Kỹ Thuật Kháng Sinh đồ MIC - 123doc

Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho phòng thí nghiệm: dựa trên hoạt lực của kháng sinh được ghi trên các nhãn lọ, ta sẽ tính để pha dung dịch mẹ theo công thức sau: Ví dụ: Kháng sinh chl

Kỹ thuật kháng sinh đồ MIC

XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG SINH TỐI THIỂU

II. TRANG THI ẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ

III. MÔI TRƯỜNG VÀ SINH PHẨM

3.1 Môi trường 3.2 Các loại kháng sinh và tá dược

6.1 Dung dịch đệm phosphat dùng để pha dung dịch kháng sinh “mẹ”

6.2 Dung dịch đệm phosphat để pha loãng kháng sinh và vi khuẩn (PBS) 6.3 Ống mẫu Mc Farland 0.5

6.4 Bảng mẫu ghi kết quả 6.5 Giá trị MIC của các chủng chuẩn quốc tế

I MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của kháng sinh có

tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp

định lượng)

Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ

nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, và bằng mắt thường đã có thể xác định được điều này.

II TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ

 Nồi cách thủy

 Cân điện chính xác (0,000g)

 Tủ lạnh

 Tủ đông lạnh – 20oC

 Canh thang thường hoặc BHI (Brain Heart Infusion).

 Thạch máu cơ bản (Blood agar base).

 Máu cừu hoặc máu thỏ đã loại fibrin, lấy máu và dùng ngay, có thể giữ ở tủ lạnh nhưng không được quá 48h.

 NAD (nicotin adenin dinucleotid).

3.2 Các loại kháng sinh và hóa dược

 Các loại kháng sinh bột dùng cho phòng thí nghiệm, hoặc kháng sinh bột dùng để tiêm truyền tĩnh mạch.

 Dung dịch đệm dùng để pha các kháng sinh:

 Đệm phosphat dùng để pha dung dịch “mẹ”: pH 6, pH 7, pH 8.

 Đệm phosphat dùng để pha loãng kháng sinh.

 Staphylococcus aureus ATCC 25923

 Escherichia coli ATCC 25922

 Streptococcus faecalis ATCC 29212

 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

4.2.Chủng vi khuẩn cần xác định MIC:

Nhất thiết phải là các chủng đã được định danh và thuần khiết.

V KỸ THUẬT

5.1 Cách pha kháng sinh

5.1.1 Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch “mẹ”)

5.1.1.1 Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho phòng thí nghiệm: dựa trên hoạt lực của kháng sinh (được ghi trên các nhãn lọ), ta sẽ tính để pha dung dịch mẹ theo công thức sau:

Ví dụ: Kháng sinh chloramphenicol có hoạt lực 99,13%, nếu cần pha 10 ml dung dịch kháng sinh mẹ có nồng độ 1600 g/ml, sẽ phải cân Xg kháng sinh:

Kháng sinh bột sau khi được cân, sẽ pha với dung dịch đệm thích hợp (xem 6.1.), tùy theo mỗi loại kháng sinh khác nhau sẽ có những dung môi và dung dịch đệm khác nhau (phụ thuộc từng hãng sản xuất loại kháng sinh).

Nhiều loại kháng sinh có thể hoà tan và được pha loãng trong nước cất Một số khác cần phải hoà tan trong các dung môi đặc biệt, sau đó mới được pha loãng trong nước cất Ví dụ:

Ampicillin Dung dịch đệm phosphat pH 8 Dung dịch đệm phosphat pH 6

Cephalosporin Dung dịch đệm phosphat pH 6 Nước cất

Dung dịch kháng sinh gốc sau khi pha xong, chia nhỏ ra các ống nghiệm, bảo quản trong lạnh - 200C Một khi đã lấy ra, chỉ dùng trong phạm vi một ngày.

5.1.1.2 Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho tiêm truyền tĩnh mạch: là bột kháng sinh không tinh khiết, vì đã có tá dược hòa lẫn trong bột kháng sinh để dễ hòa tan với dung dịch hồi chỉnh hoặc nước cất khi tiêm, sẽ không có chỉ số hoạt lực của kháng sinh Vì vậy sẽ không thể cân bột kháng sinh để pha dung dịch kháng sinh mẹ được (vì sẽ không chính xác) Vậy muốn có dung dịch mẹ: pha toàn bộ lọ kháng sinh đó với một lượng nước hồi chỉnh hoặc nước cất theo chỉ dẫn (có trên nhãn của lọ kháng sinh), từ đó tính được nồng độ của dung dịch mẹ.

