Nghiên Cứu định Lượng Saponin Triterpenoid Trong Cao Rau ... - 123doc

Có thể bạn quan tâm

Tải bản đầy đủ (.pdf) (112 trang)

Trang chủ

Cao đẳng - Đại học

Y - Dược

Nghiên cứu định lượng saponin triterpenoid trong cao rau má bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.38 MB, 112 trang )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOBỘ Y TẾTRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘIBÙI THỊ THẢONGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNGSAPONIN TRITERPENOID TRONGCAO RAU MÁ BẰNG SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAOLUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌCHÀ NỘI – 2018BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOBỘ Y TẾTRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘIBÙI THỊ THẢONGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNGSAPONIN TRITERPENOID TRONGCAO RAU MÁ BẰNG SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAOLUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌCCHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU-DƢỢC CỔ TRUYỀNMÃ SỐ: 8720206Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Đỗ QuyênTS. Hà Vân OanhHÀ NỘI - 2018LỜI CẢM ƠNTrong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận đƣợcrất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các thầy cô giáo cùng đồng nghiệp, cơ quan, giađình và bạn bè.Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS.Đỗ Quyên, TS. Hà Vân Oanh, Ths. Phạm Tuấn Anh những ngƣời thầy đã trựctiếp hƣớng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình và động viên tôi trong suốt quá trìnhhọc tập và nghiên cứu khoa học.Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, Phòng sau đạihọc, các thầy cô giáo bộ môn Thực vật - Dƣợc liệu – Dƣợc cổ truyền – Đại họcDƣợc Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến cho tôi trong quátrình thực hiện nghiên cứu.Lời cuối cùng, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình vàbạn bè đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập vàđạt đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay.Hà Nội, ngày 03 tháng 4 năm 2018Học viênBùi Thị ThảoMỤC LỤCDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮTDANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊDANH MỤC CÁC BẢNGĐẶT VẤN ĐỀ1Chƣơng 1: TỔNG QUAN21.1. Tổng quan về cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urb)21.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của cây Rau má21.1.2. Thành phần hóa học41.1.3. Tác dụng dược lý và công dụng của cây Rau má61.2. Tổng quan về các phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoid10trong cây Rau má1.2.1. Chuyên luận Rau má và phương pháp định lượng saponin10triterpenoid trong một số chuyên luận Dược điển1.2.2. Các nghiên cứu khác12Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU172.1. Đối tƣợng nghiên cứu172.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị172.2.1. Chất chuẩn172.2.2. Hóa chất172.2.3. Thiết bị172.3. Phƣơng pháp nghiên cứu182.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong cao18Rau má bằng HPLC2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong19cao Rau má bằng HPLC2.3.3. Định lượng saponin triterpen trong một số mẫu cao Rau má212.3.4. Phương pháp xử lý số liệu22Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU233.1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng saponin23triterpenoid trong cao Rau má bằng HPLC3.1.1. Kết quả điều chế cao khô Rau má233.1.2. Triển khai các phương pháp định lượng saponin triterpenoid24trong cao Rau má bằng HPLC3.1.3. Chương trình sắc ký định lượng saponin triterpenoid của cao Rau33má bằng HPLC3.1.4. Thẩm định phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong34cao Rau má bằng HPLC3.2. Kết quả định lƣợng saponin triterpen trong một số mẫu cao Rau má414. CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN464.1. Về xây dựng chƣơng trình sắc ký464.2. Về thẩm định phƣơng pháp474.3. Về