Xemtailieu Tải về Nghiên cứu định tính và định lượng curcuminoid toàn phần và xác định kích thước của chế phẩm nano curcumin chế tạo bằng phương pháp Sol-gel
BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CURCUMINOID TOÀN PHẦN VÀ XÁC ĐỊNH KÍCH THƢỚC CỦA CHẾ PHẨM NANO CURCUMIN CHẾ TẠO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SOL-GEL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CURCUMINOIDTOÀN PHẦN VÀ XÁC ĐỊNH KÍCH THƢỚC CỦA CHẾ PHẨM NANO CURCUMIN CHẾ TẠO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SOL-GEL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh 2. PGS.TS. Trần Việt Hùng Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa phân tích - Đại học Dược Hà Nội 2. Phòng Thí nghiệm trung tâm - Đại học Dược Hà Nội 3. Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương 4. Viện Khoa học Vật liệu HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Cô PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, định hướng, quan tâm, chỉ bảo, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS. Trần Việt Hùng, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã luôn dành thời gian giúp đỡ, định hướng, hỗ trợ, quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cảm ơn các thầy cô và cán bộ tại bộ môn Hóa phân tích của trường Đại học Dược Hà Nộivà các cán bộ Phòng Thí nghiệm Trung Tâm của Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện tốt nhất, chỉ bảo hỗ trợ tôi để tôi tiến bộ hơn trong kỹ năng làm thực nghiệm, đồng thời cũng động viên, khích lệ để tôi thêm tin tưởng và quyết tâm. Xin trân trọng cảm ơn ThS. Nguyễn Tuấn Anh cùng các cán bộ Khoa Kiểm nghiệm Đông Dược Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và PGS.TS Trần Đại Lâm cùng các cán bộ phòng Vật lý vật liệu từ và siêu dẫn của Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, hỗ trợ để tôi có cơ hội học hỏi và làm thực nghiệm tại phòng. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã là chỗ dựa tinh thần, luôn bên cạnh động viên, chia sẻ, khuyến khích, giúp đỡ để tôi có thể có kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Phạm Thị Hiền MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ......................................................................................2 1.1. Đại cương về curcuminoid ................................................................................2 1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa .........................................................................2 1.1.2. Nano curcumin ................................................................................................4 1.1.3. Tác dụng dược lý ................................................................................................5 1.1.4. Một số nghiên cứu định lượng curcuminoid .....................................................6 1.2. Một số phương pháp phân tích dùng trong nghiên cứu ........................................9 1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao..................................................................................9 1.2.2. Vài nét về kính hiển vi điện tử quét .................................................................13 CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................14 2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ................................................................14 2.2. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................15 2.3. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................15 2.3.1. Xây dựng quy trình định tính và định lượng curcuminoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................................................................15 2.3.2. Xác định kích thước hạt nano curcumin ..........................................................18 2.4. Phương pháp xử lý kết quả..................................................................................19 CHƢƠNG III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..........................20 3.1. Chuẩn bị mẫu .......................................................................................................20 3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ................................................................................20 3.1.2. Chuẩn bị dung dịch thử ....................................................................................20 3.1.3. Chuẩn bị mẫu trắng ..........................................................................................20 3.2. Xây dựng điều kiện phân tích curcuminoid bằng HPLC ...................................21 3.2.1. Khảo sát lựa chọn cột sắc ký ............................................................................21 3.2.2. Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện ...........................................................21 3.2.3. Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng và pha động ....................................................22 3.2.4. Khảo sát lựa chọn thể tích tiêm mẫu ................................................................24 3.3. Thẩm định phương pháp định tính và định lượng curcuminoid bằng HPLC ....25 3.3.1. Độ thích hợp của hệ thống ...............................................................................25 3.3.2. Tính đặc hiệu ....................................................................................................27 3.3.3. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ ....................................................................28 3.3.4. Độ chính xác .....................................................................................................30 3.3.5. Độ đúng ............................................................................................................32 3.4. Ứng dụng định tính, định lượng curcuminoid trong mẫu nano curcumin .........33 3.5. Xác định kích thước tiểu phân nano curcumin ...................................................34 3.6. Bàn luận ...............................................................................................................35 3.6.1. Phương pháp định tính và định lượng curcuminoid ........................................35 3.6.2. Xác định kích thước tiểu phân nano curcumin ................................................36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .....................................................................................37 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................39 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril MeOH Methanol A.acetic Acid acetic HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) STT Số thứ tự UV-VIS Tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet - Visible) V Thể tích TB Trung bình C Curcumin DMC Desmethoxycurcumin BDMC Bisdesmethoxycurcumin SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy) TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy) tt/tt Thể tích/thể tích HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human Immuno-deficiency Virus) DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Tính chất vật lý đặc trưng của các curcuminoid 3 2 Bảng 1.2. Một số chế phẩm chứa nano curcumin trên thị trường 6 3 Bảng 1.3. Một số nghiên cứu định lượng curcuminoid bằng HPLC sử dụng detector PDA và UV-VIS 8 4 Bảng 3.1. Cách pha các dung dịch chuẩn 20 5 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động 22 6 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký 25 7 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ tuyến tính 28 8 Bảng 3.5. Kết quả xác định độ chính xác 31 9 Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ đúng 32 10 Bảng 3.7. Kết quả định lượng curcuminoid trong mẫu nano curcumin 33 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1. Công thức cấu tạo của các curcuminoid 2 2 Hình 1.2. A (Curcumin), B (DMC), C (BDMC) 3 3 4 5 6 7 8 Hình 1.3. Kính hiển vi điện tử quét FESEM Hitachi S 4800 Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS của C, DMC, BDMC Hình 3.2. Sắc ký đồ của curcuminoid ở hệ pha động ACN : A.acetic 4% (40:60) Hình 3.3. Sắc ký đồ của curcuminoid ở hệ pha động ACN : A.acetic 4% (50:50) Hình 3.4. Sắc ký đồ của curcuminoid ở hệ pha động ACN : A.acetic 4% (60:40) Hình 3.5. Sắc ký đồ của curcuminoid chuẩn ở điều kiện sắc ký lựa chọn 13 21 23 23 23 24 9 Hình 