Xemtailieu Tải về Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của 2 chế phẩm thuốc chứa enzym
BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA 2 CHẾ PHẨM THUỐC CHỨA ENZYM Chủ nhiệm đề tài: TS. ĐOÀN CAO SƠN Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Năm 2010 MỤC LỤC PHẦN A. TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ CỦA ĐỀ TÀI ............................. 1 1. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................................ 1 2. Phương pháp đã được sử dụng để nghiên cứu............................................................ 1 3. Kết quả nghiên cứu........................................................................................................... 2 4. Kết luận rút ra từ nghiên cứu......................................................................................... 3 5.Về cải tiến kỹ thuật............................................................................................................. 5 6. Những đóng góp khác ...................................................................................................... 5 7. Tiến độ thực hiện .............................................................................................................. 6 PHẦN B. NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ................................................................................................................... 7 1. ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................... 7 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 7 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................ 9 2. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ...................................................................... 9 2.1. Enzym bromelain................................................................................................. 9 2.1.1. Cấu trúc và tính chất của enzym bromelain ........................................ 9 2.1.2. Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học....................................... 10 2.1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym bromelain ............. 13 2.2. Enzym Trypsin................................................................................................... 13 2.2.1. Cấu trúc và tính chất của enzym trypsin ............................................ 13 2.2.2. Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học........................................ 14 2.2.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym trypsin................... 18 2.3. Enzym streptokinase.......................................................................................... 18 2.3.1. Cấu trúc và tính chất của enzym streptokinase .................................. 18 2.3.2. Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học của enzym streptokinase 19 2.3.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym streptokinase ......... 22 2.4. Enzym Streptodornase ...................................................................................... 23 2.4.1. Cấu trúc và tính chất của enzym streptodornase ............................... 23 2.4.2. Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học của enzym streptodornase ... 24 2.4.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym streptodornase....... 25 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................26 3.1. Hóa chất, chất chuẩn, mẫu nghiên cứu............................................................ 26 3.1.1. Chất chuẩn.......................................................................................... 26 3.1.2. Dung môi, hóa chất: ........................................................................... 26 3.1.3. Mẫu dùng để nghiên cứu xây dựng và thẩm định các quy trình ........ 27 3.2. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................ 27 3.3. Phương pháp ...................................................................................................... 28 3.3.1. Bromelain............................................................................................ 28 3.3.2. Trypsin ................................................................................................ 28 3.3.3. Streptokinase....................................................................................... 29 3.3.4. Streptodornase .................................................................................... 29 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..........................................................................................30 4.1. Xây dựng và thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzym của chế phẩm thuốc chứa bromelain và trypsin............................................................................. 30 4.1.1. Xây dựng quy trình xác định hoạt tính của bromelain và trypsin .... 