Ví dụ: 1 lọ kháng sinh Ampicillin dùng cho tiêm truyền có 1g bột hòa với 5 ml nước cất, như vậy nồng độ kháng sinh của dung dịch mẹ này là: 200.000 g/ml, tiếp tục pha loãng trong dung dịch đệm phosphat pH 6 hoặc nước cất đến khi có nồng độ cần thiết Chia nhỏ vào các ống nghiệm, bảo quản trong lạnh - 200C Một khi đã lấy ra để tan băng, chỉ dùng trong phạm vi một ngày.

5.1.2 Pha các đậm độ kháng sinh

Dung dịch “mẹ”

Dung dịch đệm PBS * (hoặc nước cất) Độ pha

Đậm độ trung gian ( g/ml) Đậm độ cuối cùng ( g/ml)**

2,5 ml (1280 g/ml)

2 ml

1 ml 0,5 ml

0,5 ml

2ml

-3 ml 3,5 ml 7,5 ml

1/2 1/4 1/8 1/16

-1280 640 320 160 80

128 64 32 16 8 2ml (80 g/ml)

1 ml 0,5 ml

0,5

2 ml 3ml 3,5 ml 7,5 ml

1/2 1/4 1/8 1/16

40 20 10 5

4 2 1 0,5 2ml (5 g/ml)

1 ml 0,5 ml

0,5 ml

2 ml 3ml 3,5 ml 7,5 ml

1/2 1/4 1/8 1/16

2,5 1,25 0,64 0,32

0,25 0,125 0,064 0,032 2ml (0,32 g/ml)

1 ml

2 ml 3ml 1/21/4 0,160,08 0,0160,008

* PBS: Dung dịch đệm phosphat dùng để pha loãng kháng sinh (xem 6.2.).

** Đậm độ cuối cùng được tính theo tỷ lệ trộn 2,5 ml dung dịch trung gian + 22,5 ml thạch

MH, hoặc 0,2 ml dung dịch trung gian +1,8 ml canh thang MH (pha loãng 1/10).

5.2 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn trong môi trường đặc

CO2, tạo CO2 bằng cách cho đĩa thạch vào một bình thủy tinh lớn, đốt nến, đậy nắp thật kín).

- Chuẩn bị thạch MH: Cân thạch theo công thức (ghi trên hộp), đun sôi cho tan hết thạch, hấp thạch ở 121oC/15 phút Đối với một số chủng cần môi trường có chất dinh dưỡng cao phải

cho thêm: 5-10% máu (cho các chủng S pneumoniae), 5-10% máu và hấp cách thủy 80oC/20

phút, lắc đều trong suốt thời gian hấp cách thủy, sau đó cho thêm NAD (đối với chủng H influenzae) Để thạch nguội còn khoảng 40-500C, dùng ống đong khắc vạch đong 22,5 ml thạch cho vào bình nón đã có sẵn 2,5 ml dung dịch kháng sinh theo các nồng độ như trong bảng pha kháng sinh, lắc kỹ và đổ vào hộp lồng, khi thạch nguội cất bảo quản trong tủ lạnh 4

- 80C (có thể bảo quản được trong 2 tuần) Mỗi lần làm MIC cần 2 đĩa môi trường MH không

có kháng sinh để làm đĩa chứng (cho thêm 2,5 ml PBS hoặc nước cất).

Ngày 2:

- Cấy vi khuẩn thuần khiết từ canh khuẩn non (canh khuẩn đã cấy qua đêm 18h) hoặc nhặt một số khuẩn lạc từ môi trường thạch thích hợp hoà vào 3 ml dung dịch đệm PBS (hoặc nước cất) để có độ đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 – tương đương 1-1,5 x 108 vi khuẩn/ml (xem 6.3.) Tiếp tục pha loãng 1/100 để có đậm độ vi khuẩn 1-1,5 x 106/ml bằng cách dùng micropipet hút 20 l cho vào 2 ml đệm PBS (hoặc nước cất).

- Dùng pipet Pasteur hút khoảng 0,5 ml huyền dịch (1-1,5 x 106/ml) cho vào mỗi giếng, theo

sơ đồ đã ghi số của các chủng:

* Tùy theo loài vi khuẩn cần xác định MIC để chọn chủng chuẩn sao cho thích hợp: Với

các chủng vi khuẩn đường ruột có thể dùng chủng E coli ATCC 25922, S aureus 25923 làm chủng chuẩn, với chủng H influenzae, S pneumoiae có thể dùng chủng H influenzae NCTC 8468 làm chủng chuẩn.