kết quả định lƣợng saponin triterpen trong một số mẫu cao Rau48máKẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT49A. KẾT LUẬN49B. ĐỀ XUẤT50TÀI LIỆU THAM KHẢOPHỤ LỤCSTTDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮTKý hiệu,Tên đầy đủchữ viết tắt1ACN2As3AOAC3DAD4DĐVN5EP6EtOH78HPLCHPTLCAcetonitrilAsymmetry factor: Hệ số đối xứng picAssociation of Official Analytical Chemists: Hiệp hội cácnhà hóa phân tích chính thứcDiode array detector: Detector mảng diodDƣợc điển Việt NamEuropean Pharmacopoeia: Dƣợc điển Châu ÂuEthanolHigh performance liquid chromatography: Sắc ký lỏnghiệu năng caoHigh performance thin layer chromatography: Sắc ký lớpmỏng hiệu năng cao9MeOH10NXB11RCorrelation coefficient: Hệ số tƣơng quan12RsResolution: Độ phân giải13RP-HPLC14% RSD15SD16SKĐ17trRetention time: Thời gian lƣu18xGiá trị trung bình19USP20UV-VISMethanolNhà xuất bảnReverse phase-HPLC: Sắc ký lỏng pha đảo% Relative standard deviation: % Độ lệch chuẩn tƣơng đốiStandard deviation: Độ lệch chuẩnSắc ký đồUnited States Pharmacopoeia: Dƣợc điển MỹUltraviolet-Visible: Tử ngoại và khả kiếnDANH MỤC CÁC BẢNGSTTBảng 1.1Tên bảngCác điều kiện định lƣợng saponin triterpenoid trong Rau mábằng HPLCBảng 3.1 Khối lƣợng cao Rau máBảng 3.2Bảng 3.3Bảng 3.4Bảng 3.5Bảng 3.6Trang13, 14,1524Thời gian lƣu và diên tích pic của mẫu chuẩn asiaticosid khitiêm 6 lần lặp lại ở nồng độ 300µg/ml35Thời gian lƣu 6 chất của mẫu cao Rau má chuẩn khi tiêm 6 lầnlặp lại ở nồng độ 5 mg/ml35Diện tích pic của cao Rau má chuẩn 6 chất của mẫu cao Rau máchuẩn khi tiêm 6 lần lặp lại ở nồng độ 5 mg/ml36Tổng diện tích pic saponin triterpenoid và hàm lƣợng saponintriterpenoid tính theo asiaticosid của 6 mẫu thử CRM-9638Tổng diện tích pic saponin triterpenoid và hàm lƣợng saponintriterpenoid tính theo asiaticosid của 12 mẫu thử CRM-96Bảng 3.7 Nồng độ của 6 mẫu thử thêm chuẩn4041Hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần, hàm lƣợng saponinBảng 3.8 glycosid và hàm lƣợng saponin aglycon trong các mẫu cao Raumá42, 43DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊSTTTên hìnhTrangHình 1.1Đặc điểm thực vật cây Rau má3Hình 1.2Cấu trúc các saponin triterpenoid khung ursan trong Rau má4Hình 1.3Cấu trúc saponin triterpenoid khung oleanan trong Rau má5Hình 3.1Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid theo chƣơng trình 125Hình 3.2Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 125Hình 3.3Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid theo chƣơng trình 227Hình 3.4Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 227Hình 3.5Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid theo chƣơng trình 329Hình 3.6Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 329Hình 3.7Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid theo chƣơng trình 430Hình 3.8Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 430Sắc ký đồ của các mẫu cao: CRM-30; CRM-70; cao Rau máHình 3.9chuẩn; CRM-96 theo chƣơng trình 432Sắc ký đồ các mẫu cao Rau má chuẩn; mẫu CRM-96; mẫuHình 3.10chuẩn asiaticosid; mẫu trắng37Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích pic38Hình 3.12 Sắc ký đồ của 6 mẫu thử CRM-9638ĐẶT VẤN ĐỀCây Rau má (Centella asiatica (L.) Urban) là một loại cây mọc nhiều ởnƣớc ta, đƣợc ngƣời dân sử dụng làm rau để ăn hoặc dùng tƣơi, xay lấy nƣớcuống để giải nhiệt, giải độc [4] ngoài ra Rau má còn đƣợc giã nát, đắp ngoài làmtan các vết bầm tím do ngã, làm tan ung nhọt [1]. Thành phần hóa học của câyRau má đã đƣợc nghiên cứu gồm các nhóm chất nhƣ: saponin, flavonoid, tinhdầu …[29]. Trong đó, saponin triterpenoid là thành phần chính, và là nhóm chấtchính có hoạt tính sinh học của cây Rau má nhƣ làm lành vết thƣơng, vết bỏng[13] ; chống oxi hóa [28], chống trầm cảm trên thực nghiệm [66], [67]…Hiện nay, một số sản phẩm nhƣ kem bôi liền sẹo Madecassol®, Vicenla®,hay viên nang Helaf® hỗ trợ điều trị trĩ, táo bón và kiết lỵ đang đƣợc lƣu hànhtrên thị trƣờng có thành phần