Xemtailieu Tải về Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn acetobacter xylinum có khả năng tạo màng bc
LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo trong tổ phương pháp giảng dạy, các thầy cô trong khoa Sinh - KTNN, các thầy cô giáo trong trường ĐHSP Hà Nội 2 và các bạn sinh viên. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới cô Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận. Do lần đầu tiên làm quen với công tác nghiên cứu khoa học. Hơn nữa do thời gian và năng lực của bản thân còn hạn chế, mặc dù đã rất cố gắng nhưng chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót. Em kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy, cô giáo và các bạn sinh viên để khóa luận của em được hoàn thiện và có nhiều ứng dụng trong thực tế. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Sinh viên Phạm Thị Ngọc Mai 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có tài liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bố. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Sinh viên Phạm Thị Ngọc Mai 2 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 3 2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................ 3 3. Nội dung của đề tài ....................................................................................... 3 4. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 3 5. Điểm mới ....................................................................................................... 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. ............................................................ 4 1.1. Lược sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum................................... 4 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum............................................. 6 1.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon.................................................................... 9 1.4. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC ................................................ 10 1.4.1. Đặc điểm cấu trúc của màng BC........................................................... 10 1.4.2. Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose ...................................................... 11 1.5. Các đặc điểm của quá trình lên men ........................................................ 12 1.5.1. Ảnh hưởng của oxy ............................................................................... 12 1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................................ 12 1.5.3. Ảnh hưởng của các hợp chất chứa cacbon, nitơ, photpho .................... 13 1.5.4. Ảnh hưởng của nồng acid acetic và rượu etylic.................................... 13 1.6. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới và ở Việt Nam 13 1.6.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới...................... 13 1.6.2. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam ...................... 14 1.7. Tình hình nghiên cứu ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng................ 15 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu và thiết bị hóa chất ............................................... 16 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 16 3 2.1.2. Hóa chất................................................................................................. 16 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 16 2.1.4. Môi trường nghiên cứu ........................................................................ 17 2.1.4.1. Môi trường giữ giống (môi trường cơ bản) ...................................... 17 2.1.4.2. Môi trường nhân giống ...................................................................... 17 2.1.4.3. Môi trường lên men............................................................................ 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 18 2.2.1. Phương pháp vi sinh .............................................................................. 18 2.2.1.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc ............................................................. 18 2.2.1.2. Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum bằng phương pháp nhuộm Gram................................................................. 18 2.2.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng ................... 19 2.2.1.4. Phương pháp hoạt hoá giống.............................................................. 19 2.2.1.5. Phương pháp lên men tạo màng ......................................................... 19 2.2.1.6. Phương pháp phát hiện khả năng tổng hợp cellulose ........................ 19 2.2.2. Phương pháp toán học ........................................................................... 20 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 21 3.1. Khảo sát sự tạo màng của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 .. 21 3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 ...................................................................... 22 3.2.1. Xác định hàm lượng acid acetic tạo thành của các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 .................................................... 22 3.2.2. Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum trên kính hiển vi quang học ................................................................................... 23 3.2.2.1. Hình thái và tế bào học chủng vi khuẩn A.xylinum ........................... 23 3.2.2.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa ............................................... 24 3.2.2.3. Hoạt tính catalase ............................................................................... 25 4 3.2.2.4. Khả năng sinh acid acetic của vi khuẩn A.xylinum trên môi trường Blue bromphenol ................................................................................ 