoa được trang bị hệ thốngkết nối hiện đại của hãng Abbott, Hoa Kỳ (Module Ci16200) và máy xét nghiệmmiễn dịch i1000 cũng của hãng Abbott sử dụng kỹ thuật miễn dịch hóa phát quang(CMIA) tiên tiến nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao.Hệ thống phân tích khí máu động mạch và ion đồ hiện đại gồm 2 máy: máycobas b121 của hãng Roche và máy Rapid point 400 của hãng Siemens (Germany).Hệ thống phân tích nước tiểu hoàn toàn tự động 18 thông số Combi scan 500 củahãng Siemens (Germany).- Đối với các xét nghiệm Huyết học khoa được trang bị hệ thống hiện đại,hoàn toàn tự động bao gồm máy xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu 33 thông sốbằng máy đếm laser Cell Dyn Ruby của hãng Abbott (Hoa Kỳ) và máy XS 800 củahãng Sysmex (Nhật Bản).Các xét nghiệm đông máu được thực hiện hoàn toàn tự động trên máy CA1500 của hãng Sysmex (Nhật Bản) và máy STA Compact CT của hãng Stago(Pháp).Xét nghiệm máu lắng tự động hoàn toàn được thực hiện bằng máy Human Sed25 mix của hãng Human (Germany).- Đối với các xét nghiệm vi sinh, bao gồm các xét nghiệm định danh vi khuẩn,nấm và thực hiện kháng sinh đồ, xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn gâybệnh được thực hiện hoàn toàn tự động trên máy BD Phoenix của hãng BectonDickinson lừng danh (Hoa Kỳ).7Hệ thống nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí hiện đại cũng đã được trangbị, xét nghiệm cấy máu được thực hiện bằng máy Bactec 9250 cũng của hãngBecton Dickinson lừng danh (Hoa Kỳ).Hệ thống kính hiển vi – xét nghiệm tế bào:- Kính hiển vi đối pha Nikon Eclipse Ci H550s – Nhật Bản.- Hệ thống kính hiển vi quang học Nikon Eclipse E100 – Nhật Bản.3. Đơn vị Di truyền và sinh học phân tử thuộc khoa Xét nghiệm-Truyền máu3.1. Nhiệm vụ đơn vị:Đơn vị Di truyền và sinh học phân tử chuyên xét nghiệm về các mảng miễndịch ung thư, di truyền và SHPT ung thư.STTKỸ THUẬT XÉT NGHIỆMMIỄN DỊCH UNG THƯKỸ THUẬT XÉT NGHIỆM DITRUYỀN, SHPT UNG THƯ1Xét nghiệm dấu ấn tế bào Bạch cầucấp (20CD)Xét nghiệm phát hiện gen2Đếm tế bào gốc CD34+ bằngFlowcytometryXét nghiệm gen bệnh máu ác tính3Đếm số lượng tế bào Lympho TCD4/CD8-CD3Xét nghiệm công thức NST(Karyotype)4Phân tích CD5Xét nghiệm sắc thể: kỹ thuậtDNA với ProteinĐánh giá tồn lưu tế bào ác tính(MRD) sau điều trị (24CD)Phát hiện gen JAK2 V617F bằngkỹ thuật Allen-specific PCRĐịnh lượng vvirus viêm gan B(HBV)6Phân loại Lymphoma7Xét nghiệm định type HLA (bằngkỹ thuật sinh học phân tử)HCV (RT-PCR)8Kháng thể kháng nhânHIV (PCR)9Xét nghiệm đọ chéo ( bằngFlowcytometry)HIV (RT-PCR)10Xét nghiệm Đường – HamXác định DNA trong viêm gan B11Chuẩn đoán bệnh tiểu huyết sắc tốvề đêm (PNH)(5CD)Định lượng virus viêm gan B(HBV) cho các bệnh viêm gan Cmãn tính12Xét nghiệm CD64, CD11b trongĐịnh lượng virus viêm gan C8SEPSIS(HCV) cho các bệnh viêm gan Cmãn tính13PCR chuẩn đoán CMV14Đo tải lượng CMV15PCR chuẩn đoán lao bằng hệ thốngCobas TaqMan48Bảng 1: Các kỹ thuật xét nghiệm3.2. Trang thiết bị tại đơn vị Di truyền và sinh học phân tử.H1: Máy FlowcytometryH4: Máy ly tâm ống nghiệmH2: Tủ ấm có trao đổi khíH5: Máy ly tâm EppemdorfH3: Tủ ATSH cấp 2H6: Máy Realtime PCRHình 9: Tủ lạnh -200CHình 7: Tủ hút khí độcHình 8: Tủ lạnh 40CHình 10: Máy VortexHình 11: Máy Spindown9Hình 12: Máy PCRHình 13: Máy đo nồng độ Acid nucleidHình 