3.6. Sắc ký đồ độ thích hợp của hệ thống 28 10 Hình 3.7. Sắc ký đồ của mẫu placebo 27 11 Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn nồng độ 0,06 mg/ml 27 12 Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn độ tuyến tính và khoảng nồng độ 28 13 Hình 3.10. Sắc ký đồ của 5 mẫu xây dựng đường chuẩn 29 14 Hình 3.11. Hình ảnh SEM của tiểu phân nano curcumin 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Nghệ vàng Curcuma longa L. thuộc họ gừng (Zingiberaceae) được trồng nhiều ở các vùng khí hậu nóng ẩm, trong đó có Việt Nam. Từ lâu, cây Nghệ đã được con người sử dụng làm gia vị, chất bảo quản, chất tạo màu trong chế biến thực phẩm và làm thuốc chữa bệnh. Trong những thập kỷ gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu sâu hơn và phát hiện thêm nhiều tác dụng quan trọng của cây Nghệ. Bên cạnh tác dụng kháng nấm, diệt khuẩn, diệt ký sinh trùng, chống viêm nhiễm, bảo vệ da, cây Nghệ còn được biết đến với tác dụng chống thiếu máu cục bộ, viêm khớp, chống oxi hóa và chống ung thư. Đồng thời các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng trong số các thành phần thì curcuminoid chính là nhóm chất chính quyết định những hoạt tính sinh học quan trọng đó. Mặc dù hoạt tính mạnh và đa dạng nhưng hiệu quả trên lâm sàng của curcuminoid lại bị hạn chế do sinh khả dụng thấp. Để nâng cao sinh khả dụng của curcuminoid nhiều phương pháp đã được thực hiện với các cách tiếp cận khác nhau, trong đó có việc sử dụng curcuminoid kích thước nano (hay còn gọi là nano curcumin). Có nhiều phương pháp bào chế nano curcumin trong đó có phương pháp Sol-gel đang được Viện Khoa học Vật liệu sử dụng bào chế tạo ra nguyên liệu nano curcumin dạng hỗn dịch trong nước với nồng độ từ 5 - 10%. Nhằm góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu định tính và định lƣợng curcuminoid toàn phần và xác định kích thƣớc của chế phẩm nano curcumin chế tạo bằng phƣơng pháp Sol-gel” với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng curcuminoidtoàn phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2. Xác định kích thước của chế phẩm nano curcumin chế tạo bằng phương pháp Sol-gel. 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về curcuminoid 1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa Nguồn gốc Curcuminoid là nhóm chất chính có trong thành phần hóa học của cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.), họ Gừng (Zingiberaceae). Đây là nhóm chất chính quyết định nhiều tác dụng quan trọng của cây Nghệ. Curcuminoid là dẫn chất của diaryheptan, gồm curcumin, desmethoxycurcumin (DMC) và bis-desmethoxycurcumin (BDMC). Trong đó curcumin là chất chính chiếm khoảng 77%, desmethoxycurcumin chiếm khoảng 17% và bis-desmethoxycurcumin chiếm khoảng 3%. Curcumin là một hợp chất polyphenol và chính là chất tạo nên màu vàng của cây Nghệ [25]. Công thức cấu tạo Hình 1.1. Công thức cấu tạo của các curcuminoid Công thức phân tử Curcumin: C21H20O6. Demethoxycurcumin: C20H18O5. Bisdemethoxycurcumin: C19H16O4. Khối lượng phân tử 3 Curcumin: 368,38 g/mol. Demethoxycurcumin: 338 g/mol. Bisdemethoxycurcumin: 308 g/mol. Tên khoa học Curcumin: (1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadien-3,5dion. Demethoxycurcumin: (1E,6E)-1-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-(4hydroxyphenyl)hepta-1,6-dien-3,5-dion. Bisdemethoxycurcumin: (1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)hepta-1,6-dien3,5-dion. Tính chất lý hóa Hình 1.2. A (Curcumin), B (DMC), C (BDMC) Bảng 1.1. Tính chất vật lý đặc trƣng của các curcuminoid Tính chất Hình dạng Tnc (oC) λmax UV-Vis trong ethanol (nm) Rf * Curcumin DMC BDMC Tinh thể hình kim Tinh thể hình kim Tinh thể hình kim Màu vàng tươi Màu đỏ cam Màu vàng cam 179,5 - 183,5 168,5 - 170,2 213,2 - 215,5 426 422 418 0,53 0,31 0,18 * Sắc ký lớp mỏng (Silica gel 60G, F254 ; CH2Cl2 :CH3OH = 98:2,tt/tt). Do tỷ lệ của ba loại curcuminoid trong hỗn hợp là khác nhau nên có sự khác biệt về giá trị bước sóng hấp thụ cực đại trung bình khi phân tích ba thành phần 4 curcuminoid. Pothitirat và Gritsanapan (2006) xác định curcuminoid ở bước sóng 420 nm.Trong khi đó, một số nghiên cứu lại lấy bước sóng cực đại là bước sóng nằm trong khoảng 424 đến 430 nm[7],[20]. 