KHẢO SÁT ENZYME - Tài Liệu Text - 123doc

Có thể bạn quan tâm

Tải bản đầy đủ (.pdf) (10 trang)

Trang chủ

Giáo Dục - Đào Tạo

Cao đẳng - Đại học

KHẢO SÁT ENZYME

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (452.69 KB, 10 trang )

Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa 50CHƯƠNG 6. KHẢO SÁT ENZYME 6.1. KHÁI QUÁT Enzyme là những chất có bản chất là protein, đóng vai trò là chất xúc tác sinh học, xúc tác cho các phản ứng sinh hóa xảy ra trong cơ thể. Enzyme có tính đặc hiệu cao và có hiệu lực xúc tác lớn. Enzyme có trong tế bào của các cơ thể sống, nhờ sự hiện diện của enzyme mà các phản ứng sinh hóa trong cơ thể xảy ra rất nhanh, nhạy ở điều kiện sinh lý bình thường của cơ thể sống. 6.2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME AMYLASE TỪ MẦM LÚA 6.2.1. Hệ enzyme amylase Amylase là hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm các enzyme thủy phân (hydrolase), chuyên xúc tác sự phân giải các liên kết glycoside trong phân tử polysaccharide với sự tham gia của nước. - Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. - Sản phẩm của sự thủy phân do amylase xúc tác là các thành phần đơn giản hơn như dextrin, maltose, glucose. - Enzyme amylase có từ nhiều nguồn như: trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nẩy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. - Tùy theo tính chất và khả năng tác dụng, người ta phân biệt: α- amylase, β - amylase và γ- amylase. α - Amylase (EC 3.2.1.1) - Không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên, song với tốc độ rất chậm. - Có khả năng phân cắt các liên kết 1-4 glycoside nằm ở phía trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen) một cách ngẫu nhiên. - Sản phẩm của sự thủy phân tinh bột nhờ α-Amylase là các dextrin có phân tử lượng thấp (không có màu với iod), một ít maltose và rất ít glucose. - pH tối thích cho α-amylase mầm lúa là 5,3 - Nhiệt độ tối thích: 58-60OC - α-Amylase được hoạt hóa bởi Ca2+, Cl- và bị ức chế bởi Cu2+, Ag+, Hg2+. β - Amylase (EC 3.2.1.2) - Chỉ thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột, cụ thể β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và 54-58% amylopectin. - Có khả năng phân cắt liên kết α-1-4 glycoside từ các đầu không khử của các nhánh ngoài cùng, sự phân cắt sẽ dừng lại ở 1 vùng gần nhánh (liên kết 1-6) trong phân tử amylopectin. - pH tối thích 4,5 - Nhiệt độ tối thích: 50OC - β- Amylase được kích thích bởi Na+, bị ức chế bởi Cu2+, Hg2+, urea, iodoacetamide, iod, ozon. Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa 51γ - Amylase (EC 3.2.1.3) - Có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1-4 lẫn α-1-6 glycoside tuần tự từng gốc glucose. - Sản phẩm thủy phân là glucose. - pH tối thích là 3,5 - 5,5 - Chất kích thích γ-Amylase là Ca2+, Na+, Cl- và chất ức chế là Cu2+, Hg2+. - Kém bền dưới tác dụng của rượu ethylic, aceton. Trong bài thí nghiệm chúng ta dùng phức hệ amylase của mầm lúa để khảo sát sự thủy phân dung dịch hồ tinh bột. 6.2.2. Sự tạo màu giữa iod với tinh bột và các chuyển hóa của tinh bột khi thủy phân bằng amylase Phức hệ amylase của mầm lúa có khả năng thủy phân tinh bột lần lượt thành các sản phẩm sau: Tinh bột (màu xanh với iod) → Amylodextrin (màu tím với iod), Erythrodextrin (màu tím đỏ với iod) → Acrodextrin (không kết hợp với iod nên không cho màu) → Maltodextrin (không kết hợp với iod) → Maltose và glucose (không kết hợp với iod). Dựa vào sự biến đổi màu này đến khi sản phẩm thủy phân không cho màu với iod, ta có thể kết luận phản ứng thủy phân đã kết thúc. Hóa chất - Hồ tinh bột 1% - Dung dịch đệm pH từ 2-8 - Dung dịch iod 1% - Dung dịch CuSO4 2% - Dung dịch CaCl2 1% 6.2.3. Ly trích và khảo sát hoạt tính tương đối của amylase mầm lúa 6.2.3.1. Ly trích amylase Dùng khoảng 100 hạt lúa nẩy mầm cho vào cối sứ, nghiền nhuyễn với 3-5mL nước cất. Tiếp tục nghiền và thêm dần đến hết 50 mL nước cất để hòa tan enzyme. Lọc dung dịch qua rây bằng giấy lọc hoặc ly tâm 5.000-10.000 vòng/phút trong 15 phút. Thu dịch lọc có chứa enzyme amylase. Giữ lại để tiến hành thí các nghiệm sau. 6.2.3.2. Khảo sát hoạt tính tương đối của dịch chiết amylase mầm lúa Dung dịch amylase thu được thường có hoạt tính xúc tác ít ổn định. Nó thay đổi tùy theo vào điều kiện thí nghiệm và các yếu tố môi trường. Do đó ta cần phải khảo sát hoạt tính tương đối của dung dịch enzyme amylase và chọn nồng độ thích hợp cho các thí nghiệm sau. Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa 52Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm theo bảng sau: Ống nghiệm Dung dịch cho vào1 2 3 4 5 6 7 8 Hồ tinh bột 1% (mL) Nước cất (mL) Dung dịch đệm pH 5 (mL) 1 0,4 2 1 0,6 2 1 0,8 2 1 1,0 2 1 1,2 2 1 1,4 2 1 1,6 2 1 1,8 2 Để ổn định ở 50OC Thể tích dịch enzyme (mL) 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 Thời gian kết thúc thủy phân Sau khi pha xong dung dịch, ổn định nhiệt độ bể nước nóng ở 50oC, sau đó cho các ống nghiệm từ 1 đến 4 vào ổn định 5 phút. Hút 1,6 mL dịch enzyme cho vào ống 1, đồng thời ghi nhận thời điểm đó. Dùng pipet loại 1 mL khuấy nhẹ dung dịch và lấy ra 1 giọt để thử màu với iod. Khi màu của dung dịch iod không thay đổi thì sự thủy phân tinh bột được coi là kết thúc. Ghi lại thời điểm kết thúc. Lần lượt tiến hành các ống còn lại tương tự như ống 1. Lưu ý: Sau khi kết thúc ống nghiệm 1, lấy ra khỏi bể nước nóng ta đưa ống 5 vào ổn định tiếp tục ở 50oC. - Ghi nhận thời gian, lập bảng kết quả, bình luận và vẽ đồ thị. - Chọn thể tích enzyme ở ống nghiệm nào có thời gian thủy phân tinh bột trung bình không nhanh không chậm ( ≈ 1 phút) cho các thí nghiệm kế tiếp. Lưu ý: * Cần lấy dung dịch chính xác, tránh nhầm lẫn. * Luôn giữ nhiệt độ ổn định 50OC khi tiến hành thí nghiệm. 6.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên tốc độ thủy giải của amylase Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm theo bảng sau: Ống nghiệmDung dịch cho vào 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ tinh bột tương ứng (mg/mL)Hồ tinh bột 1% (mL) Nước cất (mL) Dung dịch đệm pH 5 (mL) 2 0,4 1,6 2 3 0,6 1,4 2 4 0,8 1,2 2 5 1 1,0 2 6 1,2 0,8 2 7 1,4 0,6 2 8 1,6 0,4 2 Để ổn định ở 50OC Thể tích dịch enzyme (mL) Thể tích đã chọn ở thí nghiệm 1 Thời gian kết thúc thủy phân Tiến hành thí nghiệm tương tự như trên. Ghi nhận thời gian, lập bảng kết quả, bình luận và vẽ đồ thị. Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa 536.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên tốc độ thủy giải của amylase Enzyme rất nhạy với sự thay đổi của pH môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định, gọi là pH tối thích. Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm theo bảng sau: Ống nghiệm Dung dịch cho vào 1 2 3 4 5 6 7 Hồ tinh bột 1% (mL) Nước cất (mL) Giá trị đệm pH Thể tích dung dịch đệm pH (mL) 1 1 2 2 1 1 3 2 1 1 4 2 1 1 5 2 1 1 6 2 1 1 7 2 1 1 8 2 Để ổn định ở 50OC Thể tích dịch enzyme (mL) Thể tích đã chọn ở thí nghiệm 1 Thời gian kết thúc thủy phân Lưu ý: * Cần ổn định các ống nghiệm 3, 4, 5 (tương ứng với pH 4, 5, 6) trước ống 1, 2, 6, 7. Ghi nhận thời gian kết thúc phản ứng thủy phân của mỗi ống nghiệm. * Lập bảng kết quả, vẽ đồ thị và nhận xét. 6.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế Chất hoạt hoá là những chất có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành hoạt động, từ hoạt động yếu trở thành hoạt động mạnh hơn... Các chất hoạt hoá thường có bản chất hoá học rất khác nhau: các chất hữu cơ phức tạp, các chất có tác dụng phục hồi những nhóm chức của trung tâm hoạt động enzyme, một số cation, anion. Chất ức chế là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme. Các chất ức chế có bản chất hoá học rất khác nhau có thể là các ion kim loại, hoặc các chất hữu cơ phức tạp... Sau đây ta sẽ khảo sát những ảnh hưởng trên với dung dịch A (CaCl2) và B (CuSO4) là những dung dịch có chứa sẵn một số ion có khả năng gây kích thích hoặc ức chế sự xúc tác của amylase. Cách pha dung dịch được trình bày trong bảng sau: Ống nghiệm Dung dịch cho vào 1 2 3 Hồ tinh bột 1% (mL) Nước cất (mL) Dung dịch đệm pH=5 (mL) Chất gây ảnh hưởng A (mL) Chất gây ảnh hưởng B (mL) 1 1 2 0 0 1 0 2 1 0 1 0 2 0 1 Để ổn định ở 50OC Thể tích dịch enzyme (mL) Thể tích đã chọn ở thí nghiệm 1 Thời gian kết thúc thủy phân Ghi nhận thời gian, nhận xét, kết luận. Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa 546.3. KHẢO SÁT ENZYME UREASE TRONG BỘT ĐẬU NÀNH Nguyên tắc: Urease là enzyme có thể thủy giải urease theo phản ứng sau: (NH2)2CO + H2O → (NH4)2CO3 Nếu thêm formol vào môi trường, sẽ có phản ứng tạo thành hexamethylene tetramine và acid carbonic theo phản ứng sau: 2 (NH4)2CO3 + 6 HCHO → (CH2)6N4 + 6 H2O + H2CO3 Acid tạo thành có thể được định phân bằng kiềm và xác định lượng urea bị thủy giải, từ đó suy ra hoạt tính của enzyme urease. Hóa chất - Dung dịch N/20. - Dung dịch urea 2% (w/v). - Formol trung hòa. - Dung dịch urease: Khuấy 3 gam bột đậu nành trong 100 mL nước cất. Để yên trong 15 phút. Nước ở trên chứa nhiều urease. Đem lọc thu lấy dịch lọc. - Dung dịch phenolphtalein 1% trong alcol. Tiến hành Chuẩn bị các ống nghiệm theo bảng sau: Ống nghiệm 1 2 Thể tích dung dịch urea 2% (mL) 5 5 Thể tích dung dịch enzyme urease (mL) 5 0 Thể tích dd enzyme urease đã đun sôi (mL) 0 5 Ủ các ống nghiệm trên trong nước ấm ở 40oC trong 20 phút. Cho vào mỗi ống 5 mL formol đã được trung hòa, lắc đều trong vài phút. Lần lượt cho các dung dịch trong ống ra bình tam giác 100 mL, tráng ống với một ít nước cất. Định phân H2CO3 được giải phóng ra bằng dung dịch NaOH N/20 với phenolphtalein làm chỉ thị màu. Kết quả Hoạt tính enzyme urease được biểu thị bằng số mol urea bị thủy giải bởi lượng enzyme có trong 1 gam bột đậu nành trong thời gian 1 phút ở 40oC, hoạt tính được tính theo công thức sau: 20 x 103 x 2 x t x a x m(V1 - V2) x Amol/ g/ phút Trong đó: - V1: Số mL NaOH N/20 dùng định phân ống 1 - V2: Số mL NaOH N/20 dùng định phân ống 2 - a: Thể tích enzyme cho vào mỗi ống (mL) - A: Tổng thể tích enzyme thu được từ m gam bột đậu nành (mL) - t: Thời gian thủy phân (phút)