14: Máy đọc gelHình 15: Máy điện diHình 16: Ủ nhiệt có lắcH18: Kính hiển vi huỳnhHình 17: Tủ lạnh -800Cquang camera10CHƯƠNG II: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÒNGCHẢY TRONG XÉT NGHIỆM BỆNH BẠCH CẦU CẤP( FLOW CYTERMETRY – FC )I.Giới thiệu kỹ thuật tế bào dòng chảyI.1.Lịch sửNăm 1969, Lou Herzenberg phát minh ra kỹ thuật phân loại tế bào dựa vàoviệc sử dụng ảnh sáng huỳnh quang (đèn argon) và phát triển thiết bị phân loại tếbào dựa trên kích hoạt huỳnh quang (FACS – Flourescent Activated Cell Sorter).Đến năm 1990, Becton Dickinson (BD) tung ra thị trường máy FACSCountchuyên dụng cho máy đếm T-CD4, tại thời điểm đó máy chưa được cấp giấychứng nhận bởi FDA nhưng hiện nay đã được công nhận.Năm 1996, BD tiếp tục đưa ra hệ thống FACSCalibur và sau đó là các dòngmáy FACS Canto, FACS Aria hiện đại và đa nhiệm.Về sau các máy FACS ngàycàng được nâng cấp và tính đa nhiệm ngày càng cao.I.2.Sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể - chất phát huỳnhquangHình 1: Sơ đồ hóamối liên kết khángnguyên – kháng thể- chất huỳnh quang.(Nguồn: tác giả Nguyễn Phương Liên)Kỹ thuật tế bào dòng chảy nhận diện DAMDTB, là các kháng nguyên củatế bào, gián tiếp thông qua mật độ các chất huỳnh quang gắn với các kháng thể đặctrưng tương ứng với từng loại kháng nguyên. kháng nguyên cần khảo sát có thể làmột Protein, immunoglobulin, cytokine…nằm trên màng tế bào, trong bào tươnghoặc thậm chí trong nhân tế bào.11Từ năm 1992, các chuyên gia Việt Nam đã biết đến kỹ thuật tế bào dòngchảy, nhưng chỉ được tiếp cận thông qua kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang bằngkính hiển vi để phân biệt BCC dòng lympho B và T, kế đến là xác định dòng tủytại Viện Truyền máu Huyết học Trung ương, bệnh viện nhi Trung Ương…Năm1995, bệnh viện truyền máu huyết học là bệnh viện đầu tiên được trang bị máyFASC Calibur (3 màu) để phân biệt các dòng tế bào tạo máu khác nhau trong bệnhlý BCC và thực hiện đếm tế bào CD4 cho bệnh nhân HIV. Trong những năm sauđó, nhiều trung tâm nghiên cứu trong cả nước đã quan tâm đầu tư máy móc thiết bịmở rộng các lĩnh vực nghiên cứu. Các bệnh viện truyền nhiễm trung ương và việnpasteur TP.HCM (2000) là những đơn vị kế tiếp sử dụng máy tế bào dòng chảy 34 màu trong lĩnh vực nghiên cứu về CD3/CD4/CD8 ở bệnh HIV. Nhu cầu đếmCD4 lan rộng trên cả nước và thế giới nên có những dòng máy đơn giản rẻ tiềnhơn thay thế. Những năm 2005 trở lại đây, kỹ thuật tế bào dòng chảy đã đóng mộtvai trò quan trọng trong các nghiên cứu về tế bào gốc máu cuống rốn, đặc biệt là tếbào trung mô. Cùng với sự phát triển của kỹ thuật, công nghệ này càng được đổimới tiến bộ hơn với những dòng máy từ 4,6 hoặc 8 màu đã ra đời và được các đơnvị nghiên cứu quan tâm đầu tư để tăng thêm độ chính xác, giúp nghiên cứu nhữngquần thể tế bào rất nhỏ ( bệnh viện TMHH TP.HCM năm 2009 đã có thêm máy 6màu, Viện Hải dương học Nha Trang..)Ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy xác định DAMDTB trong chẩn đoán,phân loại bệnh BCC, từ đó chọn lựa các phương pháp và kiểu hình DAMDTB phùhợp để đánh giá TLTBAT bằng dàn kháng thể đơn dòng hiện có.I.3.Nguyên lý hoạt động của máy tế bào dòng chảy [5]Nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometry FC) là nguyên lý biến đổi điện trở của dòng hạt đi qua cửa sổ có tế bào quang điệnvà một điện trường. Nguyên lý này giúp phân tích sự khác biệt về kích thước cácloại tế bào khác nhau, nhưng không nhận diện chính xác từng loại tế bào.Các máy đếm tế bào hiện đang được sử dụng có thể chia làm hai loại:- Máy đếm tế bào nguyên lý tổng trở: phân biệt từng loại tế bào dựa vàokích thước tế bào.