Nghiên Cứu Khoa Học Xác định Thành Phần Và Cơ Cấu Ký Sinh Trùng ...

Xác định thành phần và cơ cấu ký sinh trùng sốt rét ở trẻ em tại một vùng sốt rét lưu hành của tỉnh Bình Phước bằng kỹ thuật PCR, tiến hành song song với kỹ thuật nhuộm Giemsa.

TÓM TẮTXác định thành phần và cơ cấu ký sinh trùng sốt rét ở trẻ em tại một vùng sốt rét lưu hành của tỉnh Bình Phước bằng kỹ thuật PCR, tiến hành song song với kỹ thuật nhuộm Giemsa. Kết quả cho thấy trong số 384 mẫu máu thu thập được, kỹ thuật PCR đã phát hiện được 51 ca dương tính với ký sinh trùng sốt rét (13,3%). Trong đó có 28 ca P. falciparum (54,9%), 13 ca P. vivax (25,5%), 9 ca phối hợp P. falciparum + P. vivax (17,6%) và 1 ca phối hợp 3 loài P. falciparum + P.vivax + P. malariae(1,9%). Kỹ thuật soi lam nhuộm Giemsa chỉ phát hiện được 44 ca nhiễm ký sinh trùng sốt rét (11,4%), với P. falciparumlà 26 (59,1%), P. vivax là 13 (29,6%) và 5 ca phối hợp P. Falciparum + P. vivax (11,3%). Kỹ thuật PCR phát hiện được nhiều ca sốt rét hơn và nhiều ca nhiễm phối hợp hơn kỹ thuật soi lam máu nhuộm Giemsa.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Sốt rét là một căn bệnh phổ biến và nguy hiểm. Hằng năm trên thế giới có hơn 1 triệu người chết do sốt rét, đa số là trẻ em tại các nước đang phát triển.

Việt Nam nói chung và khu vực Nam bộ - Lâm Đồng nói riêng có điều kiện thuận lợi về địa lý và khí hậu cho sự phát triển của muỗi Anopheles, trung gian truyền bệnh. Bên cạnh đó, trình độ dân trí một số nơi chưa cao; tổ chức y tế cơ sở thiếu, yếu, cộng với hiện tượng di dân tự do nên tình hình sốt rét trong những năm gần đây có những diễn biến phức tạp.

Việc xác định đúng loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh là yêu cầu quan trọng trong nghiên cứu và điều trị. Bên cạnh phương pháp nhuộm Giemsa được xem như là ‘tiêu chuẩn vàng’ trong chẩn đoán, xác định ký sinh trùng sốt rét, việc phát triển các kỹ thuật trong phòng thí nghiệm khác đặc biệt là kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) giúp cung cấp các số liệu dịch tễ về cơ cấu ký sinh trùng sốt rét chính xác và đầy đủ hơn.

Sốt rét ở trẻ em chuyển thành nặng hoặc ác tính rất nhanh (chỉ sau 1 đến 2 ngày). Do đó, đây là đối tượng có nguy cơ tử vong do sốt rét cao. Đồng thời, đây là những đối tượng rất ít khi di chuyển khỏi nơi cư trú; nếu có ký sinh trùng thì đây là nguồn lây nhiễm nội địa vì thế phản ánh đúng thành phần, cơ cấu ký sinh trùng sốt rét của địa phương.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật Nested-PCR để xác định thành phần và cơ cấu ký sinh trùng sốt rét gây bệnh ở trẻ em tại một vùng sốt rét lưu hành của tỉnh Bình Phước.

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian

Nghiên cứu được thực hiện trong 12 tháng (từ tháng 10/2006 đến tháng 10/2007). Trong đó có 4 đợt thu thập mẫu tại thực địa vào tháng 10 và tháng 11/2006, tháng 02 và tháng 05/2007.

2.2. Địa điểm

Xã Đak Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước với các đặc điểm địa lý và khí hậu đặc biệt phù hợp cho sự phát triển của vectơ truyền bệnh; rừng, rẫy xen lẫn với khu dân cư; nơi tập trung đồng bào dân tộc ít người sinh sống; là một xã trọng điểm về bệnh sốt rét được chọn làm nơi tiến hành thu thập mẫu nghiên cứu.