chính là cao Rau má. Tuy nhiên, Dƣợc điển ViệtNam V [2] trong chuyên luận Rau má chƣa có chỉ tiêu định lƣợng nhóm chấtsaponin triterpenoid. Để góp phần đảm bảo chất lƣợng các chế phẩm thuốc từdƣợc liệu nói chung và cao Rau má nói riêng, chúng tôi tiến hành thực hiện đềtài “Nghiên cứu định lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má bằng sắc kýlỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu chính:- Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoidtrong cao Rau má bằng HPLC;- Ứng dụng phƣơng pháp HPLC đã xây dựng để định lƣợng saponintriterpenoid trong một số mẫu cao Rau má.1Chƣơng 1.TỔNG QUAN1.1. Tổng quan về cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urb)1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của cây Rau máVị trí cây Rau má trong hệ thống phân loại thực vậtTheo hệ thống phân loại của Takhtajan [58], cây Rau má thuộc chiCentella (L.) Urban, một chi nằm trong họ Hoa tán (Apiaceae). Vị trí phân loạicủa loài Centella asiatica (L.) Urb trong hệ thống phân loại thực vật có thể tómtắt nhƣ sau:Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)Phân lớp Thù du (Cornidae)Bộ Nhân sâm (Hoa tán) (Apiales)Họ Hoa tán (Apiaceae)Chi Centella (L.) UrbanTheo Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ [3], chi Centella (L.) Urban ởViệt Nam chỉ có 1 loài, C. asiatica, trong khi đó chi Centella (L.) Urban trên thếgiới có hơn 50 loài theo The plant list đã đƣợc công nhận [60].Đặc điểm thực vậtCây thảo nhỏ, cao 7 – 10 cm. Thân mảnh, mọc bò, hơi có lông khi còn non,bén rễ ở các mấu. Lá mọc so le, nhƣng thƣờng tụ họp 2 – 5 cái ở một mấu, phiếnlá nhẵn, hình thận hoặc gần tròn, mép khía tai bèo; cuống lá mảnh, dài 3 – 5 cm,có khi đến 7 – 8 cm [1], [4].Cụm hoa gồm những tán đơn mọc riêng lẻ hoặc 2 – 5 cái ở kẽ lá, mỗi tánmang 1 – 5 hoa (thƣờng là 3) màu trắng hoặc phớt đỏ, hoa giữa không có cuống;tổng bao có 2 – 3 mảnh hình trái xoan, lõm, dạng màng; cánh hoa hình tam giáchoặc trái xoan; nhị có chỉ nhị ngắn, bao phấn hình mắt chim; bầu hình cầu [1],[4].2Quả màu nâu đen, đỉnh lõm, có 7- 9 cạnh lồi, nhẵn hoặc có lông nhỏ, cóvân mạng. Mùa hoa quả từ tháng 4 đến tháng 6 [1], [4].Hình 1. Đặc điểm thực vật cây Rau máChú thích: 1. Toàn cây, 2. Hình thái lá, 3. Cách mọc của lá, 4. Hai mặt lá; 5. Cáchmọc của cụm hoa, 6. Cụm hoa, 7. Hoa nguyên vẹn, 8. Tràng hoa, 9. Bầu và bộ nhị, 10.Bầu cắt dọc, 11. Bầu cắt ngang.Phân bốChi Centella (L.) Urban phân bố tập trung ở vùng Bắc Phi, còn loàiCentella asiatica (L.) chỉ thấy ở vùng nhiệt đới Nam và Đông Nam Á, các tỉnhNam Trung Quốc bao gồm cả đảo Hải Nam [1], [4].Ở Việt Nam, Rau má là loại cây rất quen thuộc. Cây mọc tự nhiên khắpnơi, từ vùng hải đảo, ven biển đến vùng núi, độ cao dƣới 1800 m. Ở một số nơi3thuộc vùng Nam và Đông Nam Á, Rau má phân bố đến độ cao 2500 m. Cây ƣaẩm, hơi chịu bóng; thƣờng mọc thành đám ở vƣờn, bãi sông suối, nƣơng rẫy, bờruộng cao và ven rừng [1], [4].1.1.2. Thành phần hóa họcThành phần hóa học của cây Rau má gồm saponin triterpenoid, alcaloid,flavonoid, tinh dầu, acid béo, các vitamin B, C và một số acid amin khác [1],[20], [29].- Saponin triterpenoid: là thành phần chính và quan trọng nhất của Rau mágồm các triterpenoid nhƣ asiaticosid, madecassosid, centellosid và các acidtriterpenic là acid asiatic, acid madecassic, acid centellic, acid brahmic,isobrahmic …[20]. Trong số các saponin triterpenoid nêu trên, 6 hợp chấtasiaticosid B - acid terminolic, madecassosid - acid madecassic, và asiaticosid acid asiatic là 3 cặp glycosid - aglycon tƣơng ứng là thành phần chính, chiếm đasố [8], [64].Về cấu trúc các saponin triterpenoid trong Rau má có thể đƣợc chia thành2 nhóm chính: cấu trúc ursan và oleanan.Nhóm ursan gồm 4 saponin chính là asiaticosid, madecassosid, acidasiatic, và acid madecassic. Hai glycosid (asiaticosid, madecassosid) đều có 3đơn vị đƣờng nối với phần aglycon bằng dây nối ester, không phải dây nối Oglycosid [20].