- Các máy thế hệ sau: ứng dụng laser và xung điện đa chiều nên có tốc độcao và phân loại tế bào chính xác hơn. Với những máy sản xuất trước121996 khả năng phân loại chính xác các thành phần bạch cầu nói chungkhông quá 90%. Các máy model gần đây, với việc áp dụng tổng hợp cáccơ chế tổng trở, xung điện đa chiều, laser và scatter nên khả năng nhậndiện tế bào được nâng đến 95%. Một số serie máy có thể phân biệt đượccác loại bạch cầu ưa a xít, ưa baso, hồng cầu lưới bằng việc kết hợp vớicác phương pháp nhuộm men peroxydase, nhuộm RNA/DNA, nhuộmhuỳnh quang, phân tích huyết sắc tố (CellDyn 4000 của hãng ABBOTT,SE-Advance của hãng Sysmex…).I.4.Các bộ phận chính và nguyên lý cơ bản của máy flowcytometry [4]Hình 2: Hệ thống Flow CytormetryI.4.1. Hệ thống tạo dòng chất lỏng (fluidics system)Hệ thống tạo dòng chất lỏng là bộ phận căn bản nhất của một máy đếm tếbào dòng chảy.Hệ thống tạo dòng chất lỏng gồm có 2 vùng chất lỏng có áp lực khác nhau.Dòng dịch lỏng bên ngoài (sheath fluid) còn được gọi là dung dịch tạo dòng bao: cótác dụng “nắn chỉnh” dòng dịch lỏng chứa mẫu bên trong (core fluid) còn gọi là13dòng lõi thành một dòng hẹp tới mức các tế bào/hạt vật chất trong mẫu chỉ có thể điqua khe hẹp đó từng cái một từ đó giúp tập trung tế bào/vật thể nhỏ có trong mẫuthành dòng tế bào đơn và vận chuyển dòng tế bào đơn này đi qua hệ thống quanghọc với tốc độ rất cao, khoảng 1000 tế bào/giây. Điều chỉnh mức độ chênh lệnh áplực giữa dòng bao và dòng lõi có thể mở rộng hoặc thu hẹp tiết diện dòng lõi, phùhợp với yêu cầu phân tích (ví dụ phân tích tế bào máu thì cần dòng lõi lớn, phântích ADN thì cần dòng lõi hẹp). Nhờ cơ chế này hệ thống mới có thể phân tích đồngthời nhiều đặc tính trên từng tế bào một cách chính xác, giảm được yếu tố nhiễu.Dịch dùng tạo dòng sheath thường phải đáp ứng 2 yêu cầu:(1) không gây ảnh hưởng tới tế bào (không làm tan tế bào).(2) không làm ảnh hưởng đến độ chiết quang và độ huỳnh quang của hệthống. Ở một số dòng máy người ta sử dụng ống vi mao thay thế cho dòng bao.Hình 3: Hệ thống dòng chất lỏng trong buồng mẫu (flow cell)I.4.2. Hệ thống quang học14Bản thân một tế bào không được nhuộm với kháng thể có gắn huỳnh quangcũng có thể phát ra những tia phản xạ, được các bộ phận nhận sóng ghi nhận, từ đóphản ánh hai thông số : FSC và SSC, còn được gọi là hai yếu tố nội tại của tế bàoFSC (Forward Scatter Chanel): nguồn sáng lasersẽ đón nhận những tia sáng thẳng tới từ tế bàogốc, phản ánh kích thước tế bào.SSC (Side Scatter Chanel): những tia sángđược các gương phản xạ ở những vị trí khácđón nhận, phản ánh tính chất phức tạp của tếbào như: sự nhấp nhô của màng tế bào, bảnchất không hạt, ít hạt hay nhiều hạt của bàotương…Hình 4: Yếu tố nội tại của tế bàoHệ thống quang học bao gồm nguồn phát tia sáng (thường là các đèn laserhoặc đèn hồ quang), hệ thống kính lọc và các kênh thu tín hiệu quang học và tínhhiệu huỳnh quang (FSC dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc thẳng; SSCdùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc bên, các FL (Fluoressen Light), dùng thunhận tín hiệu ánh sáng huỳnh quang từ kênh màu huỳnh quang và số kênh màuhuỳnh quang có thể dao động từ 2 đến 18 FL tùy dòng máy; PMT – PhotoMultiplier Tube, các ống nhân quang tương ứng với các kênh màu huỳnh quang cóvai trò khuếch đại tín hiệu ánh sáng huỳnh quang).