Nghiên Cứu Nhân Giống Cây Lõi Thọ Bằng Kỹ Thuật Nuôi Cấy In Vitro

Tải bản đầy đủ (.doc) (31 trang)

1. Trang chủ
>>
2. Luận Văn - Báo Cáo
>>
3. Báo cáo khoa học

Nghiên cứu nhân giống cây lõi thọ bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (238.59 KB, 31 trang )

1Nghiên cứu nhân giống cây Lõi thọ(Gmelina arboreaRoxb) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro2I. ĐẶT VẤN ĐỀViệt Nam là Quốc gia có tiềm năng lớn cho phát triển nghề rừng. Trongnhững năm gần đây, chúng ta đã có nhiều quan tâm hơn cho việc phát triển vàxã hội hoá nghề rừng, nhưng đến nay mặc dù diện tích rừng có tăng lên nhưngchất lượng rừng chưa được cải thiện. Do một số nguyên nhân chủ yếu là: chấtlượng giống không đảm bảo, công tác quản lý giống cây lâm nghiệp cònnhiều bất cập như chưa kiểm tra được nguồn gốc, xuất xứ của các giống đưavào trồng rừng; còn thiếu các hướng dẫn kỹ thuật về trồng rừng, chăm sóc vàbảo vệ đối với từng loài cây, điều kiện lập địa từng vùng cụ thể; việc lựa chọnloài cây trồng chưa phù hợp.Lõi thọ có tên khoa học là Gmelina arborea Roxb thuộc họ Tếch(Verbenaceae). Lõi thọ là loài cây sinh trưởng nhanh, trong 6 năm đầu có thểđạt chiều cao 12 – 14 m; đường kính thân cây đạt 35 – 40 cm; thân thẳng vàtán khá đẹp. Gỗ Lõi thọ có giác mỏng màu vàng nhạt, lõi nâu vàng, kết cấumịn dễ làm, ít biến dạng, không bị mối mọt; có trọng lượng riêng từ 0,42 –0,64. Gỗ Lõi thọ có thể được dùng để đóng thuyền, làm nhà, làm giấy, làm gỗdán lạng. Vì vậy, Lõi thọ là đối tượng được các nhà khoa học về chọn tạogiống cây rừng và người dân trồng rừng đặc biệt quan tâm.Ở Việt Nam, Lõi thọ phân bố rãi rác ở hầu hết các tỉnh trong cả nước,phát triển tốt ở các tỉnh phía Bắc, Trung du, và vùng núi thấp như: TuyênQuang, Lạng Sơn, Phú Thọ, Hà Giang. Do Lõi thọ là loài cây gỗ lớn, dễ gâytrồng, sinh trưởng nhanh và đem lại hiệu quả kinh tế cao, nên Lõi thọ là đốitượng cây trồng rừng được nhiều người dân quan tâm lựa chọn. Do đó, nhucầu về giống cây Lõi thọ chất lượng cao phục vụ trồng rừng sản xuất trongthời gian tới sẽ rất cao. Hiện nay, Lõi thọ trong các rừng tự nhiên còn rất ít, lạiphân bố rải rác nên việc thu hái hạt giống gặp nhiều khó khăn, số lượng ítkhông đáp ứng đủ cho nhu cầu trồng rừng của người dân ở cả hiện tại và3tương lai. Đến nay, mới chỉ có một số nghiên cứu về nhân giống Lõi thọ bằnghạt, hom và mới đạt được một số kết quả bước đầu. Việc áp dụng phươngpháp nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đối với một số loài cây rừngđã được áp dụng rộng rãi, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nhiều cơ sở sảnxuất cây con và người trồng rừng. Tuy nhiên, đối với Lõi thọ thì chưa cónghiên cứu nào về nhân giống loài cây này bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro,biện pháp thường sử dụng để nhân giống vẫn là sản xuất cây con gieo ươm từhạt. Hiện nay, xu thế trồng rừng dòng vô tính đang dần trở thành yêu cầu bắtbuộc đối với trồng rừng sản xuất, vì biện pháp trồng rừng này sẽ tạo ra quầnthể cây trồng giữ nguyên được phẩm chất di truyền tốt của các cây mẹ, tránhđược hiện tượng phân ly hữu tính, nên đồng đều về sinh trưởng và sản phẩm,rất thuận lợi cho việc gây trồng, chăm sóc, khai thác và chế biến. Vì vậynghiên cứu nhân giống Lõi thọ bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhằm chủ độngtạo ra lượng lớn cây con chất lượng cao trong thời gian ngắn để cung cấp chothị trường giống đang có nhu cầu rất lớn là việc làm cần thiết và có nhiều ýnghĩa. Để đạt được mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:“Nghiên cứu nhân giống cây Lõi thọ(Gmelina arborea Roxb) bằng kỹ thuậtnuôi cấy in vitro”.4CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU2.1Giới thiệu khái quát về cây Lõi thọ2.1.1. Đặc điểm hình thái, phân loại và giá trị sử dụngLõi thọ có tên khoa học học là: Gmelina arborea Roxb thuộc họ Tếch(Verbenaceae) là cây gỗ lớn có thể cao 35m, đường kính 100cm. Vỏ cây màuxám nâu nhiều lỗ bì lớn, bong mảng. Cành non mọc gần đối hơi vuông cạnh,nhiều đốm xám trắng nhỏ. Lá đơn mọc đối hình trứng gần tròn, đầu nhọn dần,đuôi nêm rộng. Phiến lá dài 10 - 25cm, rộng 5 - 18cm, mặt trên màu lục xẫm,mặt dưới xanh hay vàng nhạt, phủ lông mịn mép lá nguyên hoặc hơi gợnsóng. Có 3 - 5 gân gốc, nách gân gốc mặt dưới có tuyến nhỏ xanh bóng.Cuống lá dài 4 - 5cm phủ lông màu nâu nhạt. Không có lá kèm. Hoa tự chùmhoặc xim viên chuỳ phủ dầy lông nâu vàng. Hoa tương đối lớn, đài hìnhchuông mép có 5 răng nhỏ hình tam giác. Tràng hoa không đều có 2 môi, môitrên nguyên hoặc hơi lõm ở đỉnh, môi dưới xẻ 3, màu vàng, phía trong phớttím. Nhị 4, có 2 nhị dài trội lộ ra ngoài. Bầu hình cầu, nhẵn. Đầu nhuỵ xẻ đôi.Quả hạch đường kính 2 - 2,5cm khi chín màu vàng sau nâu đen, hạch có 4 ô,chỉ có 1 hạt. Vỏ hạch cứng, đỉnh có lỗ nhỏ. Mỗi kg hạt có từ 700 - 1400 hạt.Gỗ có giác mỏng màu vàng nhạt, lõi nâu vàng, kết cấu mịn dễ làm, ít biếndạng, không bị mối mọt. Gỗ có trọng lượng riêng từ 0,42 – 0,64. Có thể dùnggỗ Lõi thọ đóng thuyền, làm nhà, làm giấy, làm gỗ dán lạng. Quả ăn được. Lávà quả loài Lõi thọ được sử dụng nhiều ở Ấn Ðộ, một trong những bộ phận đócó giá trị làm thuốc.2.1.2. Đặc tính sinh học, sinh thái và phân bốLõi thọ phân bố ở vùng Nam và Đông Nam Châu Á từ Pakistan và SriLanka tới Myanma và chủ yếu ở các quốc gia Bangladesh, Myanma, TháiLan, nam Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia và Philippines (Jensen, 1995). Có5thể tìm thấy loài này ở vùng nhiệt đới thuộc Châu Phi và các quốc gia MỹLatin (Evans 1982).Lõi thọ thường phân bố trong rừng mưa, ở độ cao 1200 m trở lên so vớimực nước biển và với lượng mưa 750 – 5000mm. Sinh trưởng tốt nhất ở nhiệtđộ 21 – 280C (Jensen, 1995). Chi Gmelina thích hợp với nơi đất ráo nước,giàu dinh dưỡng và có độ pH từ 5 – 8. Phát triển kém ở những nơi đất có hàmlượng axít cao (theo F/FRED, 1994).Ở Việt Nam Lõi thọ mọc rải rác ở trong rừng và phát triển tốt ở các tỉnhphía Bắc, Trung du, và vùng núi thấp như: Tuyên Quang, Lạng Sơn, Phú Thọ,Hà Giang (theo tạp chí Kinh tế VAC, số 25). Theo Lê Mộng Chân, Lê ThịHuyên (2000), Lõi thọ phân bố rãi rác ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, là loàicây mọc nhanh, rụng lá vào mùa khô, ra lá trước khi ra hoa. Ra hoa vào tháng5 - 6. Quả chín vào tháng 11 - 12. Là loài cây ưa sáng, mọc tự nhiên ở vùngcó khí hậu nhiệt đới mưa mùa, có mùa khô tương đối dài, lượng mưa thíchhợp 1700 – 2200 mm/năm; nhiệt độ cao nhất tuyệt đối 37 - 480C, thấp nhấttuyệt đối 1 - 160C. Có thể sống được trên nhiều loại đất kể cả đất đá ong, đấtđá vôi. Trên đất cát hoặc sỏi cây sinh trưởng chậm. Khả năng tái sinh hạt vàchồi tốt. Theo Nguyễn Duy Khiêm & Paul van der Poel (1993) Lõi thọthường gặp trong rừng kín ẩm nhiệt đới lá rộng nửa rụng lá, mọc xen lẫn vớicác loài cây Xoan mộc (Toona febrifuga), Bồ hòn (Sapindus mukorossi), Limxẹt (Pelthophorum tonkinensis), Muồng (Cassis sp), Xoan nhừ (Spondiasmangifera),….2.2 Nhân giống cây trồng in vitro2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vậtNuôi cấy bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vựcnghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ thuậtnuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều6lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữnguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa mộtgiống mới vào sản xuất.Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trìvà bảo quản cây trồng quý hiếm.Nhân giống vô tính bằn g kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnhnhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới haymô sẹo mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấychuyền để nhân giống.Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phươngpháp nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất. Năm 1939,nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi (White,1939) và rễ (Nobercourt, 1939). Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động củacác nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan(Thorpe, 1980, 1988). Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan invitro, cho thấy có 3 nhân tố ảnh hưởng trực tiếp: Môi trường nuôi cấy, điềukiện nuôi cấy và mẫu được sử dụng trong nuôi cấy.Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương hỗcủa các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quátrình hình thành chồi và rễ (Brown &Thorpe, 1986).2.2.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vậtTính toàn năng cùng với sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào là cơ sởkhoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào thực vật.2.2.2.1. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào thực vậtHaberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy môvà tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tếbào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyềncủa cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thểphát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [5,6 ].7Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở khoa họccủa phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Đến nay, con người đã hoàntoàn chứng minh được khả năng tái sinh thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh từmột tế bào riêng rẽ.2.2.2.2. Sự trẻ hóaVào thế kỷ XVII, XVIII người ta cho rằng các dòng vô tính bị thoái hóađi theo tuổi và chỉ có thể trẻ hóa thông qua sinh sản bằng hạt. Song thực tếcho thấy đời sống của một dòng vô tính là vô hạn nếu như nó sống trong môitrường thích hợp và liên tục đổi mới bằng sinh sản sinh dưỡng. Khả năng táisinh là một dấu hiệu quan trọng xác định sự chuyển giai đoạn từ non trẻ sangtrưởng thành. Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là rất khácnhau. Nuôi cấy các bộ phận non trẻ sẽ ra chồi, ra rễ tốt hơn các bộ phậntrưởng thành. Vì vậy, việc trẻ hóa là một biện pháp quan trọng nhất trongnhân giống sinh dưỡng [5,6].Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy thực vật in vitro thực chất làkết quả của phân hóa và phản phân hóa tế bào.2.2.2.3. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bàoCơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiềucơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thựchiện các chức năng cụ thể khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đềubắt nguồn từ tế bào phôi sinh.Quá trình phân hóa tế bào có thể bảng thị như sau:Tế bào phôi sinhTế bào giãnTế bào phân hóa chức năngTuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng khônghoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết và cóđiều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phânchia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là sự phản phân hóa tế bào, ngược lại với sựphân hóa tế bào.Về bản chất thì quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào là do điềuhòa hoạt động của gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển8của cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để chora tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Điều này xảy ratheo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗitế bào.Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chếbởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng rẽ tế bào, gặp điều kiện thuận lợithì các gen được hoạt hóa, quá trình phân hóa sẽ được xảy ra theo một chươngtrình đã định sẵn.2.2.3 Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vậtTheo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợiđiểm sau:Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ. Phần này giống như nhângiống vô tính. Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớncác loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, vàcó thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính cólợi điểm hơn nhân giống qua hạt.So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhângiống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớntừ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn.Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu banđầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh.Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiệnngoại cảnh. Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vàosản xuất. Việc trao đổi giống được dễ dàng.2.2.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vậtTheo Dương Công Kiên (2002), có một số phương pháp nuôi cấy mô tếbào thực vật như sau:92.2.4.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởngMột trong những phương thức sinh trưởng để đạt được mục tiêu trongnuôi cấy tế bào và mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôicấy chồi đỉnh và chồi bên).Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứađầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng cóbổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp,…Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽphát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ralá và rễ để trở thành cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất dần dầnthích nghi và phát triển bình thường.2.2.4.2 Nuôi cấy mô sẹoMô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phảnphân hoá của tế bào đã phân hoá. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trườngcó sự hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoànchỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo.2.2.4.3 Nuôi cấy tế bào đơnKhi mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máylắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi làtế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăngsinh khối.Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơnđược tách ra và trải trên môi trường thạch. Khi môi trường thạch có bổ sungauxin, tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào mô sẹo. Khi trên môi trườngthạch có tỷ lệ cytokinin – auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinhthành cây hoàn chỉnh.2.2.4.4 Nuôi cấy protoplast - chuyển gen10Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiệnnuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phânchia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năngdung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống câytrồng. Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượngcùng loài hay khác loài.2.2.4.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bộiHạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạothành mô sẹo. Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội.2.2.5 Các giai đoạn nhân giống in vitroTheo Nguyễn Xuân Linh (1998), sự thành công của việc nhân giống invitro chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn:2.2.5.1 Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấyĐây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống invitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng đểđưa vào nuôi cấy in vitro.Theo tài liệu của Street (1974) các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô nuôicấy như sau:Tác nhân vô trùngHypochlorit CalciumNatri hypochloritHydroperoxidNước bromHgCl2Chất kháng sinhNồng độ (%) Thời gian xử lý(phút)9 - 10210 - 121-20,1 - 14 – 50mg/l5 - 305- 35 - 152 - 102 - 1030 -60Hiệu quảRất tốtRất tốtTốtRất tốtTBKhá tốt11Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầutiên.Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thìsau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả.2.2.5.2 Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấyMục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng cácmô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của cáchợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên,bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy.Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởngthành đã chuyên hoá sâu. Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trongthời gian sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rấtkhả quan trong tái sinh chồi.2.2.5.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanhGiai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệsố nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chấtđiều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin,…), các chất bổ sungkhác như nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ,ánh sáng thích hợp. Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thểnhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi)hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông quaviệc tạo cây từ phôi vô tính.2.2.5.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnhKhi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ởgiai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẽnày sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người tathường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật12quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.2.2.5.5 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đấtGiai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng củaquá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quátrình này trong thực tiễn sản xuất.Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sangsống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệtdộ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trongvườn ươm cũng như ruộng sản xuất.2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro2.2.6.1 Mẫu nuôi cấyMurashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợpvà chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Điềuquan trọng cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gen, cơquan được chọn lọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ củamẫu và nguồn mẫu.- Kiểu genKiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài thuốc láđược sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khácnhau giữa các genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi. Hơn nữa, Jaramillo vàSummers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đườngkính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cà chua Lycopersycon esculentum Mill.- Chọn cơ quanMurashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khảnăng sử dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở cácloài khác nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschungvà Miller (1976) cho rằng chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây13nẩy mầm từ hạt.- Tuổi và sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm củamẫu nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổisinh lý. Có nhiều nghiên cứu khác nhau vế ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫunuôi cấy, theo Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phátsinh trên lá già.- Mẫu in vitro: Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấymẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộnghay trong vườn ươm như ở cây Azalea (Economou và Read, 1986). Tuynhiên, Lu et al. (1991) ghi nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khinuôi cấy túi phấn trên cây đồng ruộng.- Sức sống của mẫuĐiều cần thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấyin vitro. Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuấtnhững cây sạch bệnh và điều này nói lên rằng cần phải cẩn thận chọn mẫunuôi cấy nhất là đối với những cây bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ cómột số lượng lớn những cây bệnh được nhân lên.2.2.6.2 Điều kiện nuôi cấyNhiệt độNhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 – 27C. Theo Murashige (1974),nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro quanhững tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan.Cường độ ánh sángCường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnhhưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng của ánhsáng hình như có liên hệ với các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sángtrung bình và ánh sáng thấp hay tối (Papachatzi et al., 1981; Miller và14Murashige, 1976; Thorpe và Murashige, 1970). Việc nuôi cấy in vitro tốt nhấttrong điêu kiện ánh sáng 1000 lux (Dương Công Kiên, 2002).Quang kỳ và chất lượng ánh sáng+ Thời gian chiếu sángẢnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng.+ Chất lượng ánh sáng 22Ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn ánh sáng đỏ hayánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa, chếđộ dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro.+ Các chất khíThành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng cây invitro. O2, CO2 và ethylen là những thành phần chất khí được khảo sát nhiềutrong môi trường nuôi cấy. Ẩm độ cũng được quan tâm đến, do ảnh hưởngđến quá trình làm khô mẫu nuôi cấy.2.2.6.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấyLựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô là rất cầnthiết. Vì mỗi loại cây trồng khác nhau đều yêu cầu một hàm lượng dinhdưỡng khác nhau. Mặt khác, môi trường còn thay đổi tuỳ thuộc vào sự phânhoá của mô cấy, tuỳ theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ,tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh.Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôicấy hoặc thăm dò qua một số môi trường đã cho để xác định môi trường thíchhợp cho mẫu nuôi cấy.Các môi trường đều được thành lập từ một số thành phần chính vớinguyên tắc có sự cân bằng các yếu tố trong môi trường.Các thành phần chính:- Đường làm nguồn carbon.15- Các muối khoáng đa lượng.- Các vitamin.- Các chất sinh trưởng.Ngoài ra các tác giả còn cho thêm một số chất hữu cơ như: Nước dừa,nước chiết nấm men.2.2.7 Những vấn đề trong nhân giống in vitro2.2.7.1 Tính bất định về mặt di truyềnMặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính đã được sử dụng nhằm mục đích tạora quần thể cây trồng đồng nhất (true-to-type) với số lượng lớn, nhưng cũngtạo ra những biến dị soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn.Những biến dị này được nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống cây trồng(Evans và Sharp,1986, 1988; Larkin, 1987). Tần số biến dị thì hoàn toàn khácnhau và không lặp lại (Sreissen và Karp, 1985; Fish và Karp, 1986).Những nhân tố gây ra biến dị tế bào soma như:- Kiểu di truyền- Thể bội- Số lần cấy chuyền- Loại mô2.2.7.2 Sự hoại mẫuCó hai tác nhân làm hư mẫu nuôi cấy in vitro:- Bị vi sinh vật huỷ hoại, có thể khử trùng mẫu trước khi đưa vào môitrường.- Bị virus hay thể giống như virus xâm nhiễm, không hại mẫu nhưng cóảnh hưởng về sau.Tuy nhiên có sự xâm nhiễm của vi sinh vật như Agrobacterrium, Bacillusvà Pseudomanas vào nhu mô dẫn truyền sẽ hoại mẫu khi tế bào bắt đầu phânchia.16Có thể làm giảm khả năng hoại mẫu bằng cách:- Khử trùng mẫu trước khi cấy vào môi trường.- Sử dụng mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh.2.2.7.3 Việc sản xuất chất gây độc từ mẫu cấyThường chúng ta hay thấy hiện tượng hoá nâu hay hoá đen mẫu, sinhtrưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấycó chứa nhiều chất tannin hay hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn mônon.Khi môi trường và mô cấy bị đổi màu quá mức thì absorbent được sửdụng. Hai loại absorbent thông thường là polyvinylpyrrolidone (PVP) và thanhoạt tính. Nhưng một số nghiên cứu cho rằng nên sử dụng than hoạt tính(Mohamed – Yassen et al., 1995 và Wann et al., 1997)Nhiều phương pháp làm giảm sự hoá nâu được đề nghị và được nhiều nhàkhoa học đồng ý như:Sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô non.Gây ít vết thương trên mẫu khi khử trùng.Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid và citric acid vài giờ trước khicấy.Nuôi cấy trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1-2 tuần.Chuyển mẩu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng thấp qua môitrường có nồng độ cao hơn.2.2.7.4 Sử dụng thuốc kháng sinhCó nhiều loại thuốc kháng sinh sử dụng trong nuôi cấy mô, nhằm hạn chếsự hoại mẫu của vi sinh vật như kanamycin, penicillin, nystatin, amphotericinB,… Nồng độ sử dụng 5 -100 g/l phụ thuộc vào vật liệu nuôi cấy như tế bàohay tế bào trần. Sự huỷ hoại của chất kháng sinh lên mô thực vật xảy ra ởplastid hay mitochondria, xử lý càng lâu hay nồng độ càng cao dễ dàng dẫn17đến sự thay đổi kiểu gen của tế bào chất hay DNA.2.2.7.5 Hiện tượng thuỷ tinh thểThân lá phồng to chứa nhiều nước, cây có dạng trong. Đây là một dạngbệnh lý thường thấy khi cây được nuôi trong môi trường mà việc trao đổi khígiữa cây và môi trường bên ngoài bị dừng lại, quá trình thoát hơi nước tậptrung trong cây.Một số phương pháp hạn chế quá trình hoá thuỷ tinh thể:Giảm sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ đườngtrong môi trường cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao.Tránh gây thương tổn trên mẫu cấy và tiếp xúc với mẫu cấy ít nhất.