- Acid asiatic: R = H, R1 = OH- Acid madecassic: R = OH, R1 = OH- Asiaticosid: R = H, R1 = O – Glu(6→1) – Glu (4→1) - Rham- Madecassosid: R = OH, R1 = O –Glu (6→1) – Glu ( 4→1) - RhamHình 1.1. Cấu trúc các saponin triterpenoid khung ursan trong Rau má4Nhóm oleanan gồm 2 saponin chính là asiaticosid B và acid terminolic.Hai chất này cũng là 1 cặp glycosid - aglycon tƣơng ứng.- Acid terminolic: R = OH, R1 = OH- Asiaticosid B: R = OH, R1 = O - Glu(6→1) – Glu (4→1) - RhamHình 1.2. Cấu trúc saponin triterpenoid khung oleanan trong Rau má- Flavonoid: bên cạnh nhóm chất chính saponin triterpenoid thì flavonoidcũng đƣợc tìm thấy nhiều trong Rau má. Các flavonoid này đa số ở dạngglycosid,nhƣ3-βglucosylquercetin,3-βglucosylkaempferol,7-β-glucosylkaempferol, có phần aglycon là các flavon [29].- Tinh dầu: Theo Quin và cộng sự, thành phần tinh dầu của Rau má tƣơngtự nhƣ những loài thuộc chi Hydrocotyle (họ Apiaceae), trong đó caryophyllen,farnesol, và elemen là các cấu tử chính [49]Năm 2002, nhóm nghiên cứu ngƣời Malaysia đã tiến hành cất kéo hơinƣớc riêng rẽ các bộ phận lá, thân bò và rễ Rau má và phân tích GC-MS chothấy cả ba mẫu thí nghiệm đều có tinh dầu với hàm lƣợng khác nhau. Tuy nhiên,trong khi rễ và thân bò chỉ phát hiện có thành phần sesquiterpen thì lá chứa cảmonoterpen và diterpen. Các cấu tử chính trong cả ba mẫu nghiên cứu là βcaryophylen, α-humulen, (e)-b-farnesen, epi-bicyclosesquiphellandren, δcadinen, α-copaen và β-elemen [41].Một nghiên cứu khác (2005) cho thấy mẫu Rau má mọc ở Nam Phi có hàmlƣợng tinh dầu chỉ đạt 0,06% (tt/tt), trong đó có 11 hydrocarbon monoterpenoid,9 dẫn chất monoterpenoid oxi hóa, 15 hydrocarbon sesquiterpenoid, 5 dẫn chấtsesquiterpenoid oxi hóa và 1 sesquiterpenoid sulfid. Các cấu tử chính trong tinhdầu là α-humulen, β-caryophyllen và bicyclogermacren [42].5Nhƣ vậy, qua các nghiên cứu về tinh dầu đƣợc thực hiện bởi nhiều tác giảkhác nhau, mẫu thu hái ở các thời gian và địa điểm khác nhau thì kết quả đềucho thấy β-caryophyllen là thành phần chính luôn có mặt trong các bộ phận Raumá.- Acid amin: trong Rau má có chứa một số acid amin nhƣ alanin, arginin,acid aspartic, acid glutamic…[1], [20].- Ngoài ra Rau má còn có một số thành phần khác nhƣ alcaloid, tannin,sterol, phenolic, carbohydrat, vitamin, chất khoáng …[29], [64].1.1.3. Tác dụng dƣợc lý và công dụng của cây Rau máTác dụng làm lành vết loét dạ dàyDịch chiết rau má có tác dụng ngăn chặn ổ loét dạ dày ở chuột thí nghiệmbị stress do gò bó và hạ nhiệt [16] hoặc gây loét bằng tác nhân acid acetic [18].Ngoài ra, Rau má còn có tác dụng tốt trong việc ngăn chặn tác hại của ethanollên niêm mạc dạ dày thông qua tăng cƣờng hàng rào niêm mạc và giảm tác độnggây hại của gốc tự do [17].Thử nghiệm lâm sàng trên ngƣời lớn cho thấy 93 % ca loét dạ dày tá tràngđƣợc điều trị với chế phẩm từ rau má cho thấy hiệu quả rõ rệt. Thử nghiệm đƣợctiến hành trên ngƣời lớn bình thƣờng cho thấy làm tăng số lƣợng hồng cầu vàđƣờng máu, tăng nồng độ hemoglobin, cholesterol huyết tƣơng và protein toànphần; giảm nồng độ ure và phosphat máu [16].Tác dụng lên da và quá trình làm lành vết thươngDịch chiết toàn phần và phân đoạn triterpenoid từ Rau má tác động lênnhiều giai đoạn khác nhau của quá trình khôi phục tổn thƣơng da. Nó có tácdụng tăng sinh tế bào, tăng quá trình tổng hợp, trƣởng thành và liên kết chéocủa collagen và tăng biểu mô hóa tế bào và tạo mạch ở vị trí tổn thƣơng; qua đócó tác dụng thúc đẩy nhanh quá trình làm lành vết thƣơng [57], [59].6Chế phẩm kem từ dịch chiết ethanol Rau má đƣợc chứng minh có tác dụngcải thiện kết cấu da và tăng tái tạo da ở ngƣời cao tuổi. Thuốc cũng cải thiệntriệu chứng ngứa và các rối loạn khác về da [57].Thử nghiệm lâm sàng với chế phẩm kem chứa cao Rau má, α-tocopherolvà collagen-elastin hydrolysat cho thấy chế phẩm giúp ngăn chặn sự phát triểncủa các vết rạn trên da ở phụ nữ mang thai có tiền sử rạn da ở lần mang thaitrƣớc đó [59].Tác dụng điều hòa miễn dịch, chống ung bướu