Giải Trình Tự Protein - BioMedia Vietnam Group

BioMedia

Giải trình tự Protein

Giải trình tự protein là kỹ thuật xác định trình tự các axit amin, cấu tạo nên protein có hoạt tính và mức độ tạo phức với phân tử khác. Khám phá cấu trúc và chức năng của protein trong cơ thể sống là công cụ quan trọng để tìm hiểu những chu trình tế bào với mục đích tìm ra con đường chuyển hóa và đích đến cho các loại thuốc.

Hai phương pháp giải trình tự trực tiếp protein là phương pháp khối phổ và phản ứng Edman sequencing. Có thể tạo ra một chuỗi axit amin suy biến từ các trình tự ADN hoặc mARN mã hóa các protein. Tuy nhiên, có rất nhiều phương pháp khác có thể được sử dụng tìm ra trình tự protein và được sử dụng rộng rãi so với mục đích giải trình tự hoặc để khắc phục những bất cập của các phương pháp trên.

Máy giải trình tự (Protein sequencer)

Máy giải trình tự protein sử dụng để xác định trình tự các axit amin cấu tạo nên protein, bằng phương pháp gắn thẻ và loại bỏ một axit amin tại một thời điểm khác nhau, sau đó phân tích, xác định loại protein đó. Việc loại bỏ này diễn ra cho đến khi kết thúc chuỗi polypeptide, đồng thời toàn bộ trình tự hoàn chỉnh được thiết lập.

Phương pháp này được thay thế bằng phương pháp giải trình tự acid nucleic (là một phương pháp đơn giản, khi xác định được trình tự ADN có thể dự đoán trình tự protein suy biến một cách dễ dàng).

Nguồn ảnh: http://www.peptideatlas.org/

Xác định thành phần acid amin

Xác định thành phần acid amin của một protein với mục đích tìm ra trình tự của protein, nhờ đó có thể phát hiện ra sai sót trong quá trình giải trình tự hoặc để phân biệt giữa các kết quả không rõ ràng. Hiểu biết về tần số của các axit amin nhằm chọn protease sử dụng cho phân cắt protein. Phương pháp phân tích axit amin được thực hiện với các bước như sau:

1. Thủy phân một lượng đã biết của protein tạo ra các axit amin cấu thành của nó.
2. Sử dụng nhiều phương pháp phân tách và định lượng các axit amin được thủy phân.

Thủy phân

Mẫu protein được đun nóng trong axit hydrochloric 6M ở 100-110°C trong thời gian 24 giờ hoặc lâu hơn. Đối với protein chứa nhiều nhóm kỵ nước kích thước lớn cần thời gian làm nóng lâu hơn. Tuy nhiên, dưới điều kiện mạnh này một số axit amin (serine, threonine, tyrosine, tryptophan, glutamine, và cysteine) sẽ bị phân hủy. Để giải quyết vấn đề này, bằng phương pháp hóa sinh có thể thiết lập các quá trình làm nóng mẫu riêng biệt cho những thời điểm khác nhau, phân tích kết quả cho từng thời điểm và suy ra trình tự ban đầu. Rastall đã đề xuất các chất phản ứng để ngăn chặn hoặc giảm thiểu sự phân hủy của acid amin, chẳng hạn như thuốc thử thiol hoặc phenol để bảo vệ tryptophan và tyrosine không bị tác động bởi clo, và cysteine không bị oxy hóa. Ông cũng trình bày cách đo lượng ammonia thu được để xác định mức độ thủy phân amide.

Phân tách

Các axit amin có thể được phân cách bằng sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký tương tác kỵ nước. Một ví dụ cụ thể như NTRC sử dụng polystyrene sunfonat như một lớp đệm, sau đó thêm các acid amin nằm trong dung dịch acid và cho các đệm làm tăng pH một cách từ từ qua cột. Amino axit sẽ được tách rửa khi pH đạt điểm đẳng điện của chúng. Những kỹ thuật sau này có thể được ứng dụng thông qua việc sử dụng phương pháp sắc ký pha đảo. Trong các cột thương mại C8 và C18 chứa silica bán sẵn đã tách thành công các axit amin trong dung dịch trong vòng chưa đầy 40 phút thông qua việc sử dụng đệm tách, rửa tối ưu.