1.1.2. Nano curcumin 1.1.2.1. Đại cương Curcumin không tan trong nước, trong môi trường acid hoặc trung tính (độ tan 0,1 mg/ml) nhưng tan trong môi trường kiềm (độ tan 3 mg/ml). Curcumin thường hòa tan trong các dung môi hữu cơ như (aceton 20 mg/ml), ethanol, dimethylsulfoxid, dimethyl formamid và dầu. Curcumin không bền và dễ bị phân hủy nhanh trong trong môi trường trung tính hoặc kiềm để tạo thành feruloyl và acid ferulic, nó chỉ ổn định ở pH dưới 6. Các tính chất đó khiến cho việc sử dụng curcumin bị hạn chế, sinh khả dụng khi dùng đường uống thấp. Để nâng cao sinh khả dụng của curcumin nhiều phương pháp đã được thực hiện với các cách tiếp cận khác nhau, cụ thể là sử dụng: Tá dược như piperin để cản trở quá trình glucuronide hóa Curcumin liposomal Nano curcumin Phức hợp curcumin phospholipid Các chất tương tự cấu trúc của curcumin ví dụ EF-24. Trong đó hệ thống phân phối hạt kích thước nano (nanoparticulates) đường uống là một hướng được quan tâm nghiên cứu nhiều. Hệ thống phân phối hạt kích thước nano bao gồm polymeric, hạt nano lipid rắn (Solid lipid nanoparticles), liposom, niosomes, micelles, siêu vi nhũ tương (microemulsions),và hạt thuốc kích thước nano. Quá trình nano hóa (Nanonization) đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao tính thương mại cho nhiều sản phẩm. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh quá trình nano hóa giúp cải thiện đáng kể sinh khả dụng của thuốc trong đó có curcuminoid[18]. 1.1.2.2. Nano curcumin chế tạo bằng phương pháp Sol-gel 5 Nano curcumin có thể được chế tạo bằng nhiều phương pháp như sử dụng các polysaccharidcấu trúc nano làm màng bao, sử dụng lực cơ học để làm nhỏ tới kích thước nano... Các nhà nghiên cứu ở Viện Khoa học Vật liệu đã lựa chọn phương pháp Sol-gel để chế tạo nano curcumin. Phương pháp hóa học Sol-gel là một kỹ thuật để tạo ra một số sản phẩm cóhình dạng mong muốn ở cấp độ nano. Nhờ khả năng trộn lẫn các chất ở quy mô nguyên tử, phương pháp Sol-gel có thể tạo ra các sản phẩm có độ đồng nhất cao, độ tinh khiết hóa học cao và một khả năng quan trọng là có thể khống chế được kích thước, hình dạng của hạt. Ngoài ra, đây cũng là một phương pháp đơn giản, phù hợp với điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam, có thể điều khiển được các giai đoạn trong quá trình để tạo ra các sản phẩm như mong muốn. Phương pháp Sol-gel là một quá trình hóa học, tổng hợp các phần tử huyền phù dạng keo rắn trong chất lỏng và sau đó tạo thành nguyên liệu lưỡng pha của bộkhung chất rắn, được chứa đầy dung môi cho đến khi xảy ra quá trình chuyển tiếpSol-gel. Một cách tổng quát, quá trình Sol-gel là liên quan đến hóa lý của sự chuyển đổi của một hệ thống từ precursor thành pha loãng dạng Sol sau đó tạo thành pha rắn dạng Gel theo mô hình precursor Sol Gel. Trong quá trình Sol-gel, các phần tử trung tâm trải qua 2 phản ứng hóa học cơbản: phản ứng thủy phân và phản ứng ngưng tụ (dưới xúc tác axit hoặc bazơ) đểhình thành một mạng lưới trong toàn dung dịch [11], [5]. 1.1.3. Tác dụng dược lý Từ khoảng năm 1900 trước Công nguyên, Ấn Độ đã sử dụng củ Nghệ trong y học để chữa trị nhiều bệnh tật. Nhưng phải đến cuối thế kỷ 20, các nhà khoa học mới nghiên cứu và xác định được curcuminoid là nhóm chất chính đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính sinh học của củ Nghệ đặc biệt là curcumin [10]. Nhiều thử nghiệm lâm sàng ở người đãđược thực hiện để nghiên cứu tác dụng của curcumin trong điều trị các bệnh như: viêm tủy, ung thư tụy, ung thư ruột kết, bệnh Alzheimer [20], bệnh vẩy nến, hội chứng loạn sản tủy. Các nghiên cứu cũng cho 6 thấy curcumin có tính chất chống ung thư [9], [12], chống viêm khớp, chống oxi hóa, chống thiếu máu cục bộ [21] và kháng viêm [23]. Nhờ khả năng vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn hình thành các tế bào ung thư mới mà không gây hại cho các tế bào lành tính bên cạnh, curcumin giúp phòng ngừa và chống ung thư. Năm 2009, một nghiên cứu về tác dụng của curcumin đối với tế bào ung thư đã cho thấy curcumin có thể điều chỉnh quá trình phân chia thường xuyên của tế bào, từ đó tác động tới sự phát triển của các tế bào u, bướu, đồng thời không cho thấy bất kỳ dấu hiệu