và gây độc tế bàoMột số nghiên cứu thử nghiệm trên chuột cho thấy Rau má và các thànhphần hoạt tính của nó có tác dụng điều hòa miễn dịch rất tốt [46], [65].Uống chế phẩm Brahma Rasayana có chứa Rau má làm tăng đáng kể sốlƣợng tế bào máu, tế bào tủy xƣơng, tế bào NK trên chuột bị tiếp xúc với bức xạgamma. Bên cạnh đó, thuốc còn làm giảm tác động của tia bức xạ gây ra sựperoxid hóa ở gan, mà cơ chế có thể là giúp tăng sinh tế bào gốc và ngăn chặngốc tự do gây tổn thƣơng [32], [65].Dịch chiết thô và các phân đoạn chiết từ Rau má có tác dụng làm chậm sựphát triển của các khối u rắn và cổ trƣớng do tác động trực tiếp lên quá trìnhtổng hợp DNA [10], điều hòa sản xuất yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và nitricoxid ở đại thực bào là yếu tố đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng viêm vàchống viêm [45]; giúp tăng thời gian sống của chuột có khối u đang phát triển.Nghiên cứu cho thấy dịch chiết nƣớc Rau má có tác dụng ngăn chặn quátrình sinh ung thƣ ruột kết [14]; hoạt chất acid asiatic có tác dụng chống ung thƣda [43].Tác dụng lên thần kinh trung ươngDịch chiết nƣớc từ Rau má có tác động tốt lên khả năng học tập, giúp tăngcƣờng trí nhớ và khả năng nhận thức trên chuột và trẻ em [40].Rau má có tác dụng bảo vệ và phục hồi tế bào thần kinh thông qua thúc đẩytái tạo dây thần kinh, làm dài sợi trục trên in vitro. Hoạt chất acid asiatic cũng7đƣợc chứng minh hiệu quả trong điều trị tổn thƣơng neuron do ngăn chặn sự oxihóa tế bào thần kinh [33], [56].Triterpenoid từ Rau má có tác dụng chống trầm cảm ở chuột bị ép bơithông qua làm giảm nồng độ corticosteron huyết tƣơng, cải thiện sự mất thăngbằng acid amin và tăng hàm lƣợng chất dẫn truyền thần kinh monoamin trongnão chuột [66], [67].Một số nghiên cứu cho thấy Rau má, đặc biệt là phân đoạn saponin có tácdụng an thần và giảm đau trên chuột thí nghiệm; giảm hoạt động của dây thầnkinh vận động và tăng tác dụng của thuốc an thần gây ngủ barbiturat. Tác dụngcủa các hoạt chất trong rau má lên hệ thần kinh trung ƣơng giống vớichlorpromazin và reserpin [37].Cao khô dịch chiết methanol và ethyl acetat từ Rau má có tác dụng giải loâu trên mô hình chữ thập nâng cao [33].Tác dụng lên tim mạchRau má có tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim khỏi tác động của chất gây tổnthƣơng cơ tim (Adriamycin) [25] và cải thiện tình trạng tổn thƣơng tái tƣới máuvà thiếu máu cục bộ cơ tim (nguyên nhân gây nhồi máu cơ tim) ở chuột thínghiệm [44].Thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng và mù đôi trên các bệnhnhân mắc chứng tăng huyết áp tĩnh mạch cho thấy rau má và các saponin từ Raumá giúp cải thiện tình trạng phù mắt cá chân, cải thiện vi tuần hoàn, tăng hiệuquả lọc ở mao mạch và tác dụng này phụ thuộc vào liều sử dụng [11], [15], [26].Tác dụng bảo vệ ganNghiên cứu in vitro cho thấy Rau má có tác dụng chống ung thƣ gan [34].Phân đoạn glycosid từ rau má hiệu quả trong việc ngăn chặn tác nhândimethylnitrosamin gây xơ gan ở chuột [38].Thực tế trên lâm sàng đã sử dụng cao Rau má chuẩn hóa giúp cải thiện rốiloạn chức năng gan mạn tính ở ngƣời [21].8Tác dụng chống viêm và chống oxi hóaRau má và các hoạt chất saponin của nó thể hiện hoạt tính kháng viêm tốttrên thực nghiệm. Cơ chế kháng viêm đƣợc cho là do giảm sự sản sinh NO vàngăn chặn tác động của tia xạ có hại lên cơ thể, nhờ đó cũng giúp tổn thƣơng dễdàng hồi phục [35].Tác dụng chống oxi hóa của Rau má đƣợc nghiên cứu trên các mô hìnhkhác nhau. Dịch chiết methanol Rau má thể hiện tác dụng chống oxi hóa trênchuột có khối u lympho [28]. Dịch chiết còn cho thấy hoạt tính bảo vệ tế bàothần kinh chuột khỏi các tổn thƣơng oxy hóa gây nên, giúp chống lão hóa hiệuquả.Ngoài ra, Rau má còn sở hữu rất nhiều tác dụng dƣợc lý khác đã đƣợcchứng minh thông qua các thử nghiệm in vitro và in vivo nhƣ tác dụng tăng đồnghóa, chống lao và phong, chống vảy nến, chống giun sán và đơn bào, chốngvirus, chống co thắt, chống sinh sản quá nhanh