Phân tích định lượng

Khi các axit amin được tách ra, việc định lượng tương đối chúng được xác định bằng cách thêm hóa chất, là một dẫn xuất có màu. Nếu số lượng các axit amin vượt quá 10 nmol, ninhydrin có thể được sử dụng cho việc này; ninhydrin chuyển màu vàng khi phản ứng với proline và màu tím với các axit amin khác. Nồng độ của axit amin tỷ lệ thuận với độ hấp thụ của dung dịch. Với số lượng rất nhỏ, giảm đến 10 pmol, fluorescamine có thể được sử dụng như một điểm đánh dấu: Khi phản ứng với axit amin tạo ra dẫn xuất huỳnh quang.

Phân tích axit amin đầu N

Việc xác định axit amin tạo thành đầu N của một chuỗi peptide có vai trò quan trọng trong để hỗ trợ việc xác định các trình tự các đoạn peptide thành một chuỗi protein hoàn chỉnh, và vì vòng đầu tiên của sự thoái hóa Edman (Edman degradation) thường bị lẫn bởi các tạp chất và do đó không thể xác định chính xác các axit amin đầu N. Phương pháp phân tích axit amin đầu N như sau:

1. Peptide phản ứng với một thuốc thử, chất này sẽ là chất đánh dấu chọn lọc cho các axit amin ở phía cuối.
2. Thủy phân protein.
3. Xác định các axit amin bằng phương pháp sắc ký và so sánh với các thang chuẩn.

Có rất nhiều thuốc thử khác nhau mà có thể được sử dụng để đánh dấu axit amin ở cuối. Tất cả các chất đều phản ứng với các nhóm amin và do đó cũng sẽ liên kết với nhóm amin trong chuỗi bên của các axit amin như lysine – do vậy điều đó là cần thiết để lựa chọn chất phù hợp cho việc tinh sạch sắc ký ở các bước sau. Các thuốc thử được sử dụng phổ biến như thuốc thử Sanger (1-fluoro-2,4-dinitrobenzene) và các dẫn xuất dansyl như dansyl clorua. Phenylisothiocyanate, thuốc thử được sử dụng hỗ trợ cho phương pháp giải trình tự Edman.

Hình: Phương pháp Sanger cho phân tích nhóm peptide cuối: A. dẫn xuất của đầu N với thuốc thử Sanger (DNFB) B. thủy phân acid tổng số của peptide dinitrophenyl

(Nguồn ảnh: https://en.wikipedia.org)

Các vấn đề đặt ra trong việc xác định thành phần acid amin, không có thuốc nhuộm nào phù hợp, hoặc thuốc thử chỉ tạo ra các dẫn xuất màu và phân tích định tính. Vì vậy, các axit amin không được phân tách bằng sắc ký cột. Để giải quyết vấn đề này, với nhóm amin có phản ứng với thuốc thử, không phân tách được bằng sắc ký trao đổi ion, có thể thay thế bằng sắc ký bản mỏng hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Phân tích acid amin đầu C

Phương pháp phân tích axit amin đầu C ít hơn so với số lượng các phương pháp phân tích đầu N. Phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là khử nhóm carboxyl của các acid amin đầu C của protein bằng enzyme cacboxypeptidase, tiến hành thực hiện phản ứng khử mẫu lấy ra trong các khoảng thời gian khác nhau đều đặn và xác định các axit amin đầu cuối bằng cách phân tích đồ thị của nồng độ acid amin theo thời gian. Phương pháp này rất hữu ích trong trường hợp polypeptide và protein được khóa bởi đầu N. Trình tự acid amin đầu C góp phần quan trọng trong việc xác định các cấu trúc cơ bản của protein đã dự đoán từ các trình tự ADN và phát hiện các sai khác trong quá trình sau dịch mã (Post-translational) từ chuỗi codon đã biết.

Sự thoái biến Edman

Sự thoái biến Edman là một phản ứng rất quan trọng đối với trình tự protein, nó cho phép giải mã các thành phần acid amin của một protein. Phương pháp giải trình tự tự động Edman được sử dụng rộng rãi, với độ dài chuỗi polypeptide đọc được là 50 acid amin. Giải trình tự protein bằng phương pháp Edman thực hiện theo các bước.