25 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 26 3.3.1. Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 ..................................................... 26 3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tạo màng của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 ................ 29 3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ tới khả năng tạo màng của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 ................. 32 3.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pepton tới khả năng tạo màng của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 ........................... 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 36 1. Kết luận ....................................................................................................... 36 2. Đề nghị ........................................................................................................ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 37 5 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A.xylinum : Acetobacter xylinum BC : Bacterial cellulose MT : Môi trường Cs : Cộng sự CS : Cellulose synthase PGM : Phosphoglucomutase PC : Plant cellulose GK : Glucokinase FK : Fructokinase 6 DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH 1. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum theo Frateur (1950) Bảng 2.1. Thành phần các môi trường lên men Bảng 3.1. Khả năng tạo màng BC trên các loại môi trường khác nhau của chủng vi khuẩn A.xylinum Bảng 3.2. Khảo sát khả năng tạo thành acid acetic của các chủng vi khuẩn A.xylinum Bảng 3.3. Xác định số lượng tế bào của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 Bảng 3.4. Sự biến thiên hàm lượng acid acetic của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum qua thời gian nuôi cấy khác nhau Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới độ dày màng BC Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khối lượng tươi của màng BC Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khối lượng khô của màng BC Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nitơ tới độ dày của màng BC Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nitơ tới khối lượng của màng BC Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn pepton ở nồng độ khác nhau đến khối lượng màng BC ở chủng CH14 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nguồn pepton ở nồng độ khác nhau đến khối lượng màng BC ở chủng BHN2 7 2. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sợi cellulose của màng BC Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật Hình 1.3. Sự hình thành những dải ribbon trong màng BC của A.xylinum Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum Hình 3.1. Chủng giống vi khuẩn A.xylinum Hình 3.2. Tế bào vi khuẩn A.xylinum Hình 3.3. Khuẩn lạc A.xylinum trên môi trường thạch đĩa Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng A.xylinum Hình 3.5. Chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic của vi khuẩn A.xylinum Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn quá trình sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự tạo thành acid acetic trong dung dịch lên men của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 8 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Ngày nay công nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật chủ đạo của nhiều quốc gia trên thế giới. Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh với những thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công nghiệp, y học... Khó có thể tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học mà lại không liên quan tới vi sinh vật. Vi khuẩn Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Vi khuẩn A.xylinum tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả. Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose sinh học thuần khiết và được g ọi là màng sinh học Bacterial cellulose (BC), đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose [26], [28]. Cho đến nay , Acetobacter xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn có khả năng sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên . Loài vi khuẩn Gram âm này sống hiếu khí bắt buộc , không sinh bào tử và là loài tiến bộ nhất trong vi khuẩn tí a. Mỗi tế bào Acetobacter xylinum có thể chuyển hóa tới 108 phân tử glucose vào phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả năng tổ ng hợp cellulose là rất lớn [6]. Nét cấu trúc quan trọng trong cơ chế kết tinh khác hẳn với cellulose (PC) ở thực vật ở chỗ chú ng không có sự kết hợp hemic ellulose, ligmin hay những thành phần phụ khác , mà được cấu tạo từ các sợi mic rofibril tạo nên những bó sợi song song cấu thành mạng lưới cellulose với độ bền cơ học cao , độ tinh khiết cao, khả năng thấm hút nước lớn , đường kí nh sợi nhỏ , khả năng polime hóa và trạng thái kết tinh lớn . Ngoài ra , màng B C còn chứa nhiều dưỡng chất , acid hữu cơ đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật 9 khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của tia UV…[18], [24]. Nhờ những đặc tí nh độ c đáo trên mà màng BC được coi là nguồn polimer mới, là một giải pháp trên con đường tìm nguồn nguyên liệu mới hiện nay. Nó đã và đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau của thế kỷ XIX và hiện đ ược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong công nghiệp sản xuất giấy màng BC được dùng để sản xuất giấy điện tử chất lượng cao; trong công nghệ môi trường đã sử dụng màng BC làm màng phân tách để sử lý nước và biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989; Jonas và Fonah, 1998). Ngoài ra, màng BC còn được dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng (Brown, 1989), làm các sợi truyền quang, là môi trường cơ chất trong sin h học sử dụng cố đị nh protein thay cho sắc ký . Trong công nghiệp thực phẩm sử dụng vi khuẩn A.xylinum