Môi Trường Dùng để Giữ Giống PGA (Potato Glucose Agar) - 123doc

1. Trang chủ >
2. Cao đẳng - Đại học >
3. Kỹ thuật - Công nghệ >

Môi trường dùng để giữ giống PGA (Potato glucose agar):

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.02 MB, 92 trang )

Đồ án tốt nghiệpGVHD: CN.Đỗ Thị TuyếnKhoai tây200gGlucose20gAgar20gNước cất1000mlpH6.5 Tiến hành pha môi trường PGA và cách cấy nấm mốcKhoai tây sau khi gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát đem đi nấu với nước cất trong 30ph sauđó lọc chiết lấy nước. Cho agar vào nấu, trong quá trình nấu khuấy đều. Cho glucosevào và khuấy đều.Cho môi trường vào ¼ các ống nghiệm, sau đó đem khử trùng ở 121oC, 1 atm trong20 phút sau đó đem làm thạch nghiêng. Tiến hành cấy chuyền từ ống nghiệm này qua ống nghiệm khácSau khi làm thạch nghiêng xong ta dùng que cấy vòng đã được thanh trùng trên đèncồn.Sau đó đốt nóng miệng của 2 ống nghiệm trên đèn cồn.Đưa que cấy vào ống canh trường và lấy một ít canh trường VSV rồi đưa đầu quecấy vào tận đáy ống mơi trường.Nhẹ nhàng hòa giọt canh trường VSV vào giọt nước ngưng tụ ở đáy.Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy lên trên mặt thạch từ đáy lên trên theo kiểuđường ziczắt.Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại.SVTH: Nguyễn Quốc ĐạtTrang 42Đồ án tốt nghiệpGVHD: CN.Đỗ Thị TuyếnĐể các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn rồi để vào chỗ cũ.Tiến hành cấy truyền nấm mốc của Viện cung cấp sang ống nghiệm chứa môitrường PGA.Tất cả các thao tác đều được thực hiện trong buồng cấy vô trùng. Môi trường dùng để nuôi cấy nấm sợi Asp. Kawasaki sinh tổng hợp GA:Bột bắp và cám mì được trộn theo tỷ lệ thích hợp.Dung dịch dinh dưỡng dựa theo mơi trường Mandel có thành phần (%):-(NH4)2SO4 0,14-KH2PO4 0,2-Ure 0,03-Peptone 0,075-CaCl2 0,03-MgSO4 .H2O 0,03Và 10ml dung dịch khoáng vi lượng có nồng độ:-FeSO4 .7H2O 1,275(g/l)-ZnSO4 0,415(g/l)-CoCl2 0,5(g/l)-MnSO4 . 1H2O 0,465 (g/l)Tiến hành pha riêng từng loại hóa chất có trong thành phần của mơi trường Mandeldưới dạng các dung dịch mẹ, hút chính xác thể tích từng loại dung dịch mẹ để đạt từngSVTH: Nguyễn Quốc ĐạtTrang 43Đồ án tốt nghiệpGVHD: CN.Đỗ Thị Tuyếnloại phần trăm bằng với nồng độ có trong mơi trường Mandel, nồng độ này được gọi lànồng đô x1 (lần1). Tiếp tục hút từng loại dung dịch với thể tích gấp 2,3 … đến 8 lầnthể tích ở nồng độ x1 để đạt các nồng độ x2, x3, x4, x5, x6, x7, x8 tương ứng với nồngđộ gấp 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8 so với nồng độ của môi trường Mandel. Mơi trường Czapeck (bổ sung khống cho mơi trường lên men bán rắn)SVTH: Nguyễn Quốc ĐạtNaNO33,5gK2HPO41,5gMgSO4.7H2O0,5gKCl0,5gFeSO40,01gSaccaroza30gNước1000mlTrang 44Đồ án tốt nghiệpGVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng proteinPhương pháp BradfordBradford là một trong những phương pháp để xác định hàm lượng protein. Phươngpháp này có một số ưu điểm như sau:-Dễ sử dụng (chỉ cần một loại thuốc thử)-Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở 1 – 20μg)-Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tương đối ổn định-Phương pháp này ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiêncứu protein.2.3.2.1 Nguyên tắcPhương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và sự thay đổimàu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid.Trong dung dịch mang tính acid, khi khơng kết nối với protein thì thuốc nhuộm cóbước sóng cực đại ở 465nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu bướcsóng cực đại ở 595nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595nm liên hệ trực tiếp với nồng độprotein.2.3.2.2 Hóa chất và thiết bịDung dịch mẫu protein cụ thể trong bài này là mẫu enzyme α–amylase cần xácđịnh.Dung dịch albumin chuẩn (0.1 mg/ml): cân chính xác 10mg albumin, thêm 50mlnước cất khuấy tan albumin. Cho toàn bộ dung dịch trên vào bình định mức 100 dẫnnước tới vạch → dung dịch albumin chuẩn có nồng độ 0.1 mg/ml. Giữ ở –200C.Dung dịch thuốc thử Bradford: có thành phần trong 100ml như sau:-Coomasie Brilliant Blue (CBB) 0.001gSVTH: Nguyễn Quốc ĐạtTrang 45Đồ án tốt nghiệpGVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến-Ethanol tuyệt đối 4.7g-Acid phosphoric 85%: 8.5gPhẩm màu CBB được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp.Bổ sung acid phosphoric và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Lắc đều. Bảo quản ở 40C.Thiết bị máy quang phổ UV – Vis.2.3.2.3 Lập đường chuẩnChuẩn bị các ống đánh số từ 0 đến 10Bảng 2.1 – Bảng số liệu dựng đường chuẩn albuminỐng nghiệmĐối1234567891000.10.20.30.40.50.60.70.80.91.010.90.80.70.60.50.40.30.20.1022222222222chứngDung dịch albumin0.1mg/ml (ml)Nước cất (ml)Thuốc thử Bradford(ml)Lắc đều các ống nghiệm, đo mật độ quang ở bước sóng 595nm. Ghi lại giá trị OD.Trị số mật độ quang (OD) của các ống thử (1 – 10) sau khi trừ đi trị số của ống đốichứng (ống 0) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang(OD) theo nồng độ protein.SVTH: Nguyễn Quốc ĐạtTrang 46Đồ án tốt nghiệpGVHD: CN.Đỗ Thị TuyếnXác định nồng độ enzyme của mẫu:Dịch chiết enzyme thô của nấm mốc trên cũng được tiến hành tương tự như trên.Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng đường chuẩn.Mật độ quang của mẫu cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối chứng, rồi chiếuvào đường chuẩn để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm.2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme GA theo Miller (1959)2.3.3.1 Nguyên tắcDựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử acid dinitróalicylic(DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trongmột phạm vi nhất định.Sản phẩm thủy phân từ tinh bột dưới tác dụng của enzyme GA, thuốc thử DNS cómàu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành dung dịch có màu đỏ cam. Bằng cáchđo độ hấp thụ của dung dịch chứa tinh bột và enzyme GA trước và sau thủy phân sẽxác định được lượng đường khử tạo thành.2.3.3.2 Hóa chất pha thuốc thử DNSNước cất: 1000mlNaOH: 160gK, Na tartrate: 300gAcid 3 – 5 – dinitrosalicylic: 10gDung dịch hồ tinh bột 1% pha trong đệm acetate.Mục đích: sử dụng làm cơ chất để hoạt tính enzyme GA trong các thí nghiệm tìm racác điều kiện tối ưu hóa mơi trường ni cấy.SVTH: Nguyễn Quốc ĐạtTrang 47Đồ án tốt nghiệpGVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến2.3.3.3 Cách tiến hànhLấy các ống nghiệm mỗi ống 2ml thuốc thử DNS.Pha loãng dịch enzyme thu được ở nồng độ thích hợp.Lấy mẫu trước thủy phân: cho 1ml dịch enzyme ở độ pha lỗng thích hợp vào cácống nghiệm có chứa 2ml DNS rồi đem đun sơi trong 15 phút.Làm mẫu thí nghiệm: cho 1ml dịch enzyme ở độ pha lỗng thích hợp vào các ốngnghiệm có sẵn 4ml hồ tinh bột 1% sau đó đem ủ 45oC trong 10phút. Sau khi ủ xong hútra 1 ml cho vào các ống nghiệm có chứa sẵn 2ml DNS rồi đun sôi trong 15 phút.Làm mẫu đối chứng: cho 1ml nước cất đó vào các ống nghiệm chứa sẵn 2 ml DNSrồi đun sôi trong 15phút.Các mẫu thí nghiệm trên được xác định mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Dựavào đường chuẩn glucose xác định được lượng đường khử thủy phân bởi enzyme GA.2.3.3.4 Dựng đường chuẩn glucoseCân chính xác 100mg đường glucose hòa tan khoảng 50 – 60ml nước cất.Hòa tan hồn toàn cho vào định mức 100ml dẫn nước đến vạch.Nồng độ đường glucose chuẩn là 1mg/ml.Chuẩn bị 7 ống nghiệm đánh dấu từ 0  7.SVTH: Nguyễn Quốc ĐạtTrang 48Đồ án tốt nghiệpGVHD: CN.