Ở một số loài có thể sử dụng chất ABA.Giảm nồng độ đạm trong môi trường cấy.Giảm C2H2 trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánhsáng và giảm nhiệt độ phòng cấy.2.2.8 Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV)Chất ĐHSTTV hay hormones sinh trưởng là các hợp chất hữu cơ (gồmcác sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo).Chúng có tác dụngđiều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của thựcvật. Tuy nhiên, các chất ĐHSTTV chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chấtmà không tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất. Nó không thể dùngđể thay thế chất dinh dưỡng. Chất ĐHSTTV gây nên tác dụng mạnh mẽ vớimột lượng vô cùng bé lên trao đổi chất của tế bào, ở nồng độ cao chúng có thểhoạt động như chất kìm hãm. Trong thành phần môi trường nuôi cấy, các chấtĐHSTTV làm việc như chiếc chìa khoá đóng mở sự hoạt động của gen, điềukhiển sự phát sinh hình thái và tổng hợp hoạt chất. Tác dụng của chấtĐHSTTV liên quan đến hiện tượng kìm hãm và cảm ứng tổng hợp enzymetrong cơ thể thực vật, hoạt hoá các bộ phận của phân tử DNA. Mỗi một chất18ĐHSTTV đều mang một chức năng riêng, nhưng trong cơ thể của thực vật, đểđiều khiển những hoạt động của thực vật, chúng tham gia vào thường khôngphải là một mà là vài chất. Tuỳ mỗi giai đoạn nuôi cấy, giai đoạn phát triểncủa thực vật, sự kết hợp các chất này có khác nhau. Trong phạm vi nghiên cứucủa đề tài chúng tôi sử dụng các chất thuộc nhóm auxin và cytokinin.2.2.8.1 AuxinTác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kíchthích sự hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụnghoa, rụng quả. Auxin hoạt hoá các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose,pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng. Auxin được xem là hormone thực vậtquan trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinhtrưởng và biệt hoá tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật.Auxin cùng với một số chất điều chỉnh khác đảm bảo cho sự tạo thành khốicác tế bào đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh.Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như:- Indol acetic acid (IAA)- Naphthyl acetic acid (NAA).- 2,4-D Dichlorophenol acetic acid (2,4-D).- Indol butyric acid (IBA).2.2.8.2 CytokininBao gồm các nhóm chất:- 6-Benzylaaminopurin (BAP).- Kinetin (Ki).- Zeatin (Z).- Thidiazuron (TDZ).Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cấy mô và làmtăng tốc độ phân bào. Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo19chồi, đồng thời ức chế sự phân hoá rễ của mô cấy. Cytokinin có hiệu quả rấtrõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này cytokinin cần thiết nhưngchúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin. Trong một tỷ lệ giữa cytokininvà auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường cytokynin cao hơnauxin thì kích thích tạo chồi. Và ngược lại, auxin cao hơn cytokinin thì kíchthích sự tạo rễ.Trong cơ thể thực vật cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổnghợp DNA và protein, kích thích quá trình trao đổi chất.2.2.9 Những thành tựu về nuôi cấy mô cây rừng trên thế giới và ViệtNam2.2.9.1 Trên thế giớiNgành nuôi cấy mô đã thu được nhiều thành tựu ở các lĩnh vực cây trồngcông nghiệp (cà phê, thuốc lá, cọ dầu, cao su,…), cây nông nghiệp, thực phẩm(khoai tây, lúa, bắp cải,…), cây cảnh (phong lan, cẩm chướng, huệ,…) (AlbertSassons, 1988; Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, 1993; Bezborogov và cáctác giả, 1994). Đặc biệt trên lĩnh vực cây cảnh thì phong lan nuôi cấy môđược phát triển rất rộng rãi cả trong nước và ngoài nước (Nguyễn Thiện Tịchvà các tác giả, 1988; Võ Thị Bạch Mai, 1996). Cây ăn trái lâu năm: cây khế,mãng cầu xiêm, măng cụt,… (Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, 1993). Trongtạp chí “Plant physiology” (1988) và nhiều tài liệu khác, các nhà khoa họcNga cũng cho biết kết quả nuôi cấy mô nhiều loài cây khác nhau như thông,bạch dương,…Ngày nay cây trồng từ cấy mô không chỉ quen thuộc với các nhà nghiêncứu, các nhà kinh doanh, sản xuất chuyên nghiệp mà cả những người nôngdân, người làm vườn thủ công cũng đã biết và quan tâm tới như cây khoai tây,cây chuối,…Tuy nhiên trên lĩnh vực cây trồng rừng, nhất là những cây quý, hiếm, lâu20năm do những đặc thù riêng còn ít được nghiên cứu kể cả về chủng loài vàquy mô nghiên cứu. Các kết quả đã có đều chủ yếu nghiên cứu cho các loàicây mọc nhanh, cây có giá trị kinh tế trong thời hạn kinh doanh ngắn, có khảnăng mau chóng đáp ứng nhu cầu phủ xanh đất trồng và cung cấp được khốilượng nguyên liệu đáng kể cho nền kinh tế và đời sống người dân (nhựa mủ,gỗ, củi,…).Reilly và Washev (1977) đã tách chồi mầm cây thông (Pinus sp.) đượctách từ hạt gieo trong ống nghiệm. Từ những năm 1970 người ta đã nuôi cấythành công mảnh lá, cuống lá, đoạn thân, rễ bạch đàn (Albert Sassons, 1988).Các nhà nghiên cứu Mỹ đã tạo được cây con từ nuôi cấy đoạn thân loàiEucalyptus