- Dùng bộ phiên bản 32 chân đinh chấm vào giếng sau đó đặt lên đĩa thạch MH có các nồng

độ kháng sinh khác nhau (nếu không có bộ cấy phiên bản, có thể dùng micropipet nhỏ

2 l/chủng lên mặt đĩa thạch theo sơ đồ)

 Đặt từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất đến nồng độ cao hơn.

 Chú ý cần nhẹ nhàng không để các chân đinh ấn sâu vào trong thạch.

- Sau khi đặt lên các đĩa thạch, chờ cho đĩa thạch khô (các giọt nước tại các chân đường cấy thấm vào thạch (khoảng 15 phút- 20 phút) cất vào tủ ấm 37oC/18 giờ, lật úp đĩa thạch Đối với một số chủng cần thiết phải đặt các đĩa thạch trong điều kiện có CO2 (S pneumoniae, H influenzae, Branhamella catarrhalis).

Ngày 3:

- Trước tiên đọc kết quả ở các đĩa thạch chứng không có kháng sinh để kiểm tra sự thuần khiết của chủng vi khuẩn và đảm bảo không bị chết trước khi tiến hành, nếu các chủng đảm bảo thuần khiết và phát triển tốt mới đọc tiếp.

- Đọc kết quả ở các chủng chứng (chủng chuẩn quốc tế), so sánh kết quả MIC của các chủng này với bảng mẫu (xem 6.5.), nếu những kết quả này nằm trong giới hạn, sai số cho phép là một bậc nhỏ hơn hoặc một bậc lớn hơn, điều đó nói lên rằng các điều kiện của thí nghiệm đã đạt được chuẩn thức: pH, nồng độ kháng sinh, nhiệt độ, dinh dưỡng của môi trường, mật độ của vi khuẩn… Như vậy có thể tiếp tục đọc kết quả ở những chủng cần xác định MIC Nếu

không đạt được như trên, bắt buộc phải làm lại thí nghiệm, đồng thời phải kiểm tra lại các điều kiện của thí nghiệm sao cho đúng chuẩn thức.

- Đọc kết quả, lần lượt đọc từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn lạc mọc.

- Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu (xem 6.4.) trên một

tờ giấy.

- Ở nồng độ thấp nhất, không có vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là: nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó () Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó ().

- Kết quả MIC của các chủng sẽ được so sánh với nồng độ ranh giới kháng (xem 6.6.) để phân biệt thành 3 mức độ nhạy cảm, kháng hay ở mức độ trung gian: nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R) 5.3 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn trong môi trường lỏng

Ngày 1:

- Tất cả các chủng cần thử MIC và các chủng chuẩn quốc tế, đều được cấy trong canh thang thường hoặc BHI để có được canh khuẩn non, theo tỷ lệ sau: trực khuẩn Gram âm: cấy 0,1 ml; Liên cầu D, tụ cầu và trực khuẩn mủ xanh: cấy 0,3 ml; Các liên cầu khác: 0,6 ml (hoặc trên môi trường thạch thích hợp của từng loại) Đặt ở 37oC/ 18 giờ để có được vi khuẩn non.

Chú ý điều kiện khí trường theo yêu cầu của từng loại vi khuẩn: H influenzae, S pneumoniae, S pyogenes để trong khí trường có 5% CO2(trong điều kiện không có tủ ấm

CO2, tạo CO2 bằng cách cho đĩa thạch vào một bình thủy tinh lớn, đốt nến, đậy nắp thật kín).

Ngày 2:

- Pha loãng 0,1 ml (100 l) canh khuẩn non (sau khi để 37oC/18 giờ sẽ có đậm độ tương đương 1-1,5 x 108 vi khuẩn ml) trong 9,9 ml canh thang MH (pha loãng 100 lần để có đậm

độ tương đương 1-1,5 x 106 vi khuẩn/ml), chia 1,8 ml vào các ống nghiệm đường kính 12

mm Nếu nuôi cấy qua đêm bằng môi trường thạch, lấy vi khuẩn thuần khiết từ môi trường thạch thích hợp hoà vào 3 ml dung dịch đệm PBS (hoặc nước cất) để có độ đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 – tương đương 1-1,5 x 108 vi khuẩn/ml (xem 6.3.), sau đó lại pha loãng 1/100 trong canh thang MH và chia vào các ống nghiệm như trên.