Tài liệu liên quan

KHẢO SÁT ENZYME
- 10
- 5
- 76
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT CỦA ENZYME BROMELIN THU ĐƯỢC TỪ PHẦN PHẾ LIỆU DỨA CHỒI NGỌN
- 12
- 861
- 12
Nghiên cứu sử dụng mủ đu đủ (enzyme papain) thủy phân cá tra chết để sản xuất phân hữu cơ sinh học và khảo sát hiệu lực trên rau ăn lá
- 52
- 497
- 1
Khảo sát ảnh hưởng của enzyme xylanase từ aspergillus niger lên đặc tính của bột và các thuộc tính về chất lượng của bánh mì
- 21
- 878
- 0
Khảo sát hệ enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò để phân giải rơm qua xử lý
- 79
- 135
- 0
Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu
- 92
- 80
- 0
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp của các chủng nấm purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở vũng tàu
- 78
- 104
- 0
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel từ chủng nấm mốc trichoderma SPP
- 86
- 212
- 0
Khảo sát hiệu quả của việc sử dụng chế phẩm enzyme termamyl 120l (α amylase) đến hiệu suất thuỷ phân tinh bột ở nồi gạo trong công nghệ sản xuất bia
- 113
- 520
- 0
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase thu nhận từ nấm mốc aspergillus aculeatus
- 77
- 408
- 0