ở chuột [7], [52], [53], [69].Công dụngHầu hết các tác dụng của Rau má đều đƣợc ứng dụng để chữa bệnh. Hiệnnay loại cây thảo quý này đƣợc dùng cả theo phƣơng pháp Y học dân gian và Yhọc hiện đại.Nhân dân ta dùng Rau má làm rau sống để ăn. Nƣớc rau má là loại nƣớcgiải khát phổ biến ở các tỉnh phía Nam. Hay dùng tƣơi, xay với nƣớc, lọc lấydịch ép thêm đƣờng để uống, ngày dùng 30-40g [1], [4].Trong Y học dân gian ở các nƣớc trên thế giới, Rau má đƣợc dùng rộngrãi làm thuốc chữa các bệnh ngoài da nhƣ rôm sảy, mẩn ngứa, làm thuốc liềnsẹo; đắp ngoài chữa các vết thƣơng do ngã, gãy xƣơng, bong gân và làm tan ungnhọt. Rau má còn đƣợc sử dụng đơn lẻ hay phối hợp với các vị thuốc khác theođƣờng toàn thân, chữa các bệnh về gan, chữa loét dạ dày, sốt, cảm mạo, đau đầu,thổ huyết, kiết lỵ, viêm amidan, viêm phế quản và viêm đƣờng tiết niệu [1], [4].Một số nƣớc nhƣ Trung Quốc, Ấn Độ dùng Rau má làm thuốc bổ thần kinh.9Trong công nghệ dƣợc phẩm, Rau má đƣợc chiết xuất bào chế thành caođịnh chuẩn, có hàm lƣợng hoạt chất xác định (saponin triterpenoid tính theoasiaticosid) làm nguyên liệu bán thành phẩm.Một số dạng chế phẩm chứa cao Rau má đang lƣu hành hiện nay- Kem chống lão hóa- Kem dƣỡng da làm lành vết sẹo- Dầu gội để điều trị tóc hƣ- Nƣớc uống rau má và chè thanh nhiệt- Gotu kola herb 435 mg: Tăng cƣờng hệ miễn dịch góp vai trò chuyển hóatốt cho cơ thể giúp giảm acid uric, rối loạn lipid máu. Tăng cƣờng dƣỡng chấtcho não, trung hòa các gốc tự do, bảo vệ và chống lão hóa cho tế bào thần kinhnão. Giúp thanh nhiệt giải độc, giải độc gan, giúp dƣỡng âm.1.2. Tổng quan về các phương pháp định lượng saponin triterpenoidtrong cây Rau máCác phƣơng pháp đã đƣợc triển khai để định lƣợng saponin triterpenoid,thành phần hoạt chất chính của cây Rau má, bao gồm các phƣơng pháp so màu,quang phổ, sắc ký lỏng. Trong đó sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phƣơngpháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất để định lƣợng saponin triterpenoid trong câyRau má, có thể xác định hàm lƣợng đơn thành phần là asiaticosid hay acidasiatic, hoặc định lƣợng đồng thời đa thành phần 2, 3 hoặc 4 chất asiaticosid,madecassosid, acid asiatic, acid madecasic trong cùng một phép thử.1.2.1. Chuyên luận Rau má và phương pháp định lượng saponintriterpenoid trong một số chuyên luận Dược điểnChuyên luận Rau má trong Dƣợc điển Việt Nam V [2] quy định dƣợc liệulà toàn cây tƣơi hoặc phơi khô của cây rau má (Centella asiatica (L.) Urban).Về chỉ tiêu định lƣợng, Dƣợc điển Việt Nam V mới chỉ xác định chất chiếtđƣợc trong dƣợc liệu bằng phƣơng pháp cân, chƣa xác định đƣợc hàm lƣợngsaponin triterpenoid toàn phần trong Rau má.10Dƣợc điển Trung Quốc [19] có chuyên luận về dƣợc liệu Rau má, quyđịnh dƣợc liệu là toàn bộ cây phơi khô của cây Rau má (Centella asiatica (L.)Urban). Hàm lƣợng saponin triterpenoid của Rau má đƣợc tính theo hàm lƣợngcủa madecassosid và asiaticosid, yêu cầu ≥ 0,8 % (tính theo dƣợc liệu khô tuyệtđối), xác định hàm lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC với pha động là ACN : H2O(chứa 2 µmol/l β-cyclodextrin), chƣơng trình đẳng dòng theo tỉ lệ [24 : 76],detector UV, bƣớc sóng 205 nm.Chuyên luận Rau má của Dƣợc điển Châu Âu (EP 8.0) [22], quy địnhdƣợc liệu Rau má là phần trên mặt đất, phơi khô của cây Rau má (Centellaasiatica (L.) Urban). Yêu cầu về hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phầnđƣợc tính theo asiaticosid, gồm 4 chất: madecassosid, asiaticosid, acidmadecassic, acid asiatic, với hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần ≥ 6 %.Sử dụng HPLC với pha tĩnh là cột sắc ký ODS, thành phần pha động gồm cókênh A (ACN) và kênh B (H3PO4 0,3 %), gradient nồng độ. Tốc độ dòng 1ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, detector UV, λ = 200 nm.Thời gian (phút)0 – 6565 – 6666 – 7676 – 8522559522Kênh A (%)Năm 2017, chuyên luận Rau má của Dƣợc điển Châu Âu (EP 9.0) [ 23]đã thay đổi so với EP 8.0, vẫn quy định