30 4.1.2. Thẩm định phươn g pháp xác định hoạt tính enzym trong chế phẩm thuốc chứa bromelain và trypsin .................................................................. 34 4.2. Xây dựng và thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzym của chế phẩm thuốc chứa streptokinase và streptodornase .......................................................... 43 4.2.1. Xây dựng quy trình xác định hoạt tính của streptokinase và streptodornase .............................................................................................. 43 4.2.2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng để xác định hoạt tính enzym trong chế phẩm thuốc chứa streptokinase và streptodornase ..................... 50 4.3. Áp dụng các quy trình đã xây dựng để kiểm tra chất lượng của một số chế phẩm trên thị trường ................................................................................................ 67 4.3.1. Kiểm tra chất lượng một số chế phẩm chứa bromelain và trypsin .... 67 4.3.2. Kiểm tra chất lượng một số chế phẩm chứa Streptokinase và Streptodornase............................................................................................... 68 4.4. Bàn luận về ý nghĩa thực tiễn của đề tài .......................................................... 69 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................70 5.1. Kết luận............................................................................................................... 70 5.2. Kiến nghị............................................................................................................. 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................72 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của L-cystein đến khả năng xác định hoạt tính của bromelain................................................................................................................32 Bảng 2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Tyrosin..............34 Bảng 3: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Bromelain.........35 Bảng 4: Khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Bromelain .............................36 Bảng 5: Khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Bromelain...............................37 Bảng 6: Khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp định lượng Bromelain .........................38 Bảng 7: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Trypsin..............39 Bảng 8: Khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Trypsin trên viên Brolasin...40 Bảng 9: Khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Trypsin trên viên Kimoral-S41 Bảng 10: Khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Trypsin..................................41 Bảng 11: Khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp định lượng Trypsin............................42 Bảng 12: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptokinase bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose...............50 Bảng 13: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptokinase bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose...............51 Bảng 14: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptokinase bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose...............52 Bảng 15: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng streptokinase bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose ........................53 Bảng 16: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Streptokinase bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose ........................54 Bảng 17: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng Streptokinase bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông .....................55 Bảng 18: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Streptokinase bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông .............................................56 Bảng 19: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Streptokinase bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông......................................................57 Bảng 20: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Streptokinase bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông.......................................................58 Bảng 21: Kết quả định lượng Streptokinase của 1 số chế phẩm trên thị trường.............59 Bảng 22: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptodornase 60 Bảng 23: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng streptodornase....................................61 Bảng 24: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng streptodornase.......62 Bảng 25: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng streptodornase......................................63 Bảng 26: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng streptodornase.........64 