Ánh sáng từ nguồnlaser tương tác với tế bàonhuộm kháng thể gắn huỳnhquang sẽ sinh ra các ánhsáng sau: FSC liên quan tớikích cỡ tế bào, SSC liênquan đến độ phức tạp nhânvà bào tương tế bào, cácánh sáng huỳnh quang nhưFITC, PE, PC5 đặc trưngcho các kháng nguyên tươngứng có trên bề mặt tế bào.Hình 5: Hệ thống quang học15Khi một tế bào hay một vật thể đi qua nguồn sáng, ánh sáng của nguồn sángsẽ tương tác với vật thể sẽ tạo ra các ánh sáng tán xạ (tán xạ góc thẳng và tán xạ gócbên) và nếu tế bào/vật thể đó được nhuộm màu huỳnh quang, dưới kích thích củanguồn sáng, chất màu huỳnh quang đó sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang. Sau đó cáctia sáng này sẽ đi qua hệ thống kính lọc (đó là các thấu kính chỉ cho phép các tiasáng có bước sóng nhất định đi xuyên qua). Với hệ thống kính lọc này các tia sángtán xạ và ánh sáng huỳnh quang sẽ được phân chia và đi đến hệ thống thu nhận tínhiệu một cách chính xác.Nếu tế bào có kích thước càng lớn, chỉ số FSC thu được càng lớn. Tế bàocàng nhiều hạt hoặc khoang trong bào tương, nhân càng quận, chia múi thì chỉ sốSSC càng cao. Như vậy, trong các thành phần bạch cầu có thể thấy chỉ số SSC củaquần thể tế bào lympho là thấp nhất, của quần thể mono cao hơn quần thể lympho,và SSC của quần thể bạch cầu hạt đa nhân sẽ lớn nhất.Các tín hiệu màu huỳnh quang (FL-Fluoressent Light) từ phức hợp kháng thểkháng nguyên trên bề mặt tế bào đích cũng được thu nhận theo các kênh màu huỳnhquang và được khuếch đại trong các ống nhân quang PMTs (photomultipliers tube).Khi tia laser chiếu vào các chất phát huỳnh quang này sẽ tạo ra các ánh sánghuỳnh quang và sau đó các tín hiệu sáng này sẽ được thu nhận, chuyển đổi thành tínhiệu điện tử và biểu thị dưới dạng biểu đồ gồm các quần thể dương tính và âm tínhvới các huỳnh quang tương ứng với các kháng nguyên cần khảo sát.Hình 6: Đồ thị 2 chiều SSC và FSC của mẫu máu toàn phần đã ly giải hồngcầu cho thấy các quần thế tế bào bạch cầu được phân tách thành 3 quần thểrõ rệt theo kích thước và mức độ phức tạp của cấu trúc bên trong tế bào.Hình 7: Hiển thị tín hiệu huỳnh quang trên máy tính phân tích16Trong một số trường hợp, tín hiệu huỳnh quang có thể được thu nhận mộtcách không đặc hiệu do các kháng thể gắn huỳnh quang có thể gắn không đặc hiệuvới màng tế bào đích, hoặc các tế bào đích có khả năng tự phát huỳnh quang.Thông thường các hãng khác nhau có đôi chút khác biệt trong việc bố trí đènhuỳnh quang và các hệ thống kính lọc, do vậy các kênh màu huỳnh quang cũng cóđôi chút khác biệt. Điều này cần chú ý vì sẽ liên quan đến việc lựa chọn phối hợpmàu huỳnh quang trong các phân tích đa màu.Tổng hợp các tín hiệu về ánh sáng tán xạ góc bên và các tín hiệu về ánh sánghuỳnh quang tương ứng của một tế bào sẽ giúp chúng ta phân biệt tế bào này vớicác nhóm tế bào khác trong quần thể. Ngoài ra, việc khoanh vùng (gating) quần thểmong muốn còn giúp