- Thêm 0,2 ml nước cất hoặc nước muối sinh lý vô trùng vào 1 ống nghiệm (chứng âm).

- Thêm 0,2 ml kháng sinh đã pha theo bảng pha các đậm độ kháng sinh ở trên vào mỗi ống nghiệm, phân phối từ nồng độ kháng sinh thấp nhất đến nồng độ cao nhất Lắc kỹ từng ống nghiệm.

- Đặt vào tủ ấm 37oC/18 giờ.

Ngày 3.

- Lắc kỹ từng ống nghiệm trước khi đọc kết quả.

- Đọc kết quả ở ống chứng âm trước để kiểm tra xem chủng vi khuẩn có phát triển tốt hay không, nếu vi khuẩn phát triển tốt mới tiếp tục đọc kết quả, nếu không mọc tốt phải làm lại thí nghiệm.

- Đọc kết quả ở các chủng chứng (chủng chuẩn thức quốc tế), so sánh kết quả MIC của các chủng này với bảng mẫu (xem 6.5.), nếu những kết quả này nằm trong giới hạn, sai số cho phép là một bậc nhỏ hơn hoặc một bậc lớn hơn, điều đó nói lên rằng các điều kiện của thí nghiệm đã đạt được chuẩn thức: pH, nồng độ kháng sinh, nhiệt độ, dinh dưỡng của môi trường, mật độ của vi khuẩn… Như vậy có thể tiếp tục đọc kết quả ở những chủng cần xác định MIC Nếu không đạt được như trên, bắt buộc phải làm lại thí nghiệm, đồng thời phải kiểm tra lại các điều kiện của thí nghiệm sao cho đạt được điều kiện chuẩn thức.

- Xác định nồng độ MIC: Đọc kết quả bắt đầu từ ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp nhất Nồng độ MIC được tính ở ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp nhất có thể ức chế được sự phát triển của vi khuẩn (bằng mắt thường không nhìn thấy vi khuẩn mọc - canh thang trong).

- Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu (xem 6.4.)

- Ở nồng độ thấp nhất, không thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là : nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó () Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó ().

- Kết quả MIC của các chủng sẽ được so sánh với nồng độ ranh giới (xem 6.6.) để phân biệt 3 mức độ nhạy cảm, kháng hay ở mức độ trung gian: nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I), kháng (Resistante - viết tắt R).

6 PHỤ LỤC

6.1 Dung dịch đệm phosphat dùng để pha dung dịch kháng sinh “ mẹ ”

Dung dịch A: Na2HPO4.2 H2O 11,867 g/l

Dung dịch B: KH2PO4 9,078 g/l

Dung dịch đệm phosphat pH 6: 20 ml dung dịch A + 80 ml dung dịch B

Dung dịch đệm phosphat pH 7: 70 ml dung dịch A + 30 ml dung dịch B

Dung dịch đệm phosphat pH 8: 95 ml dung dịch A + 5 ml dung dịch B

Kiểm tra lại độ pH, nếu cần thiết cho thêm dung dịch A hoặc B Hấp vô trùng 1210C/15’.

6.2 Dung dịch đệm phosphat để pha loãng kháng sinh và vi khuẩn (PBS)

( Theo Clinical Microbiology and Infection, volume 2 supplement 1, Dec 1996 )

Tên kháng sinh Escherichia coli

ATCC 25922

Enterococcus faecalis

ATCC 29212

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853

Staphylococcus aureus

ATCC 25923

Tên kháng sinh

Escherichia coli

ATCC 25922

Enterococcus faecalis

ATCC 29212

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853

Staphylococcus aureus

Tên kháng sinh

Escherichia coli

ATCC 25922

Enterococcus faecalis

ATCC 29212

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853

Staphylococcus aureus

Qui trình xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn

- Phương pháp chuẩn thức được áp dụng nhằm xác định nồng độ kháng sinh nhỏnhất ức chế được sự phát triển của vi khuẩn giúp cho các thầy thuốc lựa chọn vàtính toán liều kháng sinh cho bệnh nhân

- Sử dụng để giám sát dịch tễ học nhằm đánh giá về tình hình kháng thuốc của vikhuẩn qua đó sẽ đưa ra các biện pháp nhằm khống chế và ngăn chặn sự lây lancủa vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện và cộng đồng

