Kit Realtime PCR Chẩn đoán Virus PED Gây Bệnh Tiêu Chảy Heo

Lượt xem: 412 PED gây bệnh gì trên heo?

• • Dịch tiêu chảy cấp tính trên lợn (Porcine Epidemic Diarrhea– PED) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ Coronaviridae gây ra. Ở Việt Nam, dịch PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ đó đến nay dịch bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn cả nước. 
  • Vi rút gây bệnh PED (PEDv) xâm nhập vào đường tiêu hóa, tấn công và phá hủy các tế bào nhung mao ruột non của lợn, làm cho lông nhung ruột hư hại, teo đi và ngắn hơn, dẫn đến giảm khả năng hoạt động của các men tiêu hóa trong ruột, giảm khả năng hấp thu dinh dưỡng trong thức ăn hay trong sữa (đối với lợn con).
  • Virus PED là virus thuộc nhóm 1, chi Alphacoronavirus, họ Coronaviridae. Hệ gene virus là RNA sợi đơn dương với kích thước khoảng 28kb, bao gồm đầu 5’ (UTR), đuôi 3’ poly A và có ít nhất 7 khung đọc mở (ORFs) mã hoá cho 4 protetin cấu trúc là Spike (S), envelope (E), membrane (M), nucleoprotein (N) và 3 protein không cấu trúc (replicase 1a, 1b và ORF3) được sắp xếp theo tứ tự 5’-Rep-S-ORF3- E-M-N-3’(Duarte and Laude, 1994; Duarte et al., 1994; Laude and Vautherot, 1993; Laude, 1994; Pensaert and De Bouck, 1978; Spaan et al., 1988).

• Có 2 chủng virus PED:
• – Chủng PED 1: chỉ nhiễm trên heo trong giai đoạn tăng trưởng
• – Chủng PED 2: nhiễm trên tất cả các loại heo, kể cả heo nái trưởng thành

– Virus tồn tại lâu trong môi trường và chất thải, dễ bị tiêu diệt bởi ánh sáng và chất sát trùng.

Cơ chế gây bệnh của Virus PED

Virus có trong phân, trên nền chuồng, trên da, lông heo mẹ. Virus lây nhiễm vào cơ thể heo qua đường miệng, sau đó nhân lên ở biểu mô ruột non, phá hủy hệ thống nhung mao ruột, làm giảm hoạt động của enzyme ở bề mặt biểu mô ruột, từ đó làm giảm sự hấp thu các chất dinh dưỡng và nước nên heo bị thiếu năng lượng, bị tiêu chảy và mất nước trầm trọng, đưa đến chết heo nhanh chóng. 

• Để phân biệt với tiêu chảy do vi khuẩn, thường bệnh xảy ra không ồ ạt, thời gian xuất hiện bệnh chậm, chỉ xảy ra trên một số ít heo trong bầy, hoặc chỉ một vài bầy trong toàn đàn bị tiêu chảy và có thể điều trị khỏi bệnh bằng kháng sinh.
• Trong khi đó, dịch tiêu chảy cấp do virus gây ra, tình trạng tiêu chảy nặng xuất hiện rất nhanh, chỉ 2-3 ngày đã lây cho toàn đàn, mọi lứa tuổi đều có thể bị bệnh kể cả heo nái. Biểu hiện đặc trưng là heo bị ói, tiêu chảy rất lỏng, màu hơi vàng, mùi hôi, có lẫn sữa không tiêu hóa. Heo nằm chồng đống lên nhau vì bị lạnh do thiếu năng lượng. Đối tượng bị ảnh hưởng nặng  nhất là heo con sơ sinh với tỷ lệ chết cao.

Triệu chứng

Lợn sữa bú ít hoặc bỏ bú. Lợn con bị tiêu chảy cấp, phân lỏng, tanh, màu trắng đục hoặc vàng nhạt, phân dính bết ở hậu môn. Lợn nôn mửa do sữa không tiêu; thân nhiệt giảm, lợn bị lạnh nên thường nằm lên bụng lợn mẹ cho ấm. Bệnh gây ra do virus nên điều trị kháng sinh không khỏi.