grandis, E. gunni, E. danrympleama ,… vào các năm 1977, 1979.Năm 1973, Afocel đã khởi sự nghiên cứu nhân giống vô tính cây bạchđàn nhằm mục đích sản xuất lớn các dòng vô tính chịu lạnh, năng suất gỗ cao.Người ta đã tạo cây từ hạt nảy mầm trong ống nghiệm, hoặc cắt các chồi nontừ các cây chọn lọc, từ cành ghép. Từ năm 1975, cây cấy mô được bắt đầutrồng ra ngoài đất với số lượng 20.000 cây / tháng.Một số giống bạch đàn có năng suất cao, hay giá trị kinh tế về tinh dầucũng được thử nghiệm ở nhiều nước nhiệt đới: Ấn Độ, Senegal, hàng năm từmột đoạn cành có thể cho 50.000 cây con hay hơn nữa (Albert Sassons,1988).Tại hội nghị Kaset Sart (Thái Lan, 1994) cũng đã báo cáo kết quả nhângiốngthành công 55 loài tre trúc và dự định phục vụ dự án trồng rừng củaThái Lan, với sản lượng 1 triệu cây con / năm (Pranon Prutgongse, 1994).Ở Malaysia cũng đã có kết quả vi nhân giống các loài cây gỗ như Acaciamangium; Gmelia arborea (Marziah Mahmood, 1995).2.2.9.2 Tại Việt NamNuôi cấy mô – tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi21chiến tranh kết thúc (1975). Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào đầu tiênđược xây dựng tại Viện Sinh vật học, viện Khoa học Việt Nam (KHVN) doPGS.TSKH. Lê Thị Muội đứng đầu. Phòng đã nghiên cứu các phương phápnuôi cấy cơ bản trong điều kiện Việt Nam như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấymô sẹo và tế bào trần. Thành công đầu tiên về nuôi cấy bao phấn lúa và thuốclá đã được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và cs, 1978; Lê Thị Xuân vàcs.,1978). Tiếp đó là thành công về nuôi cấy tế bào trần ở thuốc lá và khoaitây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê ThịMuội, 1980, 1981). Trong cùng thời gian, tại phân viện KHVN ở Thành phốHồ Chí Minh, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, viện Khoa học Kỹ thuật Nôngnghiệp Việt Nam,... các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô-tế bào đã được thànhlập.Đến nay, trên cả nước có khoảng 40 tỉnh, thành có cơ sở nhân giốngbằng phương pháp nuôi cấy mô-tế bào thực vật. Chỉ riêng tỉnh Lâm đồng có52 cở sở, trong đó có gần 40 cơ sở là do tư nhân đầu tư; mỗi năm các cơ sởnuôi cấy mô-tế bào này đã cung cấp cho thị trường trong và ngoài nước trên20 triệu cây giống các loại. Lâm Đồng hiện là địa phương được đánh giá cóhoạt động ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô-tế bào thực vật trong nhân nhanhgiống cây trồng phát triển mạnh nhất trong cả nước.CHƯƠNG 2. MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU2.1. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài.* Mục tiêu chungXây dựng được kỹ thuật nhân giống Lõi thọ bằng phương pháp nuôicấy in vitro.* Mục tiêu cụ thể:- Nhân giống cây Lõi thọ bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro.22- Xác định được kỹ thuật huấn luyện, trồng và chăm sóc cây Lõi thọ ởvườn ươm;2.2. Đối tượng nghiên cứuVật liệu được sử dụng trong nghiên cứu này là: Quả Lõi thọ thu hái từnhững cây Lõi thọ tại khu bảo tồn thiên nhiên Phu Canh - Đà Bắc - Hòa Bình.2.3. Nội dung nghiên cứu- Xác định kỹ thuật khử trùng vật liệu và điều kiện nuôi cấy phù hợpcho tạo mẫu sạch in vitro;- Xác định công thức môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp chonhân nhanh chồi Lõi thọ in vitro.- Xác định công thức môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp tạo rễ.- Xác định kỹ thuật huấn luyện thích hợp cho cây Lõi thọ in vitro.2.4.1.Phương pháp thí nghiệm.Các thí nghiệm đều đƣợc bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại. Trong mỗi bình cấy một mẫu. Mỗi bình chứa 50ml môi trường.2.4.1.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro- Cách lấy mẫu: Chọn những hạt Lõi thọ đã qua tuyển chọn, những hạt nàyphải to, mẩy, không sâu bệnh.Bảo quản mẫu: Dùng giấy báo để bọc mẫu và đựng trong túi ni non kín tránhthoát hơi nước.Cách khử trùng mẫu:+ Khử trùng ngoài buồng cấy: Lấy mẫu ngoài thực địa về, loại l bỏ vỏ quả vàvỏ hạt, mẫu được rửa sạch đất, bụi bẩn dưới vòi nước chảy, ngâm mẫu trongnước xà phòng loãng khoảng 5-10 phút, lắc rửa mạnh cho sạch hết bụi bẩn,loại bỏ hết xà phòng và tráng bằng nước sạch nhiều lần. Sau đó mẫu được đưavào tủ cấy vô trùng để tiếp tục xử lí.23+ Khử trùng trong buồng cấy: Mẫu được rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần,sau đó rửa bằng cồn 70% trong 3 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần.Sau đó, mẫu được khử trùng bằng hai loại hóa chất là NaClO 60% và HgCl20,1% với thời gian khác nhau (Bảng 1), rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng3 lần. Mẫu được đặt lên giấy thấm vô trùng để hút khô nước rồi cấy lên môitrường MS. Sau 5-7 ngày nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 25oC, thời gian chiếusáng 12 giờ/ ngày thì mẫu cấy bắt đầu nảy mầm.Biểu 1: Các công thức khử trùng hạt Lõi thọHóa chấtHgCl20,1%Javen60%ThờiTổng sốSố mẫuTỉ lệTỉ lệThời giangianmẫu cấysạchmẫu sạchmẫu táinảy mầm(phút)357510(mẫu)(mẫu)(%)sinh (%)(ngày)15(NaClO)Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ javel và thời gian thích hợp cho việcvô trùng mẫu Lõi thọ nhằm tạo nguồn mẫu sạch ban đầu choquá trình nhân giống tiếp theo.Vật liệu thí nghiệm: Hạt Lõi thọChỉ tiêu theo dõi:- Tỷ lệ hạt nảy mầm (%): (Tổng số hạt nảy mầm / tổng số mẫu cấy)x100- Tỷ lệ hạt không nhiễm (%): (Tổng số hạt không nhiễm / tổng số mẫu cấy)x100- Tỷ lệ hạt nhiễm (%): (Tổng số hạt nhiễm / tổng số mẫu cấy)x1002.4.1.2. Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi.Sau khi khử trùng, chồi Lõi thọ được cấy vào môi trường tạo mẫu sạch đểmẫu nảy chồi. Sau đó, chồi sạch được cấy chuyển sang môi trường tạo cụm24chồi. Các chồi/cụm chồi khác nhau được sử dụng làm vật liệu để nghiên cứunhân chồi. Môi trường nhân nhanh chồi là môi trường cơ bản MS + 20 g/lsucrose + 7 g/l agar có bổ sung một số chất điều hoà sinh trưởng cần thiết. Thínghiệm được bố trí theo biểu 2 dưới đây.Biểu 2: Các công thức nhân nhanh chồi Lõi thọCTMTĐCNT1NT2NT3NT4NT5NT6NT7NT8NT9NT10NT11NT12BAP(mg/l)IBA(mg/l)00,10,30,50,71,02,000,10,30,51,00,10,30,3Môitrườngcơ bảnTỷ lệSố chồimẫu bậtTB/mẫuchồi(chồi)(%)Chiềucao chồi(cm)MSMSMSMSMSMSMSMSMSMSMSMS1MS2Mục đích thí nghiệm: Mục đích thí nghiệm: Xác định đƣợc loại môi trườngcơ bản thích hợp cho sự tăng trưởng và phát sinh cụm chồi của cây Lõithọ in vitro nhằm làm dồidào lượng mẫu và đảm bảo chất lƣợng mẫu vềkích thước cũng như khả năng tăng trưởng mạnh cho lần vi nhân giốngsau.Vật liệu thí nghiệm: Chồi Lõi thọ ở thí nghiệm phần 2.4.1.1Chỉ tiêu theo dõi:- Chiều cao chồi (cm): Đo từ mặt thạch lên đỉnh cao nhất của cụm chồi.- Số lượng chồi (chồi): Tổng số chồi/ Tổng số mẫu nuôi cấy.25- Hệ số nhân chồi: Tổng số chồi/ Mẫu cấy.2.4.1.3. Nghiên cứu kỹ thuật tạo cây hoàn chỉnhSau khi tiến hành nhân nhanh chồi, các chồi đủ tiêu chuẩn (đạt kích thước3-5cm) được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ RT (MS có bổ sung 15g/lđường và IBA với các nồng độ khác nhau). Thí nghiệm được bố trí theo biểu3 dưới đây:Biểu 3: Các công thức tạo rễ cây Lõi thọTênIBATổng số Tỷ lệ mẫuCTMT(mg/l)mẫu cấy ra rễThời gianxuất hiệnrễ (ngày)Số rễ Tb/Chiều dàicâyTb rễ (cm)TR00,030TR10,130TR20,330TR30,530TR40,7530TR51,030TR62,030Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ IBA cho quá trình tạo rễ của cây Lõithọ in vitro, nhằm chuẩn bị cây con khỏe mạnh đẻ đưa ra vườn ươm.Vật liệu thí nghiệm: Chồi tách ra từ thí nghiệm tốt nhất phần 2.4.1.2Chỉ tiêu theo dõi:- Thời gian chồi tạo rễ (ngày nuôi cấy): Tính từ lúc cây mới tạo rễ.- Số rễ/cây (rễ): Đếm tất cả rễ ở mỗi cây khi 50% số cây đã ra rễ.- Chiều dài rễ (mm): Đo chiều dài rễ sau 4 tuần nuôi cấy.2.4.1.4. Nghiên cứu kỹ thuật huấn luyện, trồng và chăm sóc cây Lõi thọ invitro ở vườn ươm.2.4.4.1 Nghiên cứu kỹ thuật huấn luyện cây Lõi thọ in vitroKhi cây trong bình đã có bộ rễ hoàn chỉnh, đem bình cây ra huấn luyệntại khu huấn luyện cây mầm theo thời gian khác nhau là 10, 15 và 20 ngày.

Tài liệu liên quan

• NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG VÀ KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ THOÁT VỊ BẸN BẰNG MỔ MỞ ĐẶT MẢNH GHÉP THEO LICHTENSTEIN TẠI CẦN THƠ
  • 117
  • 938
  • 0
• Nghiên cứu dự báo năng suất ngô, đậu tương, lạc và xây dựng quy trình giám sát khí tượng nông nghiệp cho 4 cây trồng chính (lúa, ngô, lạc, đậu tương) bằng thông tin mặt đất ở việt nam
  • 245
  • 849
  • 1
• nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tiên tiến của hà lan trong chọn, tạo, nhân giống và điều khiển ra hoa chi lilium (lily, loa kèn) ở việt nam
  • 245
  • 647
  • 1
• Báo cáo nghiên cứu khoa học " NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ CÁC CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG VI NHÂN GIỐNG CÂY HÔNG (Paulownia fortunei Hemsl.) " potx
  • 13
  • 776
  • 0
• Báo cáo nghiên cứu nông nghiệp " Nâng cao khả năng cạnh tranh trong phát triển xuất khẩu thủy sản tỉnh Cần Thơ bằng thực hiện hệ thống tiêu chuẩn quốc tế HACCP và SQF1000-2000 " potx
  • 11
  • 307
  • 0
• Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính hoa thược dược lùn bằng phương pháp giâm cành tại Việt Trì Phú Thọ
  • 42
  • 1
  • 6
• NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHỌN GIỐNG VÀ GÂY TRỒNG LOÀI LÕI THỌ (Gmelina arborea Roxb) CHO VÙNG TÂY BẮC
  • 46
  • 868
  • 2
• Nghiên cứu xác đinh hàm lương kêm trong cây mât nhân bằng phương pháp cực phổ xung vi phân
  • 42
  • 445
  • 3
• Nghiên cứu nhân giống loài cầy hương (viverriculla indica) tại thành phố sơn la
  • 38
  • 1
  • 4
• Nghiên cứu tương đương dịch thuật giữa một số bài thơ Nhật ký trong tù (Bản tiếng Việt) và bản dịch tiếng Anh tương ưng của Aileen Palmer theo quan điểm của Mona Baker (1992)
  • 12
  • 346
  • 0

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(224 KB - 31 trang) - Nghiên cứu nhân giống cây lõi thọ bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro Tải bản đầy đủ ngay ×