Một số phương pháp phân tích vi sinh trong nướcNgày đăng: 04/08/2021 02:56:23
1. Tổng quan
Ô nhiễm môi trường nước ngày nay đang là vấn đề được đặc biệt quan tâm của toàn xã hội. Nguồn nước nhiễm bẩn có nguồn gốc từ vi sinh vật là nguyên nhân gây ra các dịch bệnh lây nhiễm như sốt xuất huyết, tả… gây nguy hiểm đến sức khỏe con người và đe dọa trực tiếp đến sự phát triển của sinh vật tồn tại trong thủy vực đó. Trước tình hình đó, đòi hỏi các cấp có thẩm quyền đề ra các biện pháp hữu hiệu nhằm giải quyết triệt để các vấn đề môi trường, kiểm soát và hạn chế ô nhiễm. Để tìm được biện pháp thích hợp thì nhà quản lý cần phải có sự đánh giá chính xác về mức độ và hiện trạng ô nhiễm.
Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá mức độ an toàn vệ sinh trong nước, bởi vì nhóm sinh vật này có trong đường ruột của động vật máu nóng, số lượng của chúng hiện diện trong mẫu nước chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh. Trên thực tế, kiểm nghiệm Coliform, Coliform chịu nhiệt (Feacal Coliform) và E.Coli được xem là những thông số chỉ thị hiệu quả sử dụng để đánh giá mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm trong mẫu nước.
2. Các chỉ tiêu vi sinh thường được kiểm soát trong nước
Coliforms
Coliform và Coliform chịu nhiệt (Feacal Coliform) là nhóm gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Gram âm, không sinh bào tử, hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy lỏng. Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, nhóm này lại được chia thành hai nhóm nhỏ là Coliform (lên men lactoza kèm theo tạo thành axit, khí và andehyt trong vòng 48 h, khi nuôi cấy ở nhiệt độ 350C đến 370C) và Coliform chịu nhiệt (Feacal Coliform) có nguồn gốc từ chất thải của các loài động vật (là các vi khuẩn coliform có cùng khả năng lên men và các đặc tính sinh hoá nhưng nuôi cấy ở nhiệt độ 440C đến 44.50C) [2]. Thực tế, kiểm nghiệm Coliform chịu nhiệt (Feacal Coliform) được quan tâm nhiều hơn Coliform. Coliform chịu nhiệt (Feacal Coliform) có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter.
Sự hiện diện của Coliform chịu nhiệt (Feacal Coliform) với số lượng lớn trong mẫu thì khả năng nguồn nước bị nhiễm bẩn từ chất thải của con người, động vật và có khả năng chứa các vi sinh vật khác có nguy cơ gây bệnh. Trong các thành viên của nhóm Coliform chịu nhiệt thì E.coli là loài được sự quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn nguồn nước [1]
Escherichia coli
E.coli là vi sinh vật hiếu khí tùy ý hiện diện trong đường ruột của người và các loài động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E.coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên có 4 chủng có thể gây bệnh cho người và một số loài động vật là Enteropathogenic E.coli (EPEC), Enterotoxigenic E.coli (ETEC), Enteroinvasive E.coli (EIEC) và Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC) [1]. Các loài E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Gần đây các nhà khoa học còn chúng minh được rằng E.coli cũng hiện diện trong những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ. Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến. Các dòng E.coli gây bệnh gây ra các triệu chứng rối loạn đường tiêu hóa. Biểu hiện lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến rất nặng, có thể gây chết người phụ thuộc vào mức độ nhiễm, chủng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người.
3. Các kỹ thuật phân tích vi sinh
Hiện nay, ba Phương pháp chính để phát hiện và đếm số lượng vi sinh chỉ thị, như là: phương pháp MPN (Most probable number - Đếm số có xác xuất lớn nhất), phương pháp MF (Membrane-filter - Màng lọc), và phương pháp đếm đĩa. Ngoài ra, thử nghiệm P/A (presence/absence – có mặt/không có mặt) đối với vi khuẩn coliforms được phê duyệt cho mục đích báo cáo theo NPDWR (National Primary Drinking Water Regulations - Quy định nước uống quốc gia). Tất cả các phương pháp sử dụng môi trường được tạo ra cho sự phát triển và nhận diện các sinh vật cụ thể. Nhìn chung, mỗi phương pháp bao gồm các chất ức chế, nhiệt độ giới hạn, và/ hoặc chất dinh dưỡng để hạn chế sự phát triển của các loài không mong muốn.