Phòng bệnh

– Lợn mẹ: tiêm phòng đầy đủ các loại vắcxin (bao gồm vắcxin PED)

– Lợn con: tiêm sắt

– Chuồng trại: Giữ chuồng ấm, khô, sạch

– Chống mất nước: Cho lợn uống chất điện giải hoặc tiêm xoang bụng dung dịch glucoza, nước muối sinh lý, lactat…

– Giảm nhu động ruột bằng cho uống nước lá chat (lá ổi hoặc trà bắc và vài lát gừng) hoặc tiêm Atropin.

– Cân bằng tập đoàn vi sinh đường ruột bằng cách bổ sung men tiêu hóa.

– Tùy nguy cơ bệnh kế phát có thể: Cho thuốc chống cầu trùng: Anticoc, Baycoc… hoặc cho uống thuốc kháng khuẩn đường ruột: Sulfamethoxazole, Trimethoprim, Colistin, Enronofloxacin, Oxytetrcyclin…

Phương pháp phát hiện PED

Hiện nay có rất nhiều phương pháp thử nghiệm sự hiện diện của vi rút gây bệnh trên thú y  như: các phương pháp phân lập và thử nghiệm sinh hóa truyền thống, quan sát máu dưới kính hiển vi, kit test nhanh [*],… Tuy nhiên hầu hết các phương pháp này đều mang lại kết quả có độ chính xác tương đối và thời gian thử nghiệm lâu, không phù hợp với các đơn vị sản xuất cần kết quả thử nghiệm có độ tin cậy, chính xác cao. 

Vì vậy, việc sử dụng phương pháp real- time PCR để kiểm tra sự hiện diện của tổ hợp nhiều loại vi rút gây bệnh  trên thú y chỉ thông qua một thí nghiệm sẽ giúp cải thiện được thời gian, độ nhạy và độ đặc hiệu cao.  

PED RT qPCR Visikit

Sản phẩm PED RT qPCR Visikit được sử dụng phổ biến trong phương pháp này mang lại giá trị thử nghiệm đạt độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong phát hiện vi rút gây bệnh.  Đối với phương pháp real- time PCR sử dụng bộ kit PED RT qPCR Visikit yêu cầu phải trang bị một số thiết bị phục vụ cho việc phát hiện mầm bệnh như máy real- time PCR, máy ly tâm, tủ bảo quản và một số vật tư tiêu hao thông thường,…cùng đội ngũ kỹ thuật viên được đào tạo về chuyên môn cũng như kỹ năng.

Visitech sẽ giúp bạn giải quyết tất cả các vấn đề trên để mang lại hiệu quả công việc và lợi nhuận tốt nhất. Chúng tôi sẽ lựa chọn cho bạn một giải pháp tốt nhất phù hợp với yêu cầu của bạn. 

Điều kiện lưu trữ

-200C

Tên sản phẩm

PED RT qPCR Visikit

Mã sản phẩm

ANIFR- 12

Nhà sản xuất

Visitech- Việt Nam

Hạn sử dụng 

12 tháng kể từ ngày sản xuất

Thành phần bộ kit

Thành phần	Quy cách
	50 test
PED RT qPCR mix	64×20µL
Chứng dương PED	1×100 µL
Chứng âm	1x1mL

Hướng dẫn sử dụng

Chuẩn bị mẫu

✓ Mẫu swab trực tràng: Dùng gạc hoặc tăm bông vô trùng ngoáy trực tràng , sau đó đựng trong ống vô trùng, bổ sung 2 mL dung dịch bảo quản PBS.

✓ Mẫu phân: Lấy 1 g phân cho vào tube chứa 9 mL dung dịch PBS, vortex mẫu cho tan hoàn toàn phân trong dung dịch.

✓ Mẫu mô hỗng tràng (ruột non): Nghiền 200 mg mẫu mô ruột trong 1 mL dung dịch PBS và bảo quản cho đến khi tách chiết.

✓ Mẫu môi trường:

o Khu vực lấy mẫu: Nền, chuồng trại, máng thức ăn, dụng cụ thiết bị chăn nuôi

o Lấy mẫu: Dùng tăm bông vô trùng chà xát bề mặt môi trường xung quanh theo chiều zizac, sau đó cho tăm bông cho vào tube chứa sẵn 500 μL dung dịch đệm.