nuôi trên môi trường nước dừa tạo màng BC để sản xuất th ạch dừa. Trong lĩ nh vực mỹ phẩm và dược phẩm , lợi dụng những đặc tính quý báu của màng BC như thông thoáng , kháng khuẩn , tính tương đồng về cấu trúc với sợi collagen trong da nên màng BC được coi là nguồn nguyên liệu quý giá dùng làm mặt lạ dưỡng da, da nhân tạo, dùng trong điều trị bỏng và tổn thương da [9], [25]. Ở Việt Nam hiện nay, do nhu cầu màng trị bỏng lớn, nhưng hầu hết đều phải nhập ngoại với giá thành cao. Trong khi đó màng BC có thể tự sản xuất trong nước từ những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền. Nên nếu chế tạo thành công màng BC từ vi khuẩn A.xylinum sẽ có ý nghĩa rất cao trong tình hình điều trị bỏng ở nước ta hiện nay [27]. Do sự đa dạng về các mặt ứng dụng như trên và với mong muốn được tìm hiểu thêm về vi khuẩn A.xylinum, quá trình tạo màng BC cũng như nhiều ứng dụng hữu ích của nó, tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng BC”. 10 2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn A.xylinum có khả năng tạo màng BC. 3. Nội dung của đề tài 3.1. Khảo sát sự tạo màng của 2 chủng vi khuẩn vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 4. Ý nghĩa của đề tài 4.1. Lý luận Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 để tạo màng BC có chất lượng tốt trong thời gian ngắn. 4.2. Thực tiễn Nghiên cứu góp phần tạo ra màng BC có chất lượng tốt với chi phí thấp để ứng dụng tạo màng trị bỏng. 5. Điểm mới Nồng độ pepton thích hợp cho khả năng tạo màng BC ở 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 là 0,4‰. 11 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lƣợc sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter Từ lâu người ta đã biết acid acetic ở dạng giấm nhưng cho đến những năm đầu thế kỷ XIX người ta mới điều chế được acid acetic và biết được rằng giấm là sản phẩm lên men của 1 chủng vi khuẩn có tên là Acetobacter hay vi khuẩn acetic. Người đầu tiên nghiên cứu những màng mỏng của giấm là nhà bác học Person vào năm 1822. Ông đã chứng minh được đó là một loại vi sinh vật có tên là Mycoderma aceti. Năm 1837, Kiitsing đã khẳng định rõ vai trò của vi sinh vật trong quá trình lên men giấm. Cũng năm này Hansen đã tách được từ màng giấm loại vi khuẩn thuần khiết đó là Mycoderma aceti [22]. Năm 1862-1868, Frateur đã chứng minh được sự đúng đắn trong nhận xét của ông Kiitsing “Để thực hiện quá trình lên men nhất thiết phải có vi sinh vật”. Ông đã khẳng định bản chất của vi sinh vật trong quá trình lên men acetic là một tác nhân quan trọng. Trong quá trình này do phát hiện ra kính hiển vi điện tử nghiên cứu màng xuất hiện trên bia và rượu vang. Ông kết luận rằng màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn ông cũng gọi đó là Mycoderma aceti [23]. Những nghiên cứu tiếp theo đều nhằm mục đích cái tiến quá trình lên men acetic và tiến hành phân loại chúng. Beijerinck, 1899 ông đã phân loại vi khuẩn dựa vào hai dấu hiệu: Một là: Dựa vào khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện sự sinh trưởng và phát triển của mình. Hai là: Dựa vào giai đoạn di động có hay không trong quá trình phát triển. 12 Năm 1926, Henneberg chia tất cả vi khuẩn acetic thành bốn nhóm theo nơi sinh sống đặc trưng của nhóm [28]. Nhóm 1: Vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa húp lông độc với chúng. Nhóm 2: Vi khuẩn phát triển trên bia. Nhóm 3: Vi khuẩn trong dung dịch rượu vang. Nhóm 4: Vi khuẩn để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh. Năm 1931, Janke hoàn thành khóa phân loại của mình. Năm 1934, theo nghiên cứu của hội nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ các vi khuẩn acetic có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ nên đã được kết hợp vào họ Nitro Bacteriaceae. Từ đó vi khuẩn giấm giữ tên Acetobacter [27]. Năm 1936, Kenyver và Wanniel cùng với Staniel đã cho rằng dựa vào đặc tính của vi khuẩn acetic có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động của chúng vào họ Pseudomonadaceae. Năm 1948, Vanght công bố kết quả của mình ông quan sát được về sự di động của nhiều loại Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter zancens, Acetobacter melanogenum, Acetobacter oxidans. Vanght đã giải thích rằng các loại trên cùng một loại có đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn acetic trong họ Pseudomonadaceae. Ngày nay theo khóa phân loại Bergey và nhiều tác giả đã xếp vi khuẩn Acetobacter và Gluconobacter vào họ Acetobacteriaceae. Năm 1914, Bergey phân loại các loài trong giống Acetobacter thành 2 loại: Loại 1: Oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch Hoyer dạng điển hình của vi khuẩn Acetobacter aceti). Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất . 13 Trên bề mặt môi trường dịch thể tạo màng nhầy có chưa xenluloza dạng điển hình là: Acetobacter xylinum. Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo màng nhầy chứa xenluloza dạng điển hình là: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter kneizigianus. Loại 2: Không oxi hóa acid acetic Tạo thành sắc tố trên môi trường có đường glucoza Sắc tố nâu tối tới đen nhạt: Acetobacter melanogenus Sắc tố hồng: Acetobacter Không tạo thành sắc tố Nhiệt độ thích hợp nhất từ 30-350C: Acetobacter suboxydans Nhiệt độ thích hợp nhất từ 18-210C: Acetobacter oxidans [15],[16] Năm 1960, Shiwel và Carr nghiên cứu về đặc trưng môi trường nuôi cấy và sinh hóa của vi khuẩn. Nhiệt độ phát triển thích hợp nhất nằm trong giới hạn 30-350C. Hai ông đã đi đến kết luận không thể có sự phân loại đồng nhất giữa các vi khuẩn Acetobacter [25], [26]. 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.2.1. Đặc điểm chung về vi khuẩn Acetobacter xylinum * Đặc điểm hình thái, tế bào học A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng 2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi trường. Khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [9]. 