Đỗ Thị TuyếnBảng 2.2: Bảng số liệu dựng đường chuẩn glucoseỐng số01234567Nồng độ glucose(mg/ml)00.10.20.30.40.50.60.7Glucose chuẩn 1mg/ml (ml)00.10.20.30.40.50.60.7Nước cất(ml)10.90.80.70.60.50.40.3Dung dịch DNS22222222Lắc đều các ống nghiệm, đun sôi trong 15phút.Làm nguội đo mật độ quang ở bước sóng 540Hoạt tính enzyme GAĐịnh nghĩa đơn vị hoạt tính: đơn vị hoạt tính của enzyme được tính theo đơn vịquốc tế là UI. Mỗi UI là hoạt động của enzyme xúc tác chỉ thị sự chuyển hóa 1µmol cơchất sau 1 phút ở điều kiện thích hợp nhất.Hoạt tính của enzyme GA: hoạt tính của enzyme GA được biểu hiện bằng số mgglucose giải phóng từ tinh bột trong thời gian 1 phút, trong điều kiện thí nghiệm bởienzyme.Hoạt tính enzyme GA trên 1ml dịch lọcHT SVTH: Nguyễn Quốc ĐạtCn(UI / ml )tmTrang 49Đồ án tốt nghiệpGVHD: CN.Đỗ Thị TuyếnTrong đó:C: lượng glucose giải phóng được xác định dựa vào đường chuẩn (mg/ml)n: là hệ số pha loãngm: khối lượng tinh bột đem thủy phânt: thời gian phản ứngHoạt tính GA tính theo gam canh trườngHT HT (UI / ml )  VMHT(UI/ml): đơn vị hoạt tính enzyme trong một ml dịch lọc.V: thể tích dịch chiết enzyme sau lọc (ml)M: khối lượng canh trường ban đầu đem trích ly (g)SVTH: Nguyễn Quốc ĐạtTrang 50Đồ án tốt nghiệpGVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến2.4 Khảo sát tách chiết tinh sạch enzymeQuy trình tách chiết tinh sạch enzymeSinh khốiTrích lyNước cấtLọc, ly tâmThu dịchỦ lạnh 40CTủa enzymeCồn 960Ly tâm lạnhEnzyme hòa tanTinhsạchSVTH: Nguyễn Quốc ĐạtEnzymecố địnhTrang 51Đồ án tốt nghiệpGVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến2.4.1 Khảo sát dung mơi trích ly Quy trình chiết enzymeCân chế phẩmH20MuốiĐệmXác định hoạt tínhXác định hàm lượngChọn dung mơi thích hợp Giải thích quy trìnhTiến hành tách chiết enzyme bằng đệm acetate pH6, nước cất và muối sinh lý theobảng sauBảng 2.3 : Dung mơi trích ly enzymeDung mơiLượng canh trường(g)Dung môi cho vào(ml)H2 O520Đệm520Muối sinh lý520Khuấy đều hỗn hợp bằng máy khuấy.Lọc hỗn hợp qua vải thơ.Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút.SVTH: Nguyễn Quốc ĐạtTrang 52

Xem Thêm

Tài liệu liên quan

• Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch enzyme glucoamylase từ nấm mốc aspergillus kawasaki trên môi trường lên men bán rắn, ứng dụng enzyne cố định trên chất mang alginate và chitosan
  • 92
  • 958
  • 0
• Tài liệu về BETA THALASSEMIA
  • 3
  • 346
  • 1
• Tài liệu về HEN PHẾ QUẢN
  • 12
  • 285
  • 2
• Tài liệu về SUY DINH DƯỠNG
  • 6
  • 595
  • 2
• Tài liệu về SUY TIM
  • 8
  • 949
  • 5
• Tài liệu về SỮA MẸ
  • 3
  • 290
  • 0
• Tài liệu về TIÊU CHẢY CẤP
  • 13
  • 431
  • 0
• Tài liệu về TIÊU CHẢY KÉO DÀI
  • 6
  • 0
  • 0

Tải bản đầy đủ (.pdf) (92 trang)

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(3.02 MB) - Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch enzyme glucoamylase từ nấm mốc aspergillus kawasaki trên môi trường lên men bán rắn, ứng dụng enzyne cố định trên chất mang alginate và chitosan -92 (trang) Tải bản đầy đủ ngay ×