Lưu ý:

– Mẫu sau khi lấy nên vận chuyển trong điều kiện lạnh 4-8 oC và bảo quản ở tủ đông cho đến khi tiến hành xét nghiệm.

Tách chiết RNA

✓ Bộ Genomic DNA/ RNA Extraction Visikit (GEKA- 01 ) được khuyến cáo sử dụng cho tách chiết RNA virus từ mẫu mô, bộ Fluid Viral Extraction Visikit (FEKA- 50) cho tách mẫu swab trực tràng và mẫu môi trường. Bộ Stool DNA Extraction Visikit (….) cho tách mẫu phân. Qui trình thực hiện xem theo HDSD của các bộ kit kể trên.

Thực hiện phản ứng Realtime RT- PCR:

✓ Lấy đúng số lượng ống PED rPCR Mix cần thiết, rã đông bằng cách để ở nhiệt độ phòng, sau đó spindown để toàn bộ chất lỏng di chuyển xuống đáy.

✓ Hút 5 μL RNA mẫu, chứng âm tách chiết, chứng dương cho vào các tube PED rRT- PCR mix đã chuẩn bị ở trên.

Chú ý:

– Mỗi lần chạy nên có ít nhất 1 chứng âm tách chiết, 1 chứng dương và 1 chứng âm PCR.

– Chuẩn bị phản ứng theo thứ tự sau: Chứng âm, chứng âm tách chiết, mẫu và chứng dương.

✓ Đóng nắp PCR và spindown để chất lỏng di chuyển xuống đáy trước khi đặt vào máy. Chọn kênh màu FAM cho PED và kênh màu HEX cho chứng nội.

Cài đặt chương trình nhiệt như bên dưới:

1 chu kỳ:	45oC	15 phút
1 chu kỳ:	95oC	3 phút
45 chu kỳ:	95oC	10 giây
	60oC	30 giây (chọn đọc tín hiệu ở bước này)

Phân tích kết quả ✓ Mẫu âm tính với PED: chỉ có đường biểu diễn huỳnh quang HEX của chứng nội vượt lên khỏi ngưỡng tín hiệu

✓ Không xuất hiện tín hiệu nào, kể cả màu HEX: Phản ứng real- time RT- PCR bị ức chế, do đó không thể kết luận được là mẫu âm tính hay dương tính. Tiến hành pha loãng mẫu 10 lần hoặc tách lại RNA.

✓ Mẫu dương tính với PED: đường biểu diễn huỳnh quang FAM, HEX cùng vượt lên khỏi ngưỡng tín hiệu. Trong 1 số trường hợp mẫu dương tính mạnh với trình tự mục tiêu, đường biểu diễn huỳnh quang HEX có thể nằm dưới ngưỡng tín hiệu.

Bảng tóm tắt phân tích kết quả

STT	PED (FAM)	IC (HEX)	Kết luận
1	–	+	Mẫu âm tính PED
2	+	+/-	Dương tính PED
3	–	–	Không thể kết luận

Xử lý sự cố

Sự cố	Nguyên nhân	Khắc phục
Không xuất hiện tín hiệu nào ở tất cả các giếng, kể cả chứng dương	Cài đặt sai chương trình qPCR Khai báo vị trí và thông số giếng sai Thiết bị qPCR gặp sự cố Hóa chất của kit không được bảo quản theo đúng chỉ định	Kiểm tra lại chương trình chạy qPCR Kiểm tra lại thông tin các giếng Kiểm tra lại hoạt động của thiết bị qPCR Kiểm tra lại điều kiện bảo quản và hạn sử dụng của kit
Chứng dương bình thường mẫu xét nghiệm không cho tín hiệu vượt ngưỡng nào, kể cả màu HEX	Hàm lượng DNA thu được quá cao Có chất ức chế trong mẫu	Pha loãng 10 lần dịch DNA và thực hiện lại phản ứng PCR Bổ sung một lượng nhỏ chứng dương mục tiêu vào mẫu tách chiết. Nếu kết quả vẫn âm tính thì kết luận có chất ức chế trong mẫu. Tiến hành tách chiết lại hoặc xử lý như cách 1
Tín hiệu FAM, HEX vượt ngưỡng trong chứng âm, chứng âm tách chiết	Micropipet bị nhiễm DNA mục tiêu hoặc sản phẩm PCR Hóa chất PCR bị nhiễm DNA mục tiêu hoặc sản phẩm PCR Môi trường làm việc bị nhiễm DNA mục tiêu hoặc sản phẩm PCR	Vệ sinh hoặc thay micropipet mới; sử dụng filter tip Sử dụng hóa chất PCR khác Yêu cầu bộ phận kỹ thuật đến vệ sinh môi trường làm việc.