14 Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hoá dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, trong đất. * Đặc điểm nuôi cấy Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Vi khuẩn A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC. Ngược lại, trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [15], [23]. * Đặc điểm sinh lý, sinh hoá Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn A.xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, pH: 4 - 6. Nhiệt độ và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn A.xylinum sinh trưởng và tạo màng. A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ. Đặc điểm sinh hoá Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [22]…Theo quan điểm này A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1 dưới đây: 15 Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A.xylinum theo Frateur (1950) STT 1 2 3 Đặc điểm Hiện tƣợng Kết quả Oxy hoá ethanol Chuyển hoá môi trường chứa Bromphenol thành acid acetic Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí + Sinh khối không phát triển _ Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau lên men + Sinh trưởng trên môi trường Hoyer + Chuyển hoá 4 glycerol thành dihydroxyaceton 5 6 7 Chuyển hoá glucose Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc thành acid Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose trên môi trường chứa CaCO3 + Không hình thành sắc tố nâu _ Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam + * Đặc điểm về sinh trƣởng Vi khuẩn acetic phát triển tốt trên môi trường nước bia, các môi trường có chứa cao nấm men, glucose, rượu etylic hay mannitol,… trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ 25-300C, pH: 5,4 - 6,8 [15],[16]. Tính chất đặc trưng nhất của vi khuẩn acetic là khả năng oxy hóa rượu etylic thành acid acetic ở pH: 4,5. Ngoài ra, chúng còn thực hiện quá trình oxy hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeto hay các acid hữu cơ tương ứng. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn acetic đối với nguồn cacbon, nguồn nitơ và chất sinh trưởng rất đa dạng, chúng có thể đồng hóa nhiều loại thức ăn cacbon khác nhau như: các loại đường (monosaccaride, disaccaride, 16 polysaccaride) rượu etylic, acid hữu cơ, nhưng không sử dụng được tinh bột và lactose. Một số vi khuẩn acetic có khả năng tổng hợp polysaccharide phân tử lớn như cellulose, tinh bột, dextran,..người ta ứng dụng đặc tính này trong sản xuất công nghiệp. Một số loài tổng hợp được những sợi cellulose giống như bông: A.xylinum, A.aceti…Trong điều kiện có nhiều dextran, saccazoza, một số loài tổng hợp dextran giống Leuconostoc mensteroides. Một số vi khuẩn acetic còn tổng hợp được dextran khi môi trường thiếu dextran và cellulose [13]. 1.3. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật. Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hoá thành loại hợp chất có màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ bị chuyển hoá làm biến đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng n ày khi khử trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở 1100 trong 30 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndall). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường dùng 0,5-0,2% đường. Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá được các loại đường ở dạng đồng phân D [2]. Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon và nitơ (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch,...) có thể vừa sử dụng làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [2], [3]. 17 1.4. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng bacterial cellulose 1.4.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polymer-β-1,4 glucopyranose mạch thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau. Chuỗi polymer-β-1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải lớn. Hình 1.1. Sợi cellulose của màng BC Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hydro hoặc Vandervan tạo thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất hiện, chính vì thế mà màng BC được mở rộng [21]. 18 Hình 1.3. Sự hình thành những dải ribbon trong màng BC của A.xylinum 1.4.2. Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum 19 Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [12], [13]. Theo tác giả Alina Krystyna Vicz và cs cho rằng có 4 enzyme tham gia xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A.xylinum: Glucokinase (GK), Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - và Hromatka (1949-1953) cho rằng: tế bào vi khuẩn có khả năng sản sinh phosphate uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất [14], [17]. 1.5. Các điều kiện của quá trình lên men Khi nghiên cứu cơ chế quá trình lên men, Ebner acid acetic. Do đó tác động quan trọng nhất đối với quá trình lên men là: thành phần dinh dưỡng và điều kiện môi trường nuôi cấy. Khi các thành phần này thay đổi sẽ kéo theo thay đổi các thông số: tốc độ sinh trưởng (h-1), sinh khối tế bào, nồng độ acid tạo thành [18], [19]. 1.5.1. Ảnh hưởng của oxi Theo cơ chế của quá trình lên men để oxi hóa 1 mol rượu cần 1 mol O2. Thực tế càng thoáng khí thì năng suất càng cao. Ở phương pháp chậm do bề mặt tiếp xúc giữa tế bào và không khí bị hạn chế bởi sự bao phủ bề mặt dịch lên men của lớp váng giấm, độ dày của lớp dung dịch. Vì vậy quá trình lên men kéo dài 3-5 tuần. Nồng độ giấm thu được 3-7% acid acetic. Trong khi đó, phương pháp tuần hoàn nhờ tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn quá trình rút xuống từ 5-7 giờ. Ở phương pháp chìm thời gian chỉ còn 3-4 ngày, hệ số chuyển hóa đạt 98%. Nồng độ giấm đạt 7-14% acid acetic [2], [3]. 1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Vi khuẩn acetic thuộc vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ hoạt động thích hợp là từ 25-300C, nhiệt độ quá thấp làm chậm quá trình lên men, nhiệt độ cao sẽ làm 20 Tải về bản full