thực hiện thống kê hoặc tiếp tục phân tích sâu hơn.I.4.3. Hệ thống điện tử (electronics system)Hệ thống điện tử về bản chất là một hệ thống có trong máy, các tín hiệu củaánh sáng tán xạ và tín hiệu huỳnh quang sau khi được khuếch đại ở PMT sẽ được hệthống điện tử chuyển thành tín hiệu số đo đếm được và được biểu hiện dưới dạngbiểu đồ cột, biểu đồ mật độ hay biểu đồ điểm trên máy tính thông qua các phầnmềm chuyển đổi chuyên dụng theo máy.Chuyển tín hiệu ánh sáng huỳnh quang thànhtín hiệu điện tử và biểu diễn dưới dạng đồ thị (Vídụ trong hình vẽ, tín hiệu huỳnh quang đượcchuyển thành tín hiệu điện từ và được thể hiện trênmàn hình máy tính dưới dạng các điểm đồ thị DotPlotHình 8: Hiển thị tín hiệu huỳnh quangI.5.Ứng dụngbằng đồ thị điểm trên máy tínhSử dụng kháng thể đơn dòng gắn chấthuỳnh quang kháng dấu ấn bề mặt để phân biệt các giai đoạn phát triển của tế bào.Sự thay đổi về số lượng tương đối, số lượng tuyệt đối hay tỉ lệ các loại tếbào có thể cung cấp các thông tin giá trị về trạng thái miễn dịch của người hay loàivật.Cho phép quan sát các tiểu quần thể tế bào và phụ nhóm của 1 mẫu máu.Kỹ thuật tán huyết không rửa (lyse-no-wash methodology) cho số đếmtuyệt đối các nhóm tế bào limpho nhanh và chính xác.Đếm hồng cầu lưới17Định lượng DNA ở tế bào bướu.Với FACSCalibur, phân loại tế bào trở nên thông thường. Chỉ cần đặt giớihạn (gate) của quần thể tế bào cần quan tâm và ấn ACOUIRE. FACSCalibur làmtiếp chu trình phân loại tế bào. Chu trình này khép kín, không tạo khí dung, tạo antoàn khi xử lý các mẫu phẩm. Chu trình này thanh lọc các tiểu quần thể, loại bỏcác chất có thể gây nhiễm cho các xét nghiệm nhạy, tăng số lượng tế bào cần quantâm trong mẫu phẩm hay khẳng định các phát hiện của flow cytometry.Phân loại tế bào rất lý tưởng cho việc kiểm tra hình thể tế bào và thực hiệncác kỹ thuật phân tử như FISII hay PCR hay xét nghiệm chức năng. Sự liên hệchéo giữa thông tin từ flow cytometry và kết quả các xét nghiệm hậu phân loại tạothuận lợi cho phân tích tế bào.Ngoài ra còn những ứng dụng thành công trong các lĩnh vực nghiên cứusinh học và y học như phân tích tiểu cầu, nghiên cứu tế bào gốc, phân tích DNA ,xét nghiệm động học...[7]Immunophenotyping (HIV) cho thấy sự hiện diện của các quần thể bấtthường hoặc chưa trưởng thành của bạch cầu .Đếm tuyệt đối kháng nguyên CD4 để đánh gía mức độ suy giảm miễn dịch(suy giảm miễn dịch nặng khi CD4máu ngoại biên < 1.200/mm3)Thực hiện thủ tục immunophenotyping sau đó dùng kỹ thuật FC để xétnghiệm chẩn đoán bệnh bạch cầu và ung thư hạch bạch huyết.Phân tích chu kỳ tế bào và mức bội thể của khối u.Phản ứng chéo tương hợp mô (ghép tạng) [6]- Biểu hiện của các thụ thể trên bề mặt tế bào: đếm số lượng tế bào lymphoT-CD4, xác định các dòng tế bào gây ung thư, đếm tế bào gốc, đếm tế bào hồng cầulưới, định danh vi khuẩn, nghiên cứu sự biệt hóa tế bào động, thực vật...- Phân tách tế bào: thu nhận các quần thể tế bào lai cho việc sản xuất khángthể đơn dòng, các quần thể tế bào miễn dịch cho nuôi cấy tương tác invitro, thunhận tế bào gốc, thu nhận tinh trùng X hoặc Y.....