độc tính nào và ổn định sau khi ủ với protein huyết thanh của con người. Các nghiên cứu cũng đã chứng minh curcumin có khả năng kìm hãm sự phát tác của tế bào ung thư da, dạ dày, ruột, vòm họng, dạ con và bàng quang [9]. Nghiên cứu tại Ấn Độ cho thấy, vùng dân ăn nhiều cary có tỷ lệ người mắc bệnh Alzheimer rất thấp. Điều đó gợi mở cho khả năng chống bệnh Alzheimer của curcumin. Theo các nhà khoa học, curcumin còn có tác dụng tốt cho não, các notron, giảm stress, trầm cảm và trạng thái lo âu [10]. Không chỉ vậy, curcumin còn đang được hi vọng có khả năng điều trị viêm gan B, C và nhiễm HIV. Từ năm 1993, các nhà khoa học thuộc ĐH Harvard (Hoa Kỳ) đã công bố curcumin là một trong ba chất có tác dụng kìm hãm tế bào HIV-1, HIV-1-RT [23]. 1.1.4. Một số nghiên cứu định lượng curcuminoid Trên thế giới, nhiều phương pháp đã được xây dựng để định tính và định lượng curcuminoid được tổng hợp ở bảng 1.3sau: 7 Bảng 1.3. Một số nghiên cứu định lƣợng curcuminoid bằng HPLC sử dụng detector PDA và UV-VIS Mẫu Pha động Điều kiện TLTK - A là dung dịch đệm amonium acetate pH 4,5 và - Bước sóng: 420 nm. Hạt curcumin B là ACN. - Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 có kích thước - Điều kiện gradient: µm) Ban đầu 95% A, tiến tới - Tốc độ dòng: 1 ml/phút nano [18] 55%A ở 20 phút, cuối cùng - Nhiệt độ cột 45 ± 2oC là 5%A ở 33 phút Curcumin và A là nước (dung dịch celecoxib ở A.acetic 1%) điều chỉnh pH kích thước đến 3 sử dụng nano trietheanolamin 50%, B là ACN (45:55, tt/tt) Hạt nano curcuminoid đươ ̣c bao gói trong poly(butyl) cyanoacrylat Dung dịch acid trifuroacetic (TFA) 0,1% (tt/tt) : ACN (1:1, tt/tt) (Điề u chin̉ h đế n pH 3.0 với amoniac) Dung dịch acid citric trong Bột thân rễ nước (1g trong 1000 ml nước): tetrahydrofuran (6:4, tt/tt). Bột thân rễ ACN : Dung dịch A.acetic 4% (45:55, tt/tt) -aBước sóng: 254 nm. - Cột Agilent RP C18 XDB (150 x 4.6 mm, 5µm) [13] - Tốc độ dòng 1,50 ml/phút - Bước sóng: 420nm. - Cô ̣t C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) [16] - Tố c đô ̣ dòng: 1,5 ml/phút - Bước sóng: 420 nm. - Cột C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) [24] - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm 20 µl. - Bước sóng: 430 nm - Cột C18 (250x 4,6 mm, 5 µm) [18] 8 Bột thân rễ của Dung dịch A.acetic : cây Nghệ Dịch chiết của Nghệ Bột Nghệ MeOH (15:85, tt/tt) ACN : Dung dịch A.acetic 2% trong nước (4:6, tt/tt) ACN : Dung dịch A.acetic 2% trong nước (1:1, tt/tt) Hỗn hợp MeOH - H2O Một số loài Curcuma (chứa dung dịch acid trifluoroacetic 0.1%) – ACN (39.5:350:468, tt/tt/tt) -aBước sóng: 420 nm. - Cột Kromasil C18 (250 x [20] 4,6 mm, 5 µm) -aBước sóng: 425 nm. - Cột C18 (150 x 4,6 mm, 5 [20] µm -aBước sóng: 260 nm. - Cột Welchroll-C18 (250 x [20] 4,6 mm, 5 µm) -aBước sóng: 425 nm. - Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 [20] µm) Dung dịch A.acetic 2% trong nước (A) và Dung dịch CH3COOH 2% trong ACN (B) Curcuminoid • Gradient khai triển: trong mẫu thực Thời gian phẩm ở Hàn Quốc Tỷ lệ 0-3 phút 10% B 8 phút 20% B 13 phút 25% B 18 phút 35% B -aBước sóng: 420 nm. - Cột X Terra MS C18 (250 [20] x 4,6 m, 5 µm) Giữ 10 phút trước khi quay lại điều kiện ban đầu Curcumin và silibinin trong cấ u trúc nano -Bước sóng: 292 nm. Acid ortho phosphoric -aCột C18 (pha đảo, 0,1% : ACN = 50:50,tt/tt 150x4,6 mm, 5µm). - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút [15] 9 Dịch chiết của Nghệ Bột Nghệ ACN : Dung dịch A.acetic 2% trong nước (4:6, tt/tt) ACN : Dung dịch A.acetic 2% trong nước (1:1, tt/tt) -aBước sóng: 425 nm. - Cột Alltect Alltima C18 [20] (150 x 4,6 mm, 5 µm) -aBước sóng: 260 nm. - Cột Welchroll-C18 (250 x [20] 4,6 mm, 5 µm) 1.2. Một số phƣơng pháp phân tích dùng trong nghiên cứu 1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao 1.2.1.1. Nguyên tắc phương pháp HPLC HPLC là quá trình tách trong đó các chất tan được vận chuyển và phân bố giữa pha động và pha tĩnh. Mẫu phân tích ở dạng dung dịch sau khi chuyển lên cột tách, sẽ được hấp phụhay liên kết với pha tĩnh. Pha động dịch chuyển qua cột sắc ký với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất trong mẫu phân tích ra khỏi cột. Tùy thuộc vào bản chất của pha động, bản chất của pha tĩnh và bản chất của các chất trong mẫu phân tích mà quá trình rửa giải sẽ tách các chất trong mẫu phân tích ra khỏi nhau. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và chuyển tín hiệu tới bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng thu được sẽ được hiển thị trên máy tính hoặc đưa ra máy in. Nếu mẫu phân tích là hỗn hợp nhiều thành phần thì sau quá trình tách sắc ký ta sẽ thu được một sắc ký đồ gồm nhiều pic [2], [4], [8]. 1.2.1.2. Một số thông số đặc trưng của quá trình sắc ký Thời gian lƣu tR (Retention time) Thời gian lưu là khoảng thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu, qua cột sắc ký tới detector và cho pic trên sắc ký đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic). Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định. Tùy vào điều kiện phân tích cụ thể, các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau. Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để định tính các chất. Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố: 10 Bản chất, thành phần, tốc độ pha động. Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp của pha tĩnh. Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế. Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH pha động, nồng độ chất tạophức, nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc ký. Trong một phép phân tích nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn tR quá lớn (tR> 20 phút) thì pic bị doãn, độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài[2], [4], [8]. Hệ số dung lƣợng k’(Thừa số khối lƣợng) Hệ số dung lượng k’ là tỷ số lượng chất tan trong pha tĩnh và trong pha động. Chọn cột, pha động… sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1≤ k’ ≤8 k’ = 𝑄𝑠 𝑄𝑚 Bằng thực nghiệm k’ có thể tính theo công thức k’= (tR-to)/to Trong đó: QS: Lượng chất trong pha tĩnh Qm: Lượng chất trong pha động to: Thời gian chết tR : Thời gian lưu Hệ số đối xứng của pic F F= 𝑊 2×𝑎 Trong đó: W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic. Theo lý thuyết yêu cầu F phải nằm trong khoảng 0,9 - 1,1. Tuy nhiên tùy theo phép phân tích có yêu cầu khác nhau với F, thông thường yêu cầu F nằm trong khoảng 0,7 - 2,0. Số đĩa lý thuyết N 11 N = 16 × 𝑡𝑅 2 𝑊 = 5,54 × 𝑡𝑅 2 𝑊1/2 Trong đó: W: Chiều rộng đo đáy pic W1/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic Số đĩa lý thuyết để đánh giá hiệu lực cột sắc ký. Tùy phép phân tích mà yêu cầu N khác nhau, thông thường N > 3000/cột. Độ phân giải RS RS = 2 ×(𝑡 𝑅𝐵 −𝑡 𝑅𝐴 ) 𝑊𝐵 + 𝑊𝐴 = 1,18 ×(𝑡 𝑅𝐵 −𝑡 𝑅𝐴 ) 𝑊1/2𝐵 + 𝑊1/2𝐴 Với: tRB, tRA: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A). WB, WA: Độ rộng pic ở các đáy pic. W1/2B, W1/2A: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic. Các giá trị tRB, tRA, WB, WA, W1/2B, W1/2A tính theo cùng một đơn vị. Yêu cầu: RS>1, phép định lượng yêu cầu RS ≥ 2. 1.2.1.3. Ứng dụng định lượng của HPLC Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độcủa chất phân tích tỷ lệ với diện tích pic hay chiều cao pic của nó. Có 4 phương pháp định lượng sử dụng trong sắc ký: Phương pháp chuẩn ngoại Phương pháp thêm chuẩn Phương pháp chuẩn nội Phương pháp chuẩn hóa diện tích Trong khuôn khổ của khóa luận, tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại - chuẩn hóa một điểm và chuẩn hóa nhiều điểm. Chuẩn hóa một điểm: chọn nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ chất phân tích trong mẫu thử. Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức: Cx=Cs× Ở đây: 𝑆𝑥 𝑆𝑠 12 Cx: Nồng độ mẫu thử Sx: Diện tích của pic mẫu thử Cs: Nồng độ chất chuẩn Ss: Diện tích của pic mẫu chuẩn Chuẩn hóa nhiều điểm: chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn (C). Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể tính toán theo 2 cách: Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra nồng độ của nó Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính, mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) của pic với nồng độ của chất cần xác định. Y=a+ b × 𝐶𝑥 Trong đó: Y: Diện tích pic b: Độ dốc của đường chuẩn a: Giao điểm của đường chuẩn Cx: Nồng độ phân tích trong dung dịch mẫu thử Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử: 𝐶𝑥 = 𝑌−𝑎 𝑏 Tải về bản full