2 Tiêu chuẩn trích dẫn:

Sử dụng các qui trình trong sách chuyên khảo tại Việt Nam và các qui trình chuẩn thức hiệnđang áp dụng trên thế giới về thử nghiệm tính nhậy cảm kháng sinh (Clinical and LaboratoryStandard Institute; CLSI, 2010)

4 Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa thạch

Meuller-hinton có nồng độ kháng sinh khác nhau Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng

ức chế vi khuẩn được xác định khi mật độ khuẩn lạc  3 khuẩn lạc

5 Giới hạn tham chiếu: Phương pháp này không áp dụng để thử nghiệm xác định

nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn với các vi khuẩn kỵ khí do những vi khuẩn nàyphát triển chậm và nghèo trên thạch Mueller-hinton

6 Phương pháp xác định:

6.1. Loại mẫu: Các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ các bệnh phẩm lâm sàng, trong

các vụ dịch và ở trong môi trường ngoại cảnh

- Que cấy vi khuẩn.

- Bộ cấy phiên bản 32 đầu mỗi đầu chứa 1µl

- Khay inox 32 giếng

- Hộp lồng nhựa đáy phẳng có đường kính 90mm

6.3.1. Thạch Mueller-Hinton: Sử dụng thạch Mueller-Hinton bột đã được kiểm

định chất lượng hiện đang được bán rộng rãi trên thị trường

6.3.2. Kháng sinh bột:Các loại kháng sinh bột dùng cho các phòng thí nghiệm.

6.3.5. Độ đục chuẩn (McFarland): Độ đục chuẩn 0,5 McFarland phải được chuẩn bị và kiểm định

chất lượng trước khi làm thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh Nếu độ đục chuẩn được hànkín để chống bay hơi và bảo quản trong bóng tối thì có thể sử dụng trong vòng 6 tháng Độđục chuẩn McFarland được sử dụng để điều chỉnh độ đục của huyền dịch nuôi cấy vi khuẩncho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh

 Độ đục chuẩn 0,5 Mcfarland hiện nay rất sẵn có trên thị trường Hoặc có thể tự chuẩn bị bằng

- Đo bằng máy đo độ đục bước sóng 625nm: OD = 0,08-0,1

- Hoặc sử dụng chủng chuẩn E coli ATCC 15922: điều chỉnh huyền dịch

vi khuẩn giống với độ đục chuẩn, chuẩn bị các độ pha loãng 10 lần của huyền dịch, xác định

số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm trên đĩa thạch Huyền dịch vi khuẩn có cùng độđục với độ đục chuẩn 0,5 phải có số lượng vi khuẩn là 108vk/ml

6.3.6. Chủng chuẩn quốc tế (ATCC)

- Escherichia coli ATCC 25922

- Escherichia coli ATCC 35218

- Giữ các chủng chuẩn ở -700C trong môi trường canh thang có chứa 10% glycerol trongvòng 3 năm Trước khi sử dụng cấy và kiểm tra lại các đặc tính sinh hóa của chủng chuẩn.Các chủng chuẩn có thể được giữ trong các ống thạch nghiêng ở nhiệt độ 2-80C trong vòng 2tuần

6.4. Lấy mẫu, bảo quản mẫu và vận chuyển mẫu

- Các chủng vi khuẩn sau phân lập, trước khi thử nghiệm được bảo quản trongthạch mềm, hoặc thạch nghiêng

- Khi vận chuyển, các chủng vi khuẩn phải được bảo quản trong các ống giữ chủng có nắpxoáy và đóng gói như hình 1 và vận chuyển về phòng thí nghiệm

Hình 1: Cách đóng gói các mẫu bệnh phẩm

6.5. Các bước tiến hành

6.5.1. Chuẩn bị các dung dịch kháng sinh

- Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch mẹ):

- Dựa vào hoạt lực của kháng sinh (ghi trên nhãn lọ) để tính nồng độ dung dịch mẹ cần pha.Khối lượng kháng sinh có hoạt lực a% cần để pha 10ml dung dịch mẹ nồng độ 5120 µg/mlđược tính theo công thức:

- Kháng sinh bột phải pha với dung môi thích hợp (xem phụ lục 1) Cho mộtlượng dung môi vừa đủ để hòa tan hoàn kháng sinh, bồi phụ đủ thể tích bằngdung môi hoà tan

- Từ dung dịch mẹ, pha dung dịch gốc cần dùng bằng đệm PBS

- Từ dung dịch gốc pha loãng ½ đến nồng độ thấp nhất cần dùng.