- ADN/ tế bào: xác định các giai đoạn của chu trình phân bào, khảo sát sự bấtthường trong bộ nhiễm sắc thể, xác định tổn thương ADN, nghiên cứu tác dụng củathuốc kháng ung thư lên trên tế bào đích...18- Phát hiện cytokine: định lượng nồng độ cytokine trong dung dịch bằng kỹthuật dùng hạt bi có gắn kháng thể đơn dòng đặc hiệu với phổ cytokines. Xác địnhtế bào đích sản xuất các cytokine và bán định lượng thông qua kỹ thuật đo cytokinenội bào...- Ngoài ra, kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy còn được ứng dụng trong nghiêncứu biến dưỡng tế bào, hoạt động cá kênh ion, các cơ quan nội bào, pH nội bào, ảnhhưởng của thuốc lên trên sinh lý tế bào...2. Ứng dụng kỹ thuật FC để chẩn đoán BCC.2.1.Giới thiệu về bệnh bạch cầu cấp (BCC)2.1.1. Khái niệm:Bệnh bạch cầu (Leukemia) là bệnh xảy ra khi cơ thể bắt đầu tích tụ bạchcầu bất bình thường. Vì vậy, số lượng và khả năng của tế bào máu trưởng thành bịgiảm bớt. Tế bào trở thành ‘bất bình thường’ vì chúng không thể trưởng thành trọnvẹn. Tình trạng không thể trưởng thành trọn vẹn này là yếu tố chính gây ra bệnhbạch cầu. Những tế bào ‘em bé’, hay còn non, tích tụ trong cơ thể vì chúng khôngchết và không bị tiêu hao dần. Khi phát bệnh bạch cầu, các tế bào bệnh bạch cầutích tụ trong tủy xương. Cuối cùng tất cả bạch cầu, hồng cầu và tiểu cầu bìnhthường hết chỗ trú ngụ hay không đổi mới nữa. Tủy xương khỏe mạnh bị thay thếbằng những tế bào còn non, rồi cuối cùng những tế bào này nhập vào dòng máu vàđi khắp nơi trong cơ thể. Do đó, khi số lượng tế bào còn non gia tăng, thì số lượnghồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu giảm bớt.Bốn dạng bệnh bạch cầu thông thường là:• Bệnh Bạch Cầu Nguyên Bào Cấp Tính(Acute Lymphoblastic Leukaemia - ALL)• Bệnh Bạch Cầu Bạch Huyết Bào Mạn tính(Chronic Lymphocytic Leukaemia - CLL)• Bệnh Bạch Cầu Tủy Bào Cấp Tính(Acute Myeloid Leukaemia - AML)• Bệnh Bạch Cầu Tủy Bào Mạn tính(Chronic Myeloid Leukaemia- CML) [8]Bệnh Bạch cầu cấp (Acute Leukaemia) là bệnh tăng sinh ác tính các tế bàomáu chưa biệt hóa hay đã biệt hóa một phần thành các tế bào đầu dòng của tế bào19bạch cầu xảy ra khi các tế bào trong thời kỳ phát triển ban đầu bị ảnh hưởng. Dođó, các tế bào này còn không trưởng thành được và hoàn toàn vô dụng. Do vậybệnh nhân bị bệnh bạch cầu dạng cấp tính dễ bị viêm nhiễm, chảy máu, và thiếumáu, và hầu như phải được trị liệu ngay. Bạch cầu cấp, còn gọi là bệnh lơ xê micấp, là bệnh ung thư phổ biến nhất ở trẻ em trên thế giới, bệnh chiếm khoảng mộtphần tư các bệnh ung thư ở trẻ em dưới 15 tuổi. Bạch cầu cấp thể lympho chiếm75% các bệnh bạch cầu cấp [3].2.1.2. Nguyên nhân [1]Cho đến nay, y học đang tìm kiếm nguyên nhân cụ thể gây nên bệnh bạchcầu cấp. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu ghi nhận các yếu tố liên quan đến bệnh lýnày như sau:- Hóa chất : các chất nhóm Alkyl, nhóm benzen (những hóa chất có cấu trúc-hóa học nhân vòng).Tia xạ hay tia ion hóa: tỷ lệ bệnh bạch cầu cấp gặp nhiều ở những người-tiếp xúc với tia xạ lâu ngày hay ở trong vùng nhiễm xạ nặng.Virus: nhiều nghiên cứu ghi nhận một số virus gây bệnh trên người một thờigian dài cũng gây ung thư. Ví dụ: EBV gây ung thư vòm, HTLV1,2 gây bệnh-bạch cầu cấp dòng lympho T….Bất thường nhiễm sắc thể: đây là nguyên nhân thường gặp trên bệnh nhân-bạch cầu cấp.Yếu tố di truyền: có một số bệnh bẩm sinh di truyền như Hội chứng Down,hội chứng thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh, hội chứng Poland… gây người bệnh-dễ mắc thêm bệnh bạch cầu cấp.Yếu tố môi trường: môi trường bị nhiễm độc do hóa chất, thuốc trừ sâu, tiaxạ…gây nên tình trạng nhiễm độc nguồn nước, thức ăn…và các chất độc nàygây đột biến nhiễm sắc thể, gây ung thư máu.2.1.