2.3. Đối tượng

Trẻ em dưới 15 tuổi, đang sốt hay có sốt trước đó, không phân biệt giới tính, cư trú tại xã Đak Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước. Đây là những đối tượng không thường xuyên di chuyển ra khỏi nơi cư trú, nếu có ký sinh trùng thì có nhiều khả năng là mắc tại chỗ, do đó phản ánh đúng thành phần, cơ cấu ký sinh trùng sốt rét của địa phương.

2.4. Phương pháp thu thập mẫu

Phát hiện thụ động tại trạm y tế của xã Đak Nhau và chủ động tại 8 cụm dân cư của xã là Đăng Lang, Đak Nung, Đăng La, Bù Ghe, Đak Liêng, Đak Uý, Đak Ma, Đak Xuyên.

Lấy lam máu giọt dày và phết mỏng, đồng thời lưu giữ mẫu máu trên giấy thấm Whatman 3MM. Để khô mẫu giấy thấm ở môi trường thực địa và cho vào các túi nhựa riêng biệt có ghi số thứ tự và ngày thu thập.

2.5. Kỹ thuật sử dụng để xác định loài ký sinh trùng sốt rét

2.5.1. Kỹ thuật nhuộm Giemsa và soi dưới kính hiển vi:

Thực hiện theo qui trình nhuộm soi giọt dày, phết mỏng của Viện Sốt rét KST-CT TP. HCM phát hiện ký sinh trùng sốt rét tại chỗ để điều trị kịp thời nếu trẻ có bệnh sốt rét. Các lam máu sẽ được kiểm tra sau đó tại Khoa Ký sinh trùng của Viện.

2.5.2/ Kỹ thuật Nested-PCR:

Sản phẩm của phản ứng PCR lần 1 sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2, điều này làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng lên gấp nhiều lần. Do đó, kỹ thuật này có thể phát hiện ký sinh trùng sốt rét ở mật độ thấp (5-10 KST/μl máu) hay trong những trường hợp nhiễm đồng thời nhiều loài ký sinh sốt rét.

Các mẫu máu trên giấy thấm được tách chiết DNA và sử dụng kỹ thuật Nested-PCR để xác định loài ký sinh trùng sốt rét với gen đích là 18ssr-RNA, trình tự các cặp mồi đặc hiệu của 4 loài ký sinh trùng do tiến sĩ G.Snounou và cs. thiết kế (1993).

Trước tiên, thực hiện phản ứng PCR để nhân bản gen đặc hiệu của Plasmodium với các trình tự mồi :

Plu5: 5’-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TTC -3’Plu6: 5’-TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG-3’

Sau đó, thực hiện phản ứng PCR nhân bản gen đặc hiệu cho từng loài P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale với các trình tự mồi:

FAL1: 5’-TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3’FAL2: 5’-ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3’VIV1: 5’-CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC-3’VIV2: 5’-ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA-3’MAL1: 5’-ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC-3’MAL2: 5’-AAA ATT CCC ATG CAT AAA AAA TTA TAC AAA-3’OVA1: 5’-ATC TCT TTT GCT ATT TTT TAG TAT TGG AGA-3’OVA2: 5’-GGA AAA GGA CAC ATT AAT TGT ATC CTA GTG-3’

Sản phẩm PCR chạy điện di trên gel agarose 2% có chứa ethidium bromide, sau đó phân tích kết quả bằng máy đọc BioRad.

3. KẾT QUẢ

Tổng số mẫu thu thập được tại xã Đak Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước là 384 mẫu.

3.1. Kết quả xác định loài và tỷ lệ ký sinh trùng sốt rét của kỹ thuật soi lam nhuộm Giemsa:

Kỹ thuật nhuộm Giemsa phát hiện được 44 ca nhiễm ký sinh trùng sốt rét trong tổng số 384 mẫu chiếm tỷ lệ 11,4% trong đó P. falciparum có 26 ca (59,1%), P. Vivax 13 ca (29,6%) và 5 ca nhiễm phối hợp P. falciparum + P. vivax (11,3%).

Các kết quả trên cho thấy, kỹ thuật Giemsa phát hiện được 2 loài ký sinh trùng sốt rét P. falciparum và P. vivax, không có ca nhiễm P. malariae và P.ovale. Các ca bệnh nhiễm đơn thuần một loài ký sinh trùng sốt rét chiếm tỷ lệ vượt trội so với các ca nhiễm phối hợp.