Hình 2: Cách pha bậc 2 các đậm độ kháng sinh từ dung

dịch kháng sinh gốc

- Dung dịch mẹ sau khi pha có thể chia nhỏ ra các tube, bảo quản ở -20 C Khicần lấy ra làm tan băng và dùng trong ngày, lượng thừa sẽ bỏ đi.

- Các ống chứa dung dịch kháng sinh cần dùng được bảo quản ở 40C và dùng trong ngày

6.5.2. Chuẩn bị các đĩa thạch kháng sinh

 Thạch Mueller-Hinton được chuẩn bị theo các bước sau đây:

- Cân thạch một cách chính xác theo hướng dẫn của từng hãng sản xuất và hòa tanvào môi trường nước cất

- Đun sôi để hoà tan hoàn toàn thạch

- Kiểm tra pH và chỉnh pH = 7.2 – 7.4

- Hấp tiệt trùng 1200C/15phút, để nguội môi trường tới 500C

- Cho vào bình tam giác (loại 50ml vô trùng) 18ml thạch và 2ml dung dịch kháng sinh cầndùng Lắc đều và đổ ra đĩa Vì phải chuẩn bị nhiều đĩa thạch chứa kháng sinh nồng độ khácnhau, nên có thể dùng 1 bình tam giác và đổ từ nồng độ thấp đến nồng độ cao

- Dùng ngay các đĩa thạch trong ngày, nếu chưa dùng ngay thì gói kín và bảo quản ở trong tủlạnh (2-80C) trong vòng 2 tuần

- Khi sử dụng, nếu mặt thạch ướt thì phơi khô mặt các đĩa thạch trong tủ ấm (35-370C)khoảng 15-30 phút Không mở nắp đĩa thạch khi phơi để tránh bị nhiễm Đánh dấu phía trên

và phía dưới đĩa thạch để tránh nhầm lẫn số thứ tự chủng khi đọc kết quả

- Mỗi lần làm MIC cần ít nhất 2 đĩa môi trường MH không có kháng sinh để làm chứng dương

 Kiểm định chất lượng của mỗi lô thạch:

- Sử dụng chủng chuẩn E coli ATCC 25922.

- pH của môi trường phải nằm trong khoảng 7,2-7,4 Nếu nằm ngoài khoảng này thì khôngđược điều chỉnh pH bằng acid hoặc kiềm mà phải bỏ đi và chuẩn bị lại lô môi trường khác

6.5.3. Chuẩn bị chủng vi khuẩn & Pha hỗn dịch vi khuẩn

- Mỗi chủng vi khuẩn trước khi làmthử nghiệm cần được cấy vào môi trường thạch không có chất

ức chế (thạch dinh dưỡng, thạch máu hoặc thạch não tim), để tạo ra các khuẩn lạc thuầnriêng rẽ

- Ủ các đĩa thạch qua đêm ở 370C Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nước

muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn Vortex

- Độ đục của huyền dịch vi khuẩn sẽ được so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland dưới nền giấy

trắng có kẻ các vạch đen Lưu ý, cần phải trộn đều ống đục chuẩn trước khi dùng

- Nếu huyền dịch vi khuẩn không có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, có thể điều

chỉnh độ đục bằng cách cho thêm nước muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn

- Pha loãng 100 lần huyền dịch có độ đục tương đương độ đục McFaland bằng cách lấy 20µl

huyền dịch này cho vào 2ml nước muối sinh lý để được huyền dịch nồng độ 106 vi khuẩn /ml

- Ngoài ra có thể chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn bằng cách lấy 1 khuẩn lạc từ đĩa thạch nuôi cấy

qua đêm cho vào môi trường (canh thang Mueller-Hinton, canh thang não tim, hoặc canhthang trypton soy) Ủ ở 370C cho tới khi vi khuẩn mọc đục, sau đó điều chỉnh để có được độđục huyền dịch vi khuẩn phù hợp cho thử nghiệm

- Lưu ý: luôn luôn phải làm song song thử nghiệm với các chủng chuẩn Quốc tế để kiểm tra chất

lượng của qui trình

6.5.4. Tiến hành

- Hút 0.5ml huyền dịch vi khuẩn nồng độ 106 vi khuẩn /ml cho vào mỗi giếng của khay inox 32

giếng theo sơ đồ số của các chủng