Nghiên Cứu Mức độ Biểu Hiện Và Giá Trị Chẩn đoán, Tiên Lượng Của ...

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị chẩn đoán, tiên lượng của một số miRNA ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết.Nhiễm khuẩn huyết (NKH) được định nghĩa là tình trạng rối loạn chức năng cơ quan đe dọa tính mạng domất kiểm soát đáp ứng hệ thống miễn dịch của cơ thể đối với căn nguyên nhiễm trùng [1]. Trong những năm gần đây, đã có nhiều tiến bộ vể hiểu biết về cơ chế bệnh sinh của NKH giúp cải thiện chẩn đoán, chăm sóc và điều trị. Tuy nhiên, NKH vẫn đang là một trong những thách thức đối với hệ thống chăm sóc sức khỏe với tỷ lệ mắc lên tới 437/100.000 dân và tỷ lệ tử vong cao[2]. Các báo cáo cũng đã ghi nhận NKH là một trong những căn nguyên gây tử vong hàng đầu trong bệnh viện, đặc biệt tại các đơn vị hồi sức tích cực với 270.000 ca tử vong liên quan đến NKH tại Hoa Kỳ, cứ ba bệnh nhân tử vong tại bệnh viện thì có một ca liên quan đến NKH[3].

Nhận biết và chẩn đoán sớm NKH giúp các nhà lâm sàng đưa ra các liệu pháp điều trị phù hợp và kịp thời, nhằm cải thiện các biến chứng như giảm tỷ lệ sốc nhiễm khuẩn, suy đa tạng, đồng thời giảm tỷ lệ tử vong[4]. Tuy nhiên, biểu hiện lâm sàng của nhiễm khuẩn huyết thường đa dạng và phức tạp, phụ thuộc vào đặc điểm của mỗi quần thể như tuổi, bệnh lý nền, tình trạng hệ thống miễn dịch của từng cá thể, ổ nhiễm khuẩn cũng như các tác nhân gây bệnh[5]. Các nghiên cứu đã cho thấy nhiều dấu ấn sinh học (biomarkers) đã được sử dụng trong chẩn đoán sớm và tiên lượng NKH như các cytokine (interleukin-1, interleukin-6, interleukin-8, interleukin-10), tumor necrosis factor α (TNF-α), Procalcitonin (PCT), C- reactive protein (CRP)[6],[7],[8]. Mặc dù vậy các dấu ấn sinh học này cóđộ đặc hiệu chưa cao và vẫn cần tìm kiếm các dấu ấn mới nhằm giúp các nhà lâm sàng có thêm các công cụ phát hiện sớm cũng như tiên lượng bệnh nhân NKH[9]. MicroRNA (miRNA) là các phân tửRNA chuỗi đơn ngắn (khoảng 22 nucleotide), nội sinh,không tham gia vào quá trình tổng hợp protein, tuy nhiên chúng có vai trò điều hòa các gien giai đoạn sau phiên mã [12]. Ở bệnh nhân2 NKH, miRNA cho thấy sự có mặt ở các giai đoạn trong cơ chế bệnh sinh như: đáp ứng viêm sớm, đáp ứng chống viêm, phản ứng viêm quá mức, ức chế miễn dịch, chết tế bào theo chương trình và cuối cùng dẫn đến rối loạn chức năng đa cơ quan [10]. Nghiên cứu chỉ ra vai trò của một số miRNA như miRNA-15a, miRNA-125b và miRNA-146a, miRNA-147 trong kiểm soát hoạt hóa NF-κB, thông qua đó tham gia các quá trình điều hòa cơ chế bệnh sinh của NKH[11],[12]. Các nghiên cứu đã cho thấy sự thay đổi mức độ biểu hiện của các miRNA trong huyết tương của bệnh nhân NKH, trong đó một số miRNA như miRNA-146-3p, miRNA-147b, miRNA-223, miRNA-155 cho thấy là những dấu ấn có tiềm năng trong chẩn đoán và tiên lượng NKH [13],[12],[14]. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của các miRNAkhác nhau ở bệnh nhân NKH phụ thuộc vào đặc trưng của các quần thể nghiên cứu cũng như phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện và nội chuẩn được sử dụng [15]. Ở Việt Nam, một số nghiên cứu đã cho thấyvai trò của các dấu ấn sinh học như IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α, PCT và CRP trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh nhân NKH [6],[16], đồng thời có nghiên cứu tìm hiểu về vai trò của một số miRNA trong bệnh lý gan mật, ung thư[17]. Tuy nhiên, chưa có các công bố về vai trò của các miRNA ở bệnh nhân NKH tại Việt Nam. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị chẩn đoán, tiên lượng của một số miRNA ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết” với hai mục tiêu sau: 1. Khảo sát mức độ biểu hiện của miRNA-146-3p, miRNA-147b, miRNA-155 và miRNA-223 ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết so với nhóm chứng. 2. Xác định vai trò của miRNA-146-3p, miRNA-147b, miRNA-155 và miRNA-223 trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh nhân nhiễm khuẩn huyế

MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ………………………………………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN …………………………………………………………………………………….. ii MỤC LỤC …………………………………………………………………………………………. iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ………………………………………….. vi DANH MỤC BẢNG …………………………………………………………………………… ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ………………………………………………………………………. xi DANH MỤC HÌNH …………………………………………………………………………… xii ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………………….. 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU …………………………………………………… 3 1.1. Tổng quan về nhiễm khuẩn huyết ………………………………………………….. 3 1.1.1. Định nghĩa nhiễm khuẩn huyết ……………………………………………….. 3 1.1.2.Căn nguyên, ổ nhiễm khuẩn tiên phát và yếu tố nguy cơ…………….. 6 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của nhiễm khuẩn huyết ………………………………… 7 1.1.4. Vai trò các dấu ấn sinh học trong nhiễm khuẩn huyết ……………… 11 1.2. miRNA và vai trò của một số miRNA trong NKH ………………………… 13 1.2.1. Nguồn gốc sinh học của miRNA ………………………………………….. 14 1.2.2. Cơ chế hoạt động của miRNA ở người ………………………………….. 15 1.2.3. Đặc tính của miRNA ……………………………………………………………. 15 1.2.4. Các kỹ thuật định lượng miRNA …………………………………………… 16 1.2.5. Vai trò của miRNA trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh ở người 17 1.2.6. Vai trò của miRNA ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết ………………. 20 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………. 31 2.1. Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………………………… 31 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu …………………………… 31 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ. ……………………………………………………………… 32 2.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ……………………………………………………. 32iv 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ……………………………………………………………. 32 2.2.2. Thời gian nghiên cứu …………………………………………………………… 32 2.3. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………………. 32 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu …………………………………………………………….. 32 2.3.2. Phương pháp tiến hành nghiên cứu ……………………………………….. 33 2.4. Nội dung nghiên cứu ………………………………………………………………….. 39 2.4.1. Chỉ tiêu nghiên cứu ……………………………………………………………… 39 2.4.2. Định nghĩa các biến số cần thu thập ………………………………………. 43 2.5. Phương tiện, sinh phẩm, và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ……… 45 2.5.1. Khám lâm sàng ………………………………………………………………….. 45 2.5.2. Các xét nghiệm huyết học và sinh hóa cơ bản. ………………………… 45 2.5.3. Xét nghiệm PCT …………………………………………………………………. 46 2.5.4. Cấy khuẩn và định danh……………………………………………………….. 46 2.5.5. Kỹ thuật multiplex PCR xác định DNA của vi khuẩn trong máu . 46 2.6. Phương tiện nghiên cứu ……………………………………………………………… 46 2.7. Xử lý số liệu ……………………………………………………………………………… 47 2.8. Đạo đức nghiên cứu ………………………………………………………………….. 49 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……………………………………………….. 51 3.1. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng …………………………………………….. 51 3.1.1. Một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết ….. 51 3.1.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng ………………………………………………. 54 3.2. Mức độ biểu hiệncủa các miRNA ………………………………………………… 57 3.2.1. Mức độ biểu hiệncủa các miRNA ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết so với nhóm chứng. ………………………………………………………………. 57 3.2.2. Liên quanmức độ biểu hiệncủa miRNA với biểu hiện lâm sàng … 61 3.2.3. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của miRNA với suy chức năng cơ quan ……………………………………………………………………………………. 