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp [2]a/ Triệu chứng lâm sàng:- Cấp tính và sốt thường gặp nhất (50-60%)- Thiếu máu: da xanh, niêm mạc nhợt nhạt, trẻ mệt mỏi tim đập nhanh, khó thởđôi khi có biểu hiện suy tim.- Giảm bạch cầu trung tính: sốt, viêm loét niêm mạc miệng, nhiễm khuẩn.20- Giảm tiểu cầu: xuất huyết dưới da, chấm, nốt xuất huyết, bầm máu, chảy máuniêm mạc, đôi khi chảy máu nội tạng (tiêu hóa, nội sọ, phổi)- Gan, lách, hạch to.- Các triệu chứng khác có thể gặp do tế bào ác tính xâm lấn các cơ quan phì đạilợi răng, lồi mắt, tăng áp lực sọ não, sưng tinh hoàn, buồng trứng, có u trung thất,đau xương khớp…b/ Huyết đồ:- Hồng cầu giảm vừa đến nặng; hồng cầu đẳng sắc, đẳng bào.- Số lượng bạch cầu có thể thấp, bình thường hay tăng cao.- Tiểu cầu giảm khá rõ rệt ngay từ đầu.- Đa phần các tế bào blast ở máu ngoại vi trên phết lam máu, một số trườnghợp ít hoặc không có.c/ Tủy đồ:- Số lượng tế bào tủy tăng, song có thể bình thường hoặc giảm.-Tăng sinh rất nhiều lymphoblast, thường có thể tới 60-90% tế bào tủy.- Có hiện tượng lấn át các tế bào tủy bình thường.- Hình thái học tế bào dựa vào phân loại FAB.- Nhuộm hóa mô tế bào.2.2.Chẩn đoán và phân loại dưới nhóm bệnh BCC bằng DAMDTB[2]2.2.1. DAMDTB đặc trưng cho các loại tế bào nonĐiều quan trọng trong chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp là xác định quần thể tếbào non (còn gọi là tế bào blast). Đa số các tế bào non có nguồn gốc từ dòng tủy(như myeloblast, monoblast,erythroblast, megakaryoblast) đều có chung 1 số đặcđiểm về DAMDTB như CD34, HLA.DR và CD38, CD117 rất cao. Đối với dònglympho, các dấu ấn non bao gồm: CD34, CD38, CD10, TdT. Ngoài các dấu ấn kểtrên còn có thể thấy sự hiện diện của HLA.DR và CD1a trên tế bào non dònglympho T.Hình 9: Vị trí các quần thể tế bào non ác tính trên biểu đồ SSC-CD45(quần thể tế bào non màu đỏ - P1, bên trái là 1 ca bệnh BCC dònglympho, ở giữa và bên phải là 2 ca bệnh BCC dòng tủy) ( Nguồn: Bộ phậnDAMDTB, bệnh viện TMHH)21Quan sát trên biểu đồ SSC-CD45 có thể thấy lymphoblast có nồng độ CD45thay đổi từ âm tính đến trung bình, trong khi SSC luôn giữ ở mức thấp, myeloblastcó đặc tính SSC thay đổi từ thấp đến cao và CD45 thường mạnh hơn lymphoblast.Việc chẩn đoán bệnh dựa vào việc so sánh với đồ thị điểm của người bìnhthường.Bất thườngBình thường2.2.2. Đặc điểm DAMDTB của bệnh BCC dòng lympho BDAMDTB trên tế bào lympho B thay đổi qua năm giai đoạn khác nhau.Trong đó DAMDTB xuất hiện sớm và nồng độ ổn định từ đầu dòng đến cuối dònglà cyCD19, cyCD22, smCD22, HLA.DR. Các dấu ấn trưởng thành hơn là CD20,22cyIgM, smIgM, Igk hoặc Ig..Tương bào là một giai đoạn đặc biệt của dòng Bkhông có CD22 và CD20. CD19 và CD45 rất yếu, thường đặc trưng bởi CD38 vàCD138 với nồng độ cao.Tế bào non của bệnh BCC của dòng lympho B có những đặc điểm sau: cómột hoặc nhiều dấu ấn non như TdT, CD34, CD10, CD38, không có chuỗi nhẹ κhoặc λ trên bề mặt, không có CyIgµ ở giai đoạn sớm. Không có dấu ấn CD79btrên bề mặt, mà chỉ có dấu ấn CD79a trên bào tương, nồng độ CD45 có thể thayđổi từ âm tính đến trung bình.Từ năm 1976, người ta đã đưa ra tiêu chẩn đoán và phân loại dưới nhómcủa bệnh BCC dòng lympho B dựa vào DAMDTB phải có sự hiện diện của cáckháng nguyên liên quan đến dòng B bên cạnh các dấu ấn non, đồng thời khôngxuất hiện các dấu ấn đặc trưng của các dòng khác.DAMDProB-AllTdTCd34CD10Cd19CD20CD22CyIgµsmIg-CD79HLA-DR+++++_++++Common++++++++++++Pre-B-AlltransilitionMature+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++Bảng 1: Bảng phân loại dưới nhóm BCC dòng lympho B dựa vào DAMD-: 75% quần thể tế bào non ác tín23Hình 10: Sơ đồ phát triển DAMDTB bình thườngcủa tế bào dòng lympho B2.2.3. Đặc điểm DAMDTB của bệnh BCC dòng lympho TCác tế bào non dòng lympho T trước hết phải mang dấu ấn đặc hiệu củadòng lympho T là cyCD3, kế đến phải có một hoặc nhiều các dấu ấn dòng T khác(CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8) và một hoặc nhiều các dấu ấn non (CD34.TdT, HLA.DR, CD1a, CD10).Tế bào lympho T có 3 giai đoạn phát triển chính:- Giai đoạn sớm (hay trước tuyến ức): xảy ra ở tủy xương, tế bào được gọi làtiền tế bào T (Pro-T), hiện diện chủ yếu cyCD3 và CD7. Các dấu ấn khác nhưCD3, CD4, CD8...chưa thấy xuất hiện.- Giai đoạn giữa: xảy ra ở vỏ tuyến ức, tế bào T được gọi là tế bào tuyến ức(T-thymocyte). Đặc trưng là sự xuất hiện của CD1a+, khi tế bào rời khỏi tuyến ứcsẽ không còn CD1a. Các dấu ấn khác lần lượt xuất hiện như: CD3 yếu, CD4+,CD8+, CD2+, CD5+,...Ở giai đoạn này, sự phối hợp giữa CD4 và CD8 tạo ranhiều kiểu hình khác nhau: CD4-CD8, CD4+CD8+, CD4+CD8-.-Giai đoạn trễ: bắt đầu xảy ra ở tủy ức, tế bào xuất hiện tương đối đầy đủ cácDAMDTB của dòng lympho T. Đồng thời dựa trên CD4 và CD8, có sự tách biêt24thành 2 nhóm kiểu hình: CD4+CD8- và CD8+CD4-, các tế bào này rời khỏi tuyếnức đi vào tủy xương, biệt hóa thành hai loại tế bào: T giúp đỡ (CD3+CD4+CD8-)và T gây độc (CD3+CD4-CD8+).Hình 11:Sơ đồ phát triển DAMDTB bình thườngcủa tế bào dòng lympho T2.2.4. Đặc điểm DAMDTB của bệnh BCC dòng tủy25

Tài liệu liên quan

Một số kỹ thuật phân tích dùng trong hoạt động kinh doanh ngoại tệ trên thị trường hối đoái
- 18
- 677
- 3
Kỹ thuật phân tích các báo cáo tài chính công ty
- 23
- 581
- 2
Tài liệu Kỹ thuật phân tích dự báo trong kinh doanh ngoại tệ trực tuyến pptx
- 18
- 570
- 1
Báo cáo " ứng dụng kỹ thuật phân tích phân tử để xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong thí nghiệm xử lý ô nhiễm dầu bằng phương pháp sinh học" doc
- 8
- 811
- 0
Đề tài: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và ứng dụng pot
- 25
- 1
- 5
LUẬN VĂN: Bằng chứng kiểm toán và phương pháp kỹ thuật phân tích để thu thập bằng chứng kiểm toán trong quy trình kiểm toán báo cáo tài chính docx
- 32
- 631
- 0
Nghiên cứu chế tạo các điện cực chọn lọc ion nitrat, nitrit và amoni tiếp xúc rắn và ứng dụng chúng làm detector trong kỹ thuật phân tích dòng chảy (FIA)
- 27
- 921
- 1
Báo cáo nghiên cứu khoa học: " KỸ THUẬT PHÂN TÍCH WAVELETS KẾT HỢP VỚI FUZZY LOGIC ĐỂ NHẬN DẠNG NHIỄU TRONG HỆ THỐNG ĐIỆN" doc
- 7
- 702
- 0
Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 ở tế bào ối bà mẹ mang thai nghi hội chứng Down
- 56
- 356
- 0
Báo cáo khoa học: "ảNH HƯởNG CủA Độ CAO MÔI TRƯờNG KHAI THáC TớI CáC THÔNG Số Kỹ THUậT Và KINH Tế CủA ĐộNG CƠ ĐốT TRONG" pptx
- 4
- 495
- 1