hàm lƣợng saponin triterpenoid của câyRau má ≥ 6 % tuy nhiên, bên cạnh 4 chất đã nêu trong chuyên luận EP 8.0, thìcó thêm 2 chất là 1 cặp glycosid và aglycon tƣơng ứng asiaticosid B – acidterminolic đƣợc tính thêm vào hàm lƣợng saponin triterpenoid. Về cơ bản điềukiện sắc ký HPLC giống với chuyên luận của EP 8.0, chỉ khác về chƣơng trìnhpha động, cụ thể nhƣ sau:Thời gian (phút)0 – 6565 – 6666 – 75Kênh A (%)22 – 5555 – 9595Dƣợc điển Mỹ (USP 38) [62] có chuyên luận dƣợc liệu Rau má, bên cạnhđó cũng có chuyên luận về cao Rau má (Powdered Centella asitica L. Extract).11Điều kiện sắc ký để xác định hàm lƣợng saponin triterpenoid quy định trongDƣợc điển Mỹ và Châu Âu tƣơng đối giống nhau, chỉ khác một chút chƣơngtrình gradient nồng độ. Tuy nhiên, Dƣợc điển Mỹ chỉ yêu cầu hàm lƣợngsaponin triterpenoid trong cao Rau má ≥ 2 %.Thời gian (phút)0 – 6565 – 6666 – 7676 – 85Kênh A (%)22 – 5555 – 959522Nhận xét:Quy định về hàm lƣợng saponin triterpenoid của cây Rau má có sự khácbiệt giữa các Dƣợc điển Trung Quốc, Châu Âu và Mỹ. Trong đó, Dƣợc điểnChâu Âu (EP 9.0) quy định hàm lƣợng saponin triterpenoid cao nhất ≥ 6 %.Trong khi đó, Dƣợc điển Trung Quốc yêu cầu hàm lƣợng saponin triterpenoid ≥0,8 % và hàm lƣợng đƣợc tính theo 2 saponin glycosid là asiaticosid vàmadecassosid.1.2.2. Các nghiên cứu khácHiện trên thế giới có nhiều nghiên cứu định lƣợng saponin triterpenoidtrong cây Rau má bằng HPLC. Phần lớn các nghiên cứu thực hiện phân tích trêncột C18, một số ít nghiên cứu trên cột C8, không có nghiên cứu nào sử dụng cộtphenylsilyl silica gel. Hệ dung môi pha động thay đổi từ acetonitril và nƣớc/dung dịch acid hoặc methanol và nƣớc với các tỷ lệ khác nhau. Bƣớc sóng pháthiện đa số là khoảng từ 200 nm – 210 nm.Các nghiên cứu xác định hàm lƣợng saponin triterpenoid trong cây Rau mábằng HPLC, đơn thành phần hoặc đồng thời đa thành phần đƣợc tóm tắt ở bảng1.112Bảng 1.1. Các điều kiện định lƣợng saponin triterpenoid trong Rau má bằng HPLCSTTLoại mẫuPha tĩnh1.Dƣợc liệuRau máHiQ siL KYA -C182.Dƣợc liệuRau má3.Dƣợc liệuRau má4.Dƣợc liệuRau má5.6.Dƣợc liệuRau má(250  4,6mm, 5µm)Tốc độdòng(ml/phút)ACN : H2O với % ACNở 0 - 30 - 35 - 50 phútlà 20 - 55 - 55 – 20 %LiChrospher 18e(150 x 4mm, 5µm)EtOH:H2O [6 : 4]CLC-ODS (M)(250 x 4,6mm, 5µm)MeOH : H2O (1% TFA)[75 : 25] và [70 : 30]và [65 : 35]X-Terra® RP-18(150  4,6mm, 5µm)Phenomenex RPC18(250  4,6mm, 5µm)Dƣợc liệuRau máPha độngZorbax Eclipse XDB(150 x 4,6mm, 5µm)MeOH : ACN : H2O[5 : 57 : 38]MeOH : H2O với % MeOHở 0 - 8 - 12 - 18 - 20 - 25phút là 85 - 85 - 100 - 100 85 – 85 %MeOH : ACN với % MeOHở 0 - 30 phút là 80 – 45 %13Detector,bƣớc sóngphát hiệnHoạt chất địnhlƣợngTLTK[70]1ELSD1UV254 nm1UV220 nm1UV217 nmasiaticosid[36]asiaticosid[63]asiaticosidacid asiatic[61][54]1PDA205 nmacid asiatic1DAD206 nmasiaticosid;acid asiatic[12]STTLoại mẫuPha tĩnhPha độngTốc độdòng(ml/phút)Detector,bƣớc sóngphát hiện7.Dƣợc liệuRau máOptimapak C18(250 x 4,6mm, 5µm)8.Dƣợc liệuRau má9.Dƣợc liệuRau máHoạt chất địnhlƣợngACN : H2O với % ACN ở 030-35-40 phút là 20-55-5520 %1,4UVasiaticosid;acid asiaticC18(200 x 50mm, 5 µm)MeOH : H2O [60 : 40]100UV220 nmasiaticosid;madecassosidAgilent Zorbax SB-C18(150 x 4mm, 5µm)MeOH : H2O [50 : 50],(4 mmmol/L β-cyclodextrin)0,4UV204 nmasiaticosid B;madecassosidTLTK[31][24][30]10.11.12.Dƣợc liệuRau máDƣợc liệuRau máDƣợc liệuRau máAgilent Zorbax SB-C18(150 x 4mm, 5µm)MeOH : H2O [65 : 35],(4 mmmol/L β-cyclodextrin)COSMOSIL 5C18-MS-IIH2O (0,01 % acidtrifluoroacetic) vàacetonitril (1,0 % methyltert-butyl ether, 0,01 % acidtrifluoroacetic) [78 : 22]ZORBAX Eclipse XDB(150  4,6mm, 5µm)ACN : H2O (1mmol/LKH2PO4) (gradient)140,411UV204 nmacid madecassic;acid terminolicELSDasiaticosid,madecassosid,asiaticosid B[71]205 nmasiaticosid,madecassosid,acid asiatic,acid madecassosic[55]STTLoại mẫuPha tĩnhPha độngTốc độdòng(ml/phút)Detector,bƣớc sóngphát hiệnACN : H2O với % ACNở 0-5-10-20-30 phút là20-30-65-70 %1UV210 nm13.Dƣợc liệuRau