3.2. Kết quả xác định loài và tỷ lệ KST sốt rét của kỹ thuật Nested – PCR:

Kỹ thuật PCR phát hiện 51 ca dương tính, chiếm tỷ lệ 13,3%. Trong đó có 28 ca nhiễm P. falciparum (54,9%), 13 ca P. vivax (25,5%), 9 ca phối hợp P. falciparum + P. vivax (17,6%) và 1 ca phối hợp 3 loài P. falciparum +P. vivax P. malariae (1,9%).

4. BÀN LUẬN

Qua nghiên cứu trên, chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt về kết quả giữa kỹ thuật nhuộm Giemsa và PCR. PCR phát hiện 51 ca dương tính (13,3%), trong khi Giemsa chỉ có 44 (11,4%) trong tổng số 384 mẫu máu thu thập. Bảy ca mà Giemsa không phát hiện được có thể là do nhiễm ký sinh trùng với mật độ quá thấp, dưới ngưỡng phát hiện của kính hiển vi.

Bên cạnh đó, kỹ thuật nhuộm Giemsa soi dưới kính hiển vi khó xác định đầy đủ thành phần loài ở những ca nhiễm phối hợp khi trong đó có sự vượt trội về tỷ lệ của loài này so với loài khác. Trường hợp hình thể ký sinh trùng sốt rét không điển hình cũng gây khó khăn trong việc phát hiện bằng kỹ thuật Giemsa. So với kỹ thuật nhuộm Giemsa thì kỹ thuật PCR phát hiện tỷ lệ nhiệm phối hợp cao hơn nhiều.

Trong nghiên cứu này, kỹ thuật PCR phát hiện 10 ca nhiễm phối hợp trong đó có 1 trường hợp nhiễm phối hợp 3 loài ký sinh trùng, Giemsa chỉ phát hiện được 5 ca và không phát hiện được sự hiện diện của P. malariae. Điều này cho thấy số liệu của những điều tra thực hiện bằng kỹ thuật nhuộm Giemsa có thể thấp hơn tỷ lệ thực tế.

Kết quả phân tích bằng kỹ thuật PCR chứng minh có sự tồn tại của 3 loài ký sinh trùng sốt rét P. falciparum, P. vivax và P. malariae tại xã Đak Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước. Kỹ thuật Giemsa và PCR đều cho thấy tỷ lệ vượt trội của loài P. falciparum kế đến là P. vivax. Nghiên cứu này không phát hiện thấy có sự hiện diện của P. ovale.

Trẻ em sống ở những vùng có sốt rét lưu hành như xã Đak Nhau thì đã phát triển miễn dịch đối với sốt rét. Một số trẻ không có biểu hiện sốt dù có tồn tại ký sinh trùng sốt rét trong cơ thể. Do đó, trên thực tế tỷ lệ bệnh có thể cao hơn kết quả nghiên cứu.

Việc sử dụng kỹ thuật PCR với độ nhạy, độ đặc hiệu cao giúp phát hiện nhiều ca nhiễm ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt hiệu quả trong trường hợp nhiễm phối hợp nhiều loài. Đồng thời, giúp chẩn đoán chính xác, không bỏ sót ca bệnh và điều trị hiệu quả.

Tuy trên thực tế rất khó áp dụng kỹ thuật PCR tại thực địa do những yêu cầu về điều kiện trang thiết bị, hóa chất, labô… và không cho kết quả nhanh bằng Giemsa. Nhưng kỹ thuật PCR có ưu thế hơn nhuộm Giemsa trong chẩn đoán phát hiện các ca sốt rét do không bỏ sót ca dương tính, phát hiện nhiễm phối hợp nhiều hơn, giúp điều trị sốt rét hiệu quả và cung cấp số liệu chính xác hơn về thành phần, tỷ lệ loài ký sinh trùng sốt rét tại vùng sốt rét lưu hành. Chính vì các ưu điểm vượt trội này mà kỹ thuật PCR được xem như là công cụ hỗ trợ tích cực trong công tác phòng chống sốt rét.

5. KẾT LUẬN

Kỹ thuật PCR đã xác định được có sự hiện diện của 3 loài ký sinh trùng sốt rét trên đối tượng nghiên cứu là trẻ em dưới 15 tuổi tại xã Đak Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước.P. falciparum chiếm tỷ lệ cao nhất 61,3%, kế đến là P. vivax 37,1% và P. malariae 1,6%.

Kỹ thuật PCR phát hiện được nhiều ca nhiễm phối hợp nhiều hơn kỹ thuật nhuộm Giemsa (10 ca so với 5 ca).