1. Phá vỡ cầu disulfide ở protein với chất khử 2-mercaptoethanol bổ sung axit iodoacetic ngăn chặn liên kết lại ở các cầu disulfide
2. Tinh sạch chuỗi riêng lẻ của các phức hợp protein.
3. Xác định các thành phần axit amin của mỗi dãy.
4. Xác định các axit amin đầu cuối của mỗi dãy.
5. Phá vỡ từng dãy thành các mảnh có độ dài nhỏ hơn 50 axit amin.
6. Phân tách và làm sạch các đoạn.
7. Xác định trình tự của từng đoạn.
8. Lặp lại quy trình với từng kiểu phân cắt khác nhau.
9. Xây dựng trình tự của các protein tổng thể.

Sự biến tính các đoạn peptide

Trong phương pháp giải trình tự Edman những peptide dài hơn 50-70 axit amin khó có thể xác định trình tự đáng tin cậy. Vì vậy, các protein có kích thước lớn được chia thành các mảnh nhỏ và được lắp ráp lại sau khi có trình tự của các mảnh. Phản ứng thủy phân sử dụng các chất có hoạt tính endopeptidases (Peptide hóa bên trong) như trypsin, pepsin, thuốc thử hóa học có thể kể đến cyanogen bromide. Các enzyme khác nhau sử dụng cho phản ứng thủy phân khác nhau, phản ứng cắt sinh ra các đoạn chồng chéo lên nhau, dựa vào việc giải trình tự những đoạn này để xây dựng hoàn chỉnh chuỗi protein.

Các phản ứng thoái biến Edman

Các peptide được hấp thụ bằng một bề mặt rắn, sử dụng chất nền sợi thủy tinh tráng polybrene (là một cation polyme). Các peptide được hấp phụ trong dung dịch đệm chứa 12% Trimethylamine và phenylisothiocyanate. Các nhóm acid amin đầu N phản ứng với phenylisothiocyanate (PITC).

Các acid amin đầu cuối có thể được chọn lọc tách ra bằng cách bổ sung axit khan. Các dẫn xuất sau đó được isomerises hóa và liên kết với phenylthiohydantoin, sau đó có thể được rửa sạch và xác định bằng sắc ký, và quá trình được lặp lại nhiều lần. Hiệu quả của từng bước lên đến 98%, có thể xác định độ dài chuỗi polypeptid nằm khoảng 50 axit amin với độ tin cậy cao.

Hạn chế của sự thoái biến Edman

Tuy vậy kỹ thuật này gặp trở ngại khi đầu N tận cùng của phân tử protein bị cải biến về mặt hóa học (ví dụ các nhóm acetyl hoặc formyl), hiện tượng có thể xảy ra tự nhiên trong điều kiện in vivo, hoặc trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein. Để khắc phục hiện tượng này, người ta có thể sử dụng protease để cắt chuỗi polypeptit và phân tích trình tự bên trong chuỗi.

Khối phổ

Khối phổ là phương pháp phân tích protein được phổ biến trong những năm gần đây. Khối phổ được dùng để xác định các vùng trình tự protein khác nhau. Khối phổ là phương pháp xác định chính xác khối lượng của các các phân tử nhỏ.

Vào năm 2002, John Bennett Fenn đã đươc trao giải Nobel Hóa học với phát minh ion hóa các phân tử sinh học bằng điện, phát minh này đã đóng góp một phần quan trọng trong hoàn thiện cấu tạo máy khối phổ.

Đầu tiên, phân tử protein được cắt thành các đoạn peptit có trình tự ngắn (dưới 20 axit amin) nhờ sử dụng enzym đặc hiệu endoprotease, chẳng hạn như trypsin. Phân tử cần phân tích phân cực đến một cực cao khiến chuỗi peptid phân mảnh và ion hóa thành các ion đơn cho bay qua khối phổ kế (trong điều kiện chân không) ở điều kiện này tốc độ di chuyển của nó tương quan với tỉ số khối lượng / điện tích. Trên cơ sở này người ta có thể đo được thời gian bay của phân tử và xác định được khối lượng của nó. Phổ khối lượng được phân tích bằng máy tính và thường được so sánh với dữ liệu của protein xếp theo trình tự trước đó để xác định trình tự của các đoạn. Quá trình này được lặp đi lặp lại với enzyme cắt ở các đoạn khác nhau và chồng chéo lên nhau trong chuỗi với mục đích xây dựng trình tự chuẩn của protein cần nghiên cứu.

Dịch và tổng hợp từ WIKIPEDIA

BioMedia VN