máTSK-gel ODS-80Tm14.Dƣợc liệuRau máLiChroCART®(250 x 4mm, 5µm)ACN : H2O với % ACN ở0-15-30-35-40-45-55 phútlà 20-35-65-80-80-20-20 %1UV206 nm15.Dƣợc liệuRau máFused-Core® C18(100 x 3mm, 2,7 µm)ACN : acid formic 0,1 %với % ACN ở 0-8-17-23phút là 18-22-45-80 %0,64DAD(150  4,6mm, 5µm)15Hoạt chất địnhlƣợngasiaticosid,madecassosid,acid asiaticacid madecassosicasiaticosid,madecassosid,acid asiatic,acid madecassosicasiaticosid,madecassosid,acid asiatic,acid madecassosicTLTK[47][50][51]Nhận xét: từ Bảng 1.1 và tham khảo chuyên luận về Rau má trong Dƣợc điểncủa một số nƣớc, chúng tôi nhận thấy để định lƣợng saponin triterpenoid trongcây Rau má bằng phƣơng pháp HPLC, điều kiện sắc ký đƣợc sử dụng nhƣ sau:- Pha tĩnh: cột sắc ký C18. Kích thƣớc cột chủ yếu là 4,6 × 250 mm, vớihạt nhồi có kích thƣớc 5 µm.- Pha động: hệ dung môi thƣờng là ACN – H2O hoặc ACN – H3PO4 0,3%, gradient nồng độ.- Tốc độ dòng: tốc độ thƣờng sử dụng là 1ml/phút.- Detector: rất đa dạng có thể là detetor UV ở bƣớc sóng thấp (200 – 206nm); detector DAD, phát hiện ở bƣớc sóng 200 nm.Do vậy, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát phƣơng pháp định lƣợngsaponin triterpenoid trong cao Rau má với các điều kiện sắc ký tƣơng tự đã đƣợcáp dụng cho dƣợc liệu Rau má.16Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. Đối tƣợng nghiên cứuNguyên liệu nghiên cứu: gồm có+ Mẫu cao khô tự điều chế: từ phần trên mặt đất (lá và thân bò) cây Rau má(Centella asiatica (L.) Urban), đƣợc thu hái ở Thái Bình vào tháng 9/2017.+ Mẫu cao khô đang lƣu hành trên thị trƣờng: công ty A (mã số CRM-A)và công ty B (CRM-B).2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị2.2.1. Chất chuẩn- Chất chuẩn asiaticosid, độ tinh khiết đạt 88,1 % (ID: Y0001206, giấychứng nhận chất chuẩn của Hội đồng Dƣợc điển Châu Âu).- Cao Rau má chuẩn (Centella extract dry HRS), (ID: Y0001764, giấychứng nhận chất chuẩn của Hội đồng Dƣợc điển Châu Âu).2.2.2. Hóa chất- Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (MeOH, ACN) củaMerck.- Dung dịch acid phosphoric (H3PO4) đặc (d=1,685 g/cm3) của Merck.- Các dung môi, hóa chất dùng để xử lý mẫu (EtOH, MeOH) của TrungQuốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA)- Nƣớc cất hai lần.2.2.3. Thiết bị- Hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản): Gồm hệ 2 bơm LC-30AD, bộtiêm mẫu tự động SIL-30AHT, detector DAD, phần mềm Labsolution để truyxuất hình ảnh và số liệu trên máy HPLC.- Cột Shim-pack GIST C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm); tiền cột Shim-packGIST(G)- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ chính xác 0,0001 g.- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng Wisd (Hàn Quốc).17

Tài liệu liên quan

Báo cáo y học: "Nghiên cứu định lượng Pantoprazol trong huyết tương chó bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao" ppsx
- 6
- 727
- 0
nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
- 39
- 845
- 2
nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
- 35
- 662
- 2
Nghiên cứu định lượng Isoniazid trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn chất hóa trước cột
- 75
- 1
- 2
Nghiên cứu định lượng đồng thời xylomethazolin và dexamethason trong thuốc nhỏ mũi bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
- 47
- 828
- 0
Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
- 46
- 601
- 2
Xây dựng phương pháp phát hiện chất màu cấm pigment red 53 trong son môi và phấn má bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
- 36
- 419
- 2
Nghiên cứu tách các đồng phân quang học của atenolol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với một số pha tĩnh đối quang
- 7
- 627
- 8
Nghiên cứu tách các đồng phần quang học của atenolol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với một số pha tĩnh đối quang
- 7
- 539
- 5
Xây dựng phương pháp định tính, định lượng gentiopicrin trong kem VIEMDA AD bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
- 5
- 409
- 0