Bảng 27: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn 1 trong thử nghiệm khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng streptodornase.......................65 Bảng 28: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn 2 trong thử nghiệm khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng streptodornase........................66 Bảng 29: Hàm lượng bromelain và trypsin trong một số chế phẩm ..............................67 Bảng 30: Hàm lượng streptokinase và streptodornase trong một số chế phẩm .............68 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ trong định lượng Tyrosin....................................................................................................................34 Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ trong định lượng Bromelain...............................................................................................................35 Hình 3: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và chênh lệch độ hấp thụ trong định lượng Trypsin................................................................................................40 Hình 4: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit của nồng độ và logarit của đường kính vòng ly giải....................................................................................................51 Hình 5: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit của nồng độ và logarit của đường kính vòng ly giải....................................................................................................52 Hình 6: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit của nồng độ và logarit của đường kính vòng ly giải....................................................................................................53 Hình 7: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit nồng độ và logarit thời gian ly giải khối đông trong định lượng streptokinase ..........................................................55 Hình 8: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit nồng độ và logarit thời gian ly giải khối đông trong định lượng Streptokinase..........................................................56 Hình 9: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và hệ số giảm độ nhớt trong định lượng streptodornase ....................................................................................60 Hình 10: Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn độ giảm độ nhớt theo thời gian của dung dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng streptodornase........................................................................................................61 Hình 11: Đường tuyến tính biểu diễn giảm độ nhớt theo thời gian của dung dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng streptodornase ......................................................................................................63 Hình 12: Đường tuyến tính biểu diễn giảm độ nhớt theo thời gian của dung dịch chuẩn 2 trong thử nghiệm khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng streptodornase........................................................................................................66 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT KDa : Kilo Dalton SK : Streptokinase Arg : Arginin Val : Valin Asp : Asparagin Lys : Lysin Leu : Leucin Plgn : Plasminogen Pm : Plasmin RSD TB : Độ lệch chuẩn tương đối : Trung bình PHẦN A. TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ CỦA ĐỀ TÀI 1. Mục đích nghiên cứu: - Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của các enzym: Bromelain, Trypsin, Streptokinase và Streptodornase trong chế phẩm hỗn hợp chứa 2 enzym Bromelain, Trypsin và chế phẩm hỗn hợp Streptokinase, Streptodornase. - Áp dụng phương pháp xác đinh hoạt tính của các enzym Bromelain, Trypsin, Streptokinase và Streptodornase để kiểm tra chất lượng một số thuốc lưu hành trên thị trường và thẩm định, xét duyệt tiêu chuẩn. 2. Phương pháp đã được sử dụng để nghiên cứu: Đề tài Khoa học - Công nghệ “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của 2 chế phẩm thuốc chứa enzym” là nghiên cứu đầu tiên được thực hiện một cách có hệ thống để thiết lập các quy trình xác định hoạt tính của 4 enzym trong các chế phẩm chứa hỗn hợp các enzym. Những kết quả nghiên cứu của đề tài có ý nghĩa thực tiễn cao. Các quy trình xác định hoạt tính được thiết lập trong đề tài này đã được thẩm định chu đáo để chứng minh về sự phù hợp, độ tin cậy khi áp dụng xác định hoạt tính từng thành phần enzyme trong chế phẩm thuốc chứa hỗn hợp 2 enzym, góp phần nâng cao khả năng kỹ thuật của hệ thống kiểm nghiệm giám sát chất lượng thuốc. Các phương pháp định lượng được xây dựng hướng tới phù hợp về mặt kỹ thuật với điều kiện trang thiết bị hiện tại của Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương và các cơ sở thuộc hệ thống kiểm nghiệm thuốc nói chung. Trong