Kỹ Thuật PCR - GENTIS

Nguyên lý

PCR là quá trình tổng hợp sợi DNA mới dựa trên DNA khuôn nhờ hoạt động xúc tác của enzyme DNA polymerase.

Thành phần phản ứng PCR

• DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại.
• Cặp mồi (primer) là các đoạn DNA ngắn (dưới 50bp) để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại.
• DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA.
• Nucleotides (dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase tổng hợp DNA mới.
• Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase.

Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt gồm các bước:

Bước 1:Khởi đầu: Đun hỗn hợp ở 96 °C trong vòng 5 phút để đảm bảo sợi DNA cũng như mồi được làm nóng.

Bước 2:Biến tính (Melting): DNA khuôn ở dạng sợi đôi được tách thành 2 sợi đơn.

Bước 3:Gắn mồi (Annealing): Mồi được gắn vào DNA khuôn ở vị trí có trình tự bổ sung, bắt đầu quá trình tổng hợp.

Bước 4:Kéo dài (Elongation): Các nucleotide được gắn vào chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn.

Bước 5:Lặp lại bước 2-4 (số lần lặp lại là số chu trình nhiệt, tùy thuộc vào từng loại phản ứng PCR).

Ứng dụng

PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.

Các vấn đề của PCR

-Thiết kế mồi cho phản ứng PCR: Đáp ứng các yêu cầu về độ đặc hiệu của mồi, nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược, khả năng tạo primer dimer…

-Các loại PCR: Tùy vào mục đích sử dụng, đặc điểm của DNA khuôn và kích thước đoạn đích mà có thể sử dụng các loại PCR: PCR thường, RT-PCR, Long range- PCr, touch down PCR…

-Tối ưu hóa phản ứng PCR: Thay đổi các điều kiện phản ứng như nhiệt độ gắn mồi, nồng độ các thành phần phản ứng, chu kỳ nhiệt… nhằm khuếch đại tốt nhất đoạn đích cần khuếch đại với độ đặc hiệu cao.