Kỹ Thuật PCR - Ứng Dụng Trong Xét Nghiệm ADN - NOVAGEN

Kỹ thuật PCR là gì?

Kỹ thuật PCR (viết tắt của Polymerase chain reaction) là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong xét nghiệm ADN và sinh học phân tử để tạo ra nhiều bản sao của một trình tự ADN cụ thể.

Thông qua PCR, một đoạn ADN với lượng rất nhỏ (chỉ vài nanogram) có thể được khuếch đại theo cấp số nhận để tạo ra hàng triệu bản sao của đoạn trình tự ADN đó.

PCR hiện là một kỹ thuật cơ bản quan trọng và thường không thể thiếu được trong quy trình nghiên cứu của các phòng thí nghiệm về sinh học phân tử, y sinh, khoa học hình sự, pháp y và xét nghiệm ADN.

PCR được phát minh bởi TS. Kary Mullis vào năm 1983. Vào thời điểm đó, ông đang làm việc tại Cetus Corporation, một trong những công ty công nghệ sinh học đầu tiên. Công trình của Kary Mullis đã vinh dự được nhận giải Nobel về Hóa học vào năm 1993 cùng với Michael Smith.

Nguyên lý kỹ thuật PCR

PCR dựa trên việc sử dụng khả năng của enzyme DNA polymerase để tổng hợp chuỗi ADN mới từ chuỗi ADN ban đầu được cung cấp.

Bởi vì DNA polymerase chỉ có thể thêm một nucleotide vào nhóm 3′-OH có từ trước, nên enzyme này cần một đoạn ADN mồi để có thể thêm nucleotide đầu tiên.

Yêu cầu này cho phép phân định một vùng cụ thể của chuỗi mẫu mà nhà nghiên cứu muốn khuếch đại. Khi kết thúc phản ứng PCR, trình tự cụ thể sẽ được tích lũy thành hàng tỷ bản sao của đoạn trình tự ADN ban đầu.

Thành phần của một phản ứng PCR thường bao gồm:

1. Dung dịch ADN mẫu (DNA template) chứa đoạn ADN cụ thể đã được tinh sạch để nhân bản.
2. Primers: là các đoạn ADN mồi, thường có độ dài vài chục Kb, có nhiệm vụ định vị điểm bắt đầu và điểm kết thục của đoạn ADN mẫu.
3. DNA polymerase: là enzyme có nhiệm vụ tổng hợp các đoạn ADN mới là bản sao của trình tự ADN ban đầu. Enzyme này có khả năng chịu nhiệt cao và thường sử dụng trong PCR là Taq polymerase.
4. Nucleotides (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs): bao gồm 4 loại (A, T, G, C) –> là các thành phần cơ bản, được xem như những “viên gạch” cấu tạo nên cấu trúc của ADN –> DNA polymerase sử dụng các dNTPs để tổng hợp nên các trình tự ADN bản sao.
5. Dung dịch đệm (buffer solution): cung cấp môi trường hoạt động cho enzyme DNA polymerase
6. Ống PCR (PCR tube): là dụng cụ plastic chuyên dụng dùng để phối trộn dung dịch phản ứng PCR trước khi cho vào thiết bị thực hiện PCR (Thermal cycler)

Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt gồm 6 bước chính:

• Initialization: hỗn hợp dung dịch PCR được gia nhiệt lên đến 94–98 °C trong thời gian 1-10 phút để làm nóng
• Denaturation: đoạn trình tự ADN sợi đôi được làm nóng và phân tách thành 2 sợi ADN đơn, tạo khuôn cho quá trình nhân bản
• Annealing: các đoạn mồi bám vào sợi ADN khuôn tại vị trí khởi đầu để bắt đầu quá trình tổng hợp sợi ADN mới
• Extension/elongation: enzyme Taq polymerase sẽ tham gia hoạt động tổng hợp bằng cách sử dụng các dNTPs để gắn lại với nhau tạo thành chuỗi bổ sung
• Final elongation: sau khi trải qua một vòng lặp các chu trình nhiệt (25-40 vòng tùy theo thí nghiệm), phản ứng PCR tiếp tục được duy trì ở nhiệt độ 70–74 °C trong thời gian 5-10 phút để đảm bảo rằng toàn bộ các sợi ADN đơn sẽ được kéo dài hoàn toàn. Ở thời điểm này, số lượng các bản sao ADN của trình tự ADN ban đầu có thể đạt đến con số 230, or 1073741824 bản sao.
• Final hold: toàn bộ khay phản ứng PCR được làm mát ở nhiệt độ 4–15 °C trong một khoảng thời gian không xác định và có thể được xem như là giai đoạn lưu trữ ngắn hạn các sản phẩm của phản ứng PCR.

Quy trình kỹ thuật PCR thường sử dụng 6 thành phần cơ bản và trải qua 6 bước nêu trên.

Mặc dù vậy, thực tế triển khai không chỉ đơn thuần là lấy mỗi thành phần một ít và trộn đều với nhau trong ống PCR rồi cho vào máy chạy là sẽ có hàng triệu bản sao của đoạn trình tự ADN ban đầu như mong muốn.

Trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử, đặc biệt là phòng xét nghiệm ADN, mỗi phản ứng PCR cần được tối ưu hóa theo các tiêu chí của công việc để có thể nhân bản được đúng trình tự ADN mong muốn với độ tin cậy cao.

>>> Xem thêm: PCR – 6 thành phần quan trọng cần hiểu cho đúng

Kỹ thuật PCR và ứng dụng

Trong quãng thời gian hơn 30 năm kể từ khi PCR được sử dụng lần đầu tiên, kỹ thuật này đã tác động mạnh mẽ đến mọi lĩnh vực chuyên ngành liên quan đến Khoa học sự sống và Y Sinh học.

Kỹ thuật PCR đã giúp làm thay đổi cách thức nghiên cứu và nâng cao năng suất làm việc của các chuyên ngành từ pháp y, an toàn thực phẩm, chẩn đoán lâm sàng cho đến nghiên cứu hệ gen (genomics).

Trên thực tế, kỹ thuật PCR đã trở nên phổ biến, đôi khi hơn cả sự tưởng tượng mà chúng ta có thể nghĩ ra. Thuật ngữ “PCR” cũng đã là một từ trong Từ điển đại học Merriam-Webster.

Trong lĩnh vực xét nghiệm ADN, kỹ thuật PCR được sử dụng để nhân bản các đoạn ADN tách ra từ đứa trẻ và người cha nghi vấn. Ở bước tiếp theo, sản phẩm PCR sẽ được dùng để phân tích trên hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới.

Tài liệu tham khảo

• Polymerase chain reaction (Wikipedia)
• Polymerase chain reaction (NCBI)
• Polymerase chain reaction (ScienceDirect)
• PCR: Past, Present, & Future
• PCR primers (Biocompare)
• Primer Design for PCR (Addgene)
• Designing PCR primers and probes (Integrated DNA Technologies)

TS. Đặng Trần Hoàng Viện trưởng Viện Công nghệ ADN và Phân tích di truyền