3.1. Phương pháp MPN (Most probable number)
Thử nghiệm tiêu chuẩn cho nhóm coliform có thể được thực hiện bằng phương pháp lên men nhiều ống. Khi phương pháp nhiều ống được sử dụng, mật độ Coliform được ước tính thông qua Bảng số có xác suất cao nhất (MPN). Con số này, được tạo bằng các công thức xác suất cụ thể, là ước tính mật độ trung bình của Coliform trong mẫu. Kết quả xét nghiệm coliform, cùng với các thông tin khác thu được từ khảo sát kỹ thuật hoặc khảo sát vệ sinh, cung cấp một đánh giá tốt nhất về hiệu quả xử lý nước và chất lượng vệ sinh của nguồn nước.
Độ chính xác của thử nghiệm lên men trong việc ước tính mật độ Coliform phụ thuộc vào số lượng ống được sử dụng. Thông tin hài lòng nhất sẽ thu được khi mẫu cấy lớn nhất được kiểm tra cho thấy axit hoặc khí trong một vài hoặc tất cả các ống và mẫu cấy nhỏ nhất cho thấy không có axit hoặc khí trong bất kỳ hoặc phần lớn các ống. Mật độ vi khuẩn được ước tính bằng công thức đã cho hoặc dựa trên bảng sử dụng số lượng ống dương tính trong nhiều độ pha loãng (SMEWW 9221C:2017)[3]. Số lượng mẫu được chọn sẽ được điều chỉnh bởi độ chính xác mong muốn của kết quả. Bảng MPN dựa trên giả thuyết phân phối Poisson (phân tán ngẫu nhiên). Tuy nhiên, nếu mẫu không được lắc đều hoặc nếu các vi khuẩn đóng cục, giá trị MPN sẽ được đánh giá thấp về mật độ vi khuẩn thực tế.
3.2. Phương pháp màng lọc (Membrane-filter)
Phương pháp màng lọc yêu cầu lọc một thể tích mẫu thích hợp qua một màng lọc có kích thước đủ nhỏ để giữ lại các sinh vật cần phân tích. Sau đó, màng lọc được đặt trong một môi trường agar thích hợp, hoặc đệm bão hòa với môi trường dinh dưỡng, sau đó được ủ. Nếu sinh vật cần phân tich có mặt, các khuẩn lạc sẽ phát triển trên màng lọc. Các khuẩn lạc được kiểm tra với kính hiển vi có độ phóng đại 10-15X, và sau đó được xác định bởi kích thước, màu sắc và độ bóng. Các khuẩn lạc điển hình được đếm và số lượng được báo cáo là số lượng khuẩn lạc trong 100 mL mẫu.
3.3. Phương pháp đếm đĩa
Các phương pháp đếm đĩa dị dưỡng cung cấp một phương tiện chuẩn hóa để xác định mật độ vi khuẩn dị dưỡng hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí trong nước. Phương pháp đếm đĩa tiêu chuẩn được thực hiện bằng cách đổ môi trường thạch agar hóa lỏng vào một đĩa petri và thêm mẫu. Sau khi mẫu được hòa trộn với môi trường, đĩa được để cho đông đặc lại trước khi chúng được đảo ngược và ủ. Số lượng được tính của các khuẩn lạc phát triển và được báo cáo là đơn vị khuẩn lạc (CFU) trên 1 mL mẫu nước.
3.4. Thử nghiệm P/A (Presence/Absence)
Quy định về nước uống của US EPA chỉ yêu cầu báo cáo sự có mặt hoặc không có mặt (P/A) của coliform. Không giống như phân tích MPN và MF, thử nghiệm P/A là một thử nghiệm định tính, không đưa ra kết quả số lượng cụ thể. Thử nghiệm P/A là một dụng cụ sàng lọc hiệu quả khi yêu cầu đảm bảo vi sinh coliform bằng 0 trên một số lượng lớn mẫu.
Phương pháp này yêu cầu 100mL mẫu và môi trường dinh dưỡng bromcresol purple P/A broth (theo tài liệu Các phương pháp chuẩn cho phân tích nước và nước thải) hoặc lauryl tryptose broth với một ống duham bên trong. Môi trường bromcresol purple P/A broth bao gồm lactose, lauryl tryptose, và chỉ thị bromcresol purple. Mẫu được ủ trong 24 đến 48 giờ ở 35 ± 0.5 °C. Một màu vàng, chỉ thị sự hình thành axit từ quá trình lên men lactose, chỉ thị một kết quả dương tính. Ống duham cũng có thể được thêm vào để chỉ thị sự hình thành khí.
(Nguyễn Bảo Ngọc - Phòng Phân tích môi trường)
Tài liệu tham khảo
[1] Trần Linh Thước. Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục, 2006.
[2] TCVN 6182-2:1996. Chất lượng nước – xác định – phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform chịu nhiệt và Escherichia Coli giả định. Phần 2. Phương pháp nhiều ống (Số có xác suất cao nhất)
[3] SMEWW 9221C:2017. Estimation of Bacterial Density