63 3.2.4. Sự thay đổi biểu hiện của miRNA theo mức độ nhiễm khuẩn huyết . 64v 3.2.5. Mức độ biểu hiện miRNA ở BN NKH theo kết quả phát hiện tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết …………………………………………………. 65 3.2.6.Mức độ biểu hiện của miRNA theo kết quả điều trị………………….. 66 3.3. Giá trị của miRNA trong chẩn đoán và tiên lượng nhiễm khuẩn huyết 66 3.3.1. Giá trị của miRNA trong chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết ………….. 66 3.3.2. Giá trị của miRNA trong tiên lượng bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết. 71 Chương 4. BÀN LUẬN ……………………………………………………………………… 76 4.1. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết .. 76 4.1.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết …………….. 76 4.1.2. Đặc điểm cận lâm sàng nhóm bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết …… 79 4.2. Mức độ biểu hiệnmiRNA ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết …………….. 83 4.2.1. Mức độ biểu hiệnmiRNA ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết và nhóm chứng là người khỏe mạnh và bệnh nhân SXH Dengue …………….. 83 4.2.2. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của miRNA theo vị trí ổ nhiễm khuẩn tiên phát của nhiễm khuẩn huyết ………………………………….. 87 4.2.3. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của miRNA ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết theo rối loạn chức năng cơ quan ………………………….. 87 4.3. Giá trị của miRNA trong chẩn đoán và tiên lượng nhiễm khuẩn huyết 93 4.3.1. Vai trò của miRNA trong chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết …………. 93 4.3.2. Vai trò của miRNA trong tiên lượng nhiễm khuẩn huyết …………. 98 HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI …………………………………………………………………. 105 KẾT LUẬN …………………………………………………………………………………….. 106 KHUYẾN NGHỊ……………………………………………………………………………… 108 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán NKH theo đồng thuận quốc tế lần thứ 2 …… 4 Bảng 1.2. Thay đổi khái niệm về nhiễm khuẩn huyết ……………………………….. 5 Bảng 1.3. Bảng điểm SOFA đánh giá suy chức năng tạng …………………………. 6 Bảng 1.4. Vai trò cuả miRNA trong cơ chế bệnh sinhcủa nhiễm khuẩn huyết …………………………………………………………………………………. 24 Bảng 2.1. Trình tự mồi của các miRNA ………………………………………………… 35 Bảng 2.2. Đánh giá các biến đổi về chỉ số huyết học ………………………………. 41 Bảng 2.3. Các biến đổi về chỉ số sinh hóa máu ………………………………………. 42 Bảng 2.4. Tiêu chuẩn rối loạn chức năng cơ quan theo Knaus………………….. 44 Bảng 3.1. Đặc điểm chung của bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết …………………. 51 Bảng 3.2. Các bệnh lý nền ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết …………………….. 52 Bảng 3.3. Đặc điểm suy chức năng các cơ quan ……………………………………… 53 Bảng 3.4. Đặc điểm xét nghiệm huyết học …………………………………………….. 54 Bảng 3.5. Đặc điểm xét nghiệm sinh hóa máu ……………………………………….. 55 Bảng 3.6. Kết quả xét nghiệm lactat máu động mạch và Procalcitonin ……… 55 Bảng 3.7. So sánh mức độ biểu hiện của các miRNA ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết với người khỏe mạnh ……………………………………….. 58 Bảng 3.8. So sánh mức độ biểu hiện của các miRNA ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết với bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue …………………. 59 Bảng 3.9. Mối tương quan giữa các miRNA với tuổi ở từng nhóm nghiên cứu …… 61 Bảng 3.10. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của miRNA ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết có bệnh lý nền. ………………………………………………… 61 Bảng 3.11. Mức độ biểu hiện của miRNA-146-3p và miRNA-147b theo vị trí ổ nhiễm khuẩn tiên phát ………………………………………………….. 62x Bảng 3.12. Mức độ biểu hiện miRNA-155 và miRNA-223 theo vị trí ổ nhiễm khuẩn tiên phát …………………………………………………………. 62 Bảng 3.13. Mức độ biểu hiện của miRNA ở BN NKH có suy hô hấp ……….. 63 Bảng 3.14. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của miRNA ở BN NKHcó rối loạn chức năng tim mạch …………………………………………………….. 63 Bảng 3.15. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của miRNA ở BN NKHcó rối loạn chức năng thận ……………………………………………………………. 64 Bảng 3.16. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của miRNA theo mức độnhiễm khuẩn huyết ……………………………………………………………………….. 64 Bảng 3.17. Mức độ biểu hiện của miRNA theo kết quả phát hiện tác nhân … 65 Bảng 3.18. Mức độ biểu hiện của miRNA ở BN NKH theonhóm tác nhân gây bệnh ……………………………………………………………………………. 65 Bảng 3.19. Mức độ biểu hiện của miRNA theo kết quả điều trị………………… 66 Bảng 3.20. Giá trị của miRNA trong chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết với nhóm chứng là người khỏe mạnh …………………………………………. 67 Bảng 3.21. Giá trị của miRNA trong chẩn đoánnhiễm khuẩn huyết với nhóm chứng là SXH Dengue ……………………………………………….. 68 Bảng 3.22. Giá trị của miRNA trong tiên lượng sốc ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết ……………………………………………………………………….. 71 Bảng 3.23. Giá trị của miRNA, PCT, bạch cầu trong tiên lượng tử vong ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết ……………………………………………… 73 Bảng 4.1. Các nghiên cứu về mô hình kết hợp các chỉ số lâm sàng và xét nghiệm trong chẩn đoán và tiên lượng nhiễm khuẩn huyết …….. 103xi DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang Biểu đồ 3.1. Ổ nhiễm khuẩn tiên phát của bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết …. 52 Biểu đồ 3.2. Rối loạn chức năng các cơ quan ở bệnh nhân nghiên cứu ……… 53 Biểu đồ 3.3. Tác nhân được phát hiện trong máu ……………………………………. 56 Biểu đồ 3.4. Mức độ biểu hiện của các miRNA ở bệnh nhân NKHvà nhóm chứng (không NKH) ……………………………………………………… 57 Biểu đồ 3.5. Mức độ biểu hiện của 4 miRNA huyết tương ở người khỏe mạnh, bệnh nhân SXH Dengue và nhiễm khuẩn huyết ………. 60 Biểu đồ 3.6. Đường cong ROC của miRNA trong chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết với nhóm chứng là người khỏe mạnh ……………………… 66 Biểu đồ 3.7. Đường cong ROC của miRNA trong chẩn đoánnhiễm khuẩn huyết với nhóm chứng là SXH Dengue ……………………………. 68 Biểu đồ 3.8. Giá trị của các miRNA kết hợp trong chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết với nhóm chứng là người khỏe mạnh ……………………… 69 Biểu đồ 3.9. Giá trị của các miRNA kết hợp trong chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết với nhóm SXH Dengue …………………………………………. 70 Biểu đồ 3.10. Giá trị của miRNA và PCT trong tiên lượng sốc ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết ………………………………………………………… 71 Biểu đồ 3.11. Giá trị của miRNA, PCT, bạch cầu trong tiên lượng tử vong ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết ……………………………………… 72 Biểu đồ 3.12. Đường cong ROC của miRNA kết hợp và miRNA+PCT trong tiên lượng sốc ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết ………… 73 Biểu đồ 3.13. Đường cong ROC của miRNA kết hợp trong tiên lượng tử vong ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết ……………………………… 74 Biểu đồ 3.14. Đường cong ROC của miRNA kết hợp với PCT, SOFA và tuổi trong tiên lượng tử vong ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết ……….. 75xii DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1. Qúa trình sinh tổng hợp của miRNA ………………………………………. 14 Hình 1.2. Vai trò của miRNA ở phản ứng viêm …………………………………………. 21 Hình 1.3. Mức độ biểu hiện của một số miRNA ở bệnh nhânnhiễm khuẩn huyết và SIRS ……………………………………………………………………… 25 Hình 1.4. Vai trò miRNA-146a trong ức chế dịch mã tế bào dung nạp nội độc tố………………………………………………………………………………… 27 Hình 1.5. Động học miRNA-147b ………………………………………………………… 28 Hình 2.1. Máy Agilent Technologies Stratagiene Mx3005p Real Time PCR ………………………………………………………………………………….. 47 Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu ………………………………………………………………….