Visitech- Nhà sản xuất Kit PCR chất lượng cao

Ngoài việc phát hiện PED trên gia súc, Visitech chúng tôi còn cung cấp thêm các kit qPCR phát hiện các loài virus, vi khuẩn gây bệnh trên thú y theo link danh mục sau: 

https://visitech.vn/danh-muc-san-pham/kit-test/kit-pcr/

Khi truy cập vào link này, chúng ta sẽ thấy thêm rất nhiều loại Kit cũng thường xuyên được sử dụng. Ví dụ như: Kit qPCR CDV [*] để phát hiện bệnh trong nhóm thú y. Hay Kit ASFV gây bệnh trên heo [*] hay Kit qPCR JEV [*] để phát hiện JEV gây bệnh trên heo  và còn rất nhiều Kit khác…

Đặc biệt, ngoài việc cung cấp hóa chất cho phát hiện bệnh, Visitech cũng đem đến cho Qúy khách hàng một giải pháp tổng thể và đầy đủ về các trang thiết bị, vật tư tiêu hao cho một phòng thử nghiệm PCR, realtime PCR đạt chuẩn. Mời Qúy khách hàng tham khảo Link bên dưới: https://visitech.vn/danh-muc-san-pham/sinh-hoc-phan-tu/ 

Tại sao nên chọn Visikit

Visitech tự hào là đơn vị tư nhân với nhiều năm kinh nghiệm trong nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó lĩnh vực sinh học phân tử là một trong những thế mạnh của chúng tôi. 

Chúng tôi cam kết đưa đến tay khách hàng sản phẩm đạt chất lượng theo tiêu chuẩn ISO 13485 năm 2016, là tiêu chuẩn ISO về hệ thống quản lý an toàn cho sản phẩm.

Bên cạnh đó, Visitech có đội ngũ R & D có chuyên môn cao và giàu kinh nghiệm, luôn nghiên cứu, trau dồi để chọn lọc và đưa ra sản phẩm tốt nhất đến tay người sử dụng. 

Đặc biệt, công ty chúng tôi có hàng DEMO để chạy thử nghiệm nhằm chứng minh chất lượng đối với những khách hàng có nhu cầu. Kỹ sư chúng tôi sẽ trực tiếp hướng dẫn và training cho tới khi thành thạo.

Thông tin liên hệ Visitech 

Trên đây là những thông tin chi tiết về Kit PCR phát hiện PED của Visitech mà chúng tôi biên soạn. Hy vọng những chia sẻ trên sẽ mang đến cho Quý Khách hàng những thông tin bổ ích. 

Visitech chúng tôi tự tin và tự hào với đội ngũ nhân viên có nhiều năm kinh nghiệm về lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là các xét nghiệm liên quan đến phát hiện virus, vi khuẩn trong thực phẩm, thủy sản, thú y…Chúng tôi luôn trên tinh thần sẵn sàng được tư vấn chi tiết, giải đáp thắc mắc và hỗ trợ mọi ý kiến của Qúy khách hàng. Hãy liên hệ ngay với chúng tôi theo địa chỉ bên dưới:

• Email: info@visitech.vn
• Hotline: 0919112141
• Zalo: 0919112141
• Website: https://visitech.vn/
• Map: Công ty TNHH Khoa Học Kỹ Thuật Việt Sinh 
• Kênh Youtube: Visitech
• Fanpage: Visitech