một số trường hợp, do chưa có phương pháp phù hợp, sau quá trình khảo sát sơ bộ, nhóm nghiên cứu đã phải tiến hành cải tiến các điều kiện phân tích cho phù hợp với đối tượng mẫu thuốc cần kiểm tra cũng như điều kiện trang thiết bị hiện có. Cụ thể, trong số 4 phương pháp xác định hoạt tính của 4 enzym thì chỉ có 2 phương pháp xác định hoạt tính của 2 enzym là Streptokinase (BP và CP) và Trypsin (USP) là có sẵn trong các dược điển ở chuyên luận thuộc về các nguyên liệu. Còn phương pháp xác định hoạt tính của Bromelain chưa có trong dược điển 1 và Streptodornase chỉ có trong chuyên luận Streptokinase nguyên liệu và giới hạn Streptodornase, vì vậy nhóm nghiên cứu đã thực hiện các bước sau: 1- Tham khảo các tài liệu để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzym Bromelain trong chế phẩm chứa hỗn hợp Bromelain và Trypsin. 2- Tham khảo tài liệu USP để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Trypsin trong chế phẩm chứa hỗn hợp Bromelain và Trypsin. 3- Tham khảo tài liệu BP 2003 và CP 2005 và các nguồn tài liệu khác để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzym Streptokinase trong chế phẩm chứa hỗn hợp Streptokinase và Streptodornase. 4- Tham khảo các tài liệu hiện có để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzym Streptodornase trong chế phẩm chứa hỗn hợp Streptokinase và Streptodornase. 5- Áp dụng 2 phương pháp xác định hoạt tính của 2 enzym Bromelain và Trypsin đã xây dựng để kiểm tra chất lượng các chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này có trên thị trường. 6- Áp dụng 2 phương pháp xác định hoạt tính của 2 enzym Streptokinase và Streptodornase đã xây dựng để kiểm tra chất lượng các chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này có trên thị trường. 3. Kết quả nghiên cứu: - Đã thiết lập được 4 quy trình xác định hoạt tính của 4 enzym để định lượng hoạt tính của các enzym trong 2 chế phẩm hỗn hợp là chế phẩm chứa hỗn hợp gồm 2 enzym Bromelain và Trypsin và chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym Streptokinase và Streptodornase đạt các yêu cầu: • Khoảng tuyến tính và hệ số tương quan. • Độ lặp lại và độ đúng đạt yêu cầu. • Phù hợp với điều kiện trang thiết bị, hóa chất của Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương.. - Đã thiết lập báo cáo kết quả xác định hoạt tính của enzym Bromelain và Trypsin của 09 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này. 2 - Đã thiết lập báo cáo kết quả xác định hoạt tính của enzym Streptokinase và Streptodornase của 09 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này. .- Đã hoàn thiện được nội dung 4 bài báo khoa học, trong đó: 1/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Bromelain trong chế phẩm hỗn hợp chứa Bromelain và trypsin. (Đã được đăng tạp chí Kiểm nghiệm số 2/2010). 2/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính enzym Streptokinase trong chế phẩm hỗn hợp chứa Streptokinase và Streptodornase bằng phương pháp đo vòng ly giải. (Đã được đăng tạp chí Kiểm nghiệm số 3/2010). 2 bài báo còn lại đã được chuẩn bị hoàn tất về nội dung, nhóm nghiên cứu sẽ gửi đăng vào tháng 10/2010, cụ thể gồm các bài báo sau đây: 3/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Trypsin trong chế phẩm hỗn hợp chứa Bromelain và trypsin. 4/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Streptodornase trong chế phẩm hỗn hợp chứa Streptokinase và Streptodornase. 4. Kết luận rút ra từ nghiên cứu: - 4 quy trình định lượng xác định hoạt tính của 4 enzym Bromelain, Trypsin, Streptokinase và Streptodornase trong 2 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym đã được xây dựng, thẩm định dựa trên đối tượng nghiên cứu là các sản phẩm đang lưu hành trên thị trường Việt Nam. Những quy trình này đã được chứng minh tính khả thi trong điều kiện cơ sở vật chất của nước ta, trên đúng đối tượng áp dụng là các chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym, do đó đây là những giải pháp kỹ thuật có ý nghĩa ứng dụng thực tiễn cao trong kiểm tra giám sát chất lượng thuốc chứa các hoạt chất enzym tại Việt Nam. - Trong quá trình thực hiện đề tài, qua những kết quả thực nghiệm, chúng tôi có một số nhận xét về tính mới sau: a) Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzyme Bromelain trong chế phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Bromelain và trypsin: - Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp với phương pháp quang phổ UV-VIS. 3 - Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym trypsin đến phương pháp xác định hoạt tính của bromelain trong chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này. Kết quả trypsin không ảnh hưởng đến phương pháp xác định hoạt tính của bromelain. b) Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzym Trypsin trong chế phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Bromelain và trypsin: - Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp với phương pháp đo quang động học. - Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym bromelain đến phương pháp xác định hoạt tính của trypsin trong chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này. Kết quả bromelain không ảnh hưởng đến phương pháp xác định hoạt tính của trypsin. c) Xây dựng phương p háp xác định hoạt tính của enzyme Streptokinase trong chế phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Streptokinase và streptodornase: - Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp với phương pháp đo thời gian ly giải khối đông và phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose. - Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym streptodornase đến phương pháp xác định hoạt tính của streptokinase trong chế phẩm hỗn hợp chứa hỗn hợp 2 enzyme này. Kết quả streptodornase không ảnh hưởng đến phương pháp xác định hoạt tính của streptokinase. d) Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzyme Streptodornase trong chế phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Streptokinase và streptodornase: - Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp với phương pháp đo thời gian giảm độ nhớt của dung dịch cơ chất AND. - Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym streptokinase đến phương pháp xác định hoạt tính của streptodornase trong chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzyme này. Kết quả streptokinase không ảnh hưởng đến phương pháp xác định hoạt tính của streptodornase trên cơ chất ADN. 4 5.Về cải tiến kỹ thuật: - Cách xác định điểm dừng của phản ứng tiêu fibrin thực nghiệm (trong phương pháp xác định hoạt tính Streptokinase): Theo dược diển Anh 2003: phương pháp xác định điểm dừng quan sát bằng mắt, sử dụng đồng hồ bấm giây. Trên thực tế điểm dừng rất khó quan sát. Theo dược diển Mỹ (chuyên luận ly giải fibrin của Alteplase bằng cách xác định bọt khí) thì cũng rất khó giam giữ bọt khí đồng đều trong các ống nghiệm, hơn nữa trong quá trình tạo bọt khí có ảnh hưởng lớn đến sự tạo fibrin nên kết quả không ổn định. Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã cải tiến cách xác định điểm ly giải hoàn toàn fibrin bằng quan sát sự rơi cận đáy của viên bi chuẩn cho phép xác định chính xác điểm dừng có độ đúng cao và dễ quan sát. - Phương pháp xác định hoạt tính Streptodornase: Sử dụng nhớt kế Oswald với mao quản thích hợp thay vì thiết bị xác định độ nhớt bằng điện cực Platin có gắn bơm chân không. Vì thiết bị này chưa có tại Việt Nam và rất đắt tiền, còn nhớt kế Oswald hiện có tại Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương. 6. Những đóng góp khác: a) Góp phần đánh giá chất lượng thuốc: Các thuốc có bản chất là enzym rất đễ bị thay đổi về mặt chất lượng. Hơn nữa các phương pháp xác định hoạt tính các enzym rất đa dạng, cách biểu thị hoạt tính enzyme tùy thuộc vào từng cơ sở sản xuất (có thể xác định theo IU hoặc mg hoặc các đơn vị khác theo qui định). Vì vậy để xây dựng được một phương pháp xác định hoạt tính của mỗi enzym sẽ góp phần nâng cao năng lực đánh giá chất lượng của nhóm hoạt chất "khó tính" này, đặc biệt là trên đối tượng chế phẩm phối hợp các enzym hiện đang lưu hành trên thị trường. b) Đào tạo: - Qua quá trình thực hiện đề tài, năng lực kiểm nghiệm, đặc biệt là kiểm nghiệm enzym của các cán bộ tham gia nghiên cứu được cập nhật và nâng cao. Góp phần đào tạo các cán bộ thử việc. - Trong quá trình thực hiện đề tài, nhóm nghiên cứu đã kết hợp chặt chẽ với trường Đại học Dược Hà Nội để gắn kết công tác nghiên cứu với đào tạo nhân lực cho ngành Dược. Trong khuôn khổ đề tài, các kết quả nghiên cứu thu được đã đăng ký luận án tốt nghiệp thạc sĩ dược học. 5 7. Tiến độ thực hiện: a. Tiến độ: • Đúng tiến độ X • Rút ngắn thời gian nghiên cứu Tổng số thời gian rút ngắn….tháng • Kéo dài thời gian nghiên cứu Tổng số tháng kéo dài….tháng Lý do phải kéo dài… b. Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đề ra: X • Thực hiện đầy đủ các mục tiêu đề ra • Thực hiện các mục tiêu đề ra nhưng không hoàn chỉnh • Chỉ thực hiện được một số mục tiêu đề ra • Những mục tiêu không thực hiện được (ghi rõ) c. Các sản phẩn tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương: • Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cương X • Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong đề cương X • Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng chất lượng có sản phẩm chưa đạt • Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng tất cả các sản phẩm đều chưa đạt chất lượng. • Tạo ra được một số sản phẩm đạt chất lượng • Những sản phẩm chưa thực hiện được (ghi rõ) d. Đánh giá việc sử dụng kinh phí: Tổng kinh phí thực hiện để tài: 450 triệu đồng. Trong đó Kinh phí sự nghiệp khoa học: 450 triệu đồng. Kinh phí từ nguồn khác: 0 triệu đồng. Trang thiết bị đã được đầu tư từ nguồn kinh phí của đề tài (chi phí những trang thiết bị có giá trị trên 3000 USD): Không Toàn bộ kinh phí đã được thanh quyết toán Chưa thanh quyết toán xong: Không Kinh phí tồn đọng: Không 6 PHẦN B. NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Enzym là chất xúc tác sinh học, có vai trò quan trọng trong hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống. Trong khoảng 20 năm trở lại đây, enzym đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực như trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y tế chăn nuôi, ... Hiện nay ước tính mỗi năm có khoảng 300 000 tấn enzym được sản xuất với giá trị thương mại khoảng 1 tỷ USD, trong số đó chủ yếu là các enzym thủy phân, chiếm tới 75%. Trong lĩnh vực y tế, các thuốc có bản chất là enzym cũng đã và đang được nghiên cứu đầy đủ hơn về cấu trúc, cơ chế tác dụng, và những ứng dụng lâm sàng. Một số thuốc enzym như các thuốc có chứa trypsin, chymotrypsin, bromelain, Papain, amylase, Streptokinase, Serratiopeptidase... được sử dụng như là thuốc hỗ trợ trong điều trị một số bệnh liên quan và đã chứng minh được hiệu quả điều trị của chúng như trong điều trị kháng viêm, chống phù nề trong ngọai khoa, trong điều trị nhồi máu cơ tim, viêm tắc mạnh do huyết khối, hỗ trợ trong điều trị ung thư, sử dụng phối hợp nhằm làm tăng hiệu quả kháng khuẩn của thuốc kháng sinh. Chính nhờ các hiệu quả điều trị như vậy, nhiều chế phẩm thuốc chứa enzym đã được cấp số đăng ký cho phép lưu hành tại Việt nam. Trước đây trên thị trường Việt Nam chỉ có các chế phẩm sử dụng đơn thành phần streptokinase trong điều trị và chuyên luận streptokinase đã được đưa vào Dược thư quốc gia. Hiện nay, để tăng hiệu quả điều trị, các chế phẩm thuốc chứa đồng thời 2 enzym streptokinase và streptodornase đã được nhập vào nước ta trong những năm gần đây để điều trị chống viêm nói chung và đặc biệt trong hỗ trợ điều trị nhồi máu cơ tim, viêm tắc huyết khối. Chế phẩm hỗn hợp trypsin và bromelain được sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa, hỗ trợ điều trị ung thư... 7 Về phương pháp kiểm nghiệm các enzym này, trong các dược điển mới chỉ có Dược điển Anh quy định chuyên luận nguyên liệu Streptokinase, chưa có chuyên luận của streptodornase nguyên liệu và các dạng chế phẩm, đặc biệt là chế phẩm phối hợp gồm streptokinase và streptodornase. Đối với enzym bromelain và trypsin, trong Dược điển Anh và Dược điển Mỹ mới có chuyên luận nguyên liệu Trypsin, chưa có chuyên luận về chế phẩm. Các tiêu chuẩn chất lượng của các chế phẩm hiện có trên thị trường vẫn chưa được thẩm định, đánh giá một cách đầy đủ. Đặc biệt là tiêu chuẩn của chế phẩm hỗn hợp Streptokinase và streptodornase do các nhà sản xuất cung cấp vẫn chưa thực hiện được với điều kiện của các cơ sở kiểm nghiệm trong nước do không có trang thiết bị chuyên dụng. Từ các lý do trên, việc đánh giá chất lượng của các chế phẩm này hiện nay vẫn còn hạn chế, và thực tế là chưa kiểm tra chất lượng các chế phẩm hỗn hợp Streptokinase và streptodornase. Trong khi đó enzym được coi là loại thuốc sinh học, có bản chất protein nên rất dễ bị giảm hoạt tính trong các điều kiện bảo quản không tốt hoặc bị thoái biến theo thời gian nên không có tác dụng điều trị. Để thực hiện nhiệm vụ này đòi hỏi phải có sự đầu tư nghiên cứu để xây dựng các phương pháp xác định họat tính của các chế phẩm enzym nhằm áp dụng cho công tác kiểm tra chất lượng thuốc trong điều kiện hiện có của hệ thống kiểm nghiệm. Trong thời gian gần đây, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương đã tiến hành nghiên cứu và xây dựng được một số phương pháp, quy trình kiểm tra chất lượng của một số dạng chế phẩm enzym. Tuy nhiên, do điều kiện kinh phí hạn hẹp, việc nghiên cứu chỉ mới dừng lại ở một số chế phẩm enzym đơn thành phẩn và đơn giản. Chính vì vậy, việc nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của 2 chế phẩm thuốc chứa enzym” là thực sự cần thiết và hữu ích nhằm nâng cao năng lực kiểm tra, giám sát chất lượng đối với các sản phẩm thuốc có nguồn gốc sinh học với điều kiện trang thiết bị hiện có của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và các Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm trên toàn 8 quốc, đồng thời hỗ trợ cho các phòng kiểm nghiệm của các công ty sản xuất thuốc trong nuớc trong việc kiểm tra chất lượng các dạng thành phẩm này, góp phần kiểm soát chất lượng thuốc trên thị trường. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Đề tài được thực hiện theo 3 mục tiêu chính sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hoạt tính của chế phẩm kết hợp 2 enzym bromelain và trypsin. 2. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hoạt tính của chế phẩm kết hợp 2 enzym streptokinase và streptodornase. 3. Áp dụng các phương pháp để kiểm tra chất lượng một số chế phẩm tương tự lưu hành trên thị trường. 2. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 2.1. Enzym bromelain 2.1.1. Cấu trúc và tính chất của enzym bromelain Enzym bromelain lần đầu tiên được phát hiện bởi nhà hóa học người Venezuela Viente Marcane vào năm 1891 từ nước ép của quả dứa [18]. Năm 1982, Chitenden, cộng tác với Joslin và Meara đã đi sâu nghiên cứu đầy đủ hơn và gọi dịch chiết xuất đó là Bromelain. Sau đó, thuật ngữ Bromelain được dùng để chỉ các enzym protease từ các thân và quả của họ dứa Bromeliaseae. Bromelain được chỉ định là thuốc hỗ trợ điều trị một số bệnh vào năm 1957. Những nghiên cứu về Bromelain lần đầu tiên được tiến hành ở Hawai, nhưng hiện nay, các nước châu Á, châu Âu và Châu Mỹ la tinh quan tâm đến nghiên cứu Bromelain nhiều hơn, đặc biệt là ở Đức, Bromelain được sử dụng rộng rãi, đứng thứ 13 trong số các thảo dược. Năm 1964 Murachi và cộng sự đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzym Bromelain, kết quả như sau [1]: . Trọng lượng phân tử: 33200 - 33500 Dalton . Hằng số lắng: 2,73 S . Tỷ trọng: 1,346 . Điểm đẳng điện pI: 9,55 9 Bromelain là enzym thuộc nhóm enzyme thiol (Cystein) protease, có khả năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein thành các đoạn nhỏ. Thành phần hóa học của Bromelain là một glycoprotein. Mỗi phân tử có chứa 1 chuỗi oligosaccharid (glycan) gồm 3 manose, 2 glucosamin, 1 xylose và 1 fructose. Tùy theo phương pháp thu nhận mà thành phần acid amin thay đổi khác nhau, trong khoảng 121 - 144 acid amin. Hơn nữa, Bromelain trong các bộ phận khác nhau của cây dứa cũng có thành phần hóa học khác nhau như polypeptid của Bromelain thân có acid amin (đầu -NH2) là valin hoặc glycine, còn Bromelain quả lại có acid amin (đầu -NH2) là alanine [11]. Hoạt tính của Bromelain biểu thị khác nhau trên những cơ chất khác nhau. So với protease thực vật khác như papain cho thấy: khả năng phân giải hemoglobin của Bromelain mạnh gấp 4 lần so với papain, nhưng nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của 2 enzym này tương đương nhau, còn đối với cơ chất tổng hợp thì hoạt tính của bromelain lại kém hơn. Bromelain có khả năng thủy phân protein, peptid, amid và các ester của amid và peptid [1]. 2.1.2. Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học Cơ chế tác động của enzym bromelain đã được làm sáng tỏ: các tác giả đều thừa nhận vai trò của nhóm -SH của cystein và nhóm imidazol trong hoạt động thủy phân của bromelain. Nhóm -SH tham gia tạo thành acyl-thioester trong gốc carboxyl của cơ chất (nơi các liên kết bị cắt). Nhóm Imidazol làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của chất nhận, giữ vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain. Cụ thể, khi dùng casein hoặc hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên, trước tiên bromelain kết hợp với protein và thủy phân chúng để tạo thành các oligopeptid và acid amin. Tiếp theo nhóm -SH của enzym khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazol sẽ khử ester để giải phóng enzym (Hình 1) 10 Hình 1: Sơ đồ cơ chế xúc tác của enzym Bromelain Cũng giống như các loại chất sinh học khác, Bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nhiệt độ, pH, ion kim loại ...Ở điều kiện bảo quản 40C, hoạt tính sinh học của Bromelain không bị giảm trong khoảng 6 tháng, nhưng nếu ở 550C, pH 6,0 thì hoạt tính có thể bị giảm tới 50% trong vòng 20 phút. Biên độ pH của Bromelain khá rộng từ 3-10, nhưng pH tối ưu thường nằm trong khoảng 5-9. Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của Bromelain là do thường gắn vào trung tâm hoạt động của enzym. Bromelain bị ức chế bởi các ion hoặc những hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm -SH như iodoacetat, methyl bromid, clo acetophenol, Hg 2+ , H2O2. Trong khi đó, một số ion kim loại như Zn2+, Fe2+, Ag+, ... lại làm ổn định cấu trúc phân tử của Bromelain. Hiện nay, bromelain được sản xuất bằng cách tinh chế từ hỗn hợp chiết xuất trực tiếp từ cây dứa và thành phẩm tạo ra ở dạng viên nang hoặc viên nén, được dùng trong điều trị. Ngoài tác dụng tham gia vào quá trình đồng hóa protein trong thức ăn, Bromelain còn có nhiều tác dụng khác ở ngoài đường tiêu hóa. Trên thực 11 tế, Bromelain được biết đến như là một thuốc kháng viêm tự nhiên và được ứng dụng ngày càng nhiều trong điều trị như là một thuốc hỗ trợ: . Trong phẫu thuật hoặc tổn thương: Bromelain hỗ trợ làm giảm sưng, các vết thâm tím, viêm hoặc đau sau phẫu thuật hoặc thương tổn, đặc biệt trường hợp bị bỏng, bromelain giúp mau chóng lành vết thương. . Trong điều trị viêm xoang: Bromelain được khuyến cáo như là thuốc điều trị hỗ trợ cho viêm xoang, làm giảm sự xung huyết, gây dễ thở và ức chế ho, làm giảm các triệu chứng viêm xoang. Nó là 1 trong những thuốc hỗ trợ điều trị thịnh hành ở Đức, được Hội đồng Điều trị của Đức chỉ định trong điều trị viêm sưng ở mũi và xoang mũi do phẫu thuật hoặc do tổn thương từ năm 1993 [5]. . Trong tiêu hóa : Bromelain là thuốc hỗ trợ giúp tiêu hóa tự nhiên là do có khả năng tiêu hủy protein, được dùng trong các trường hợp có các hội chứng sưng, sinh hơi và hội chứng dạ dày bị kích thích. Bromelain được sử dụng ở dạng đơn thành phần hoặc phối hợp với các enzym khác như với Lipase (enzym tiêu hủy chất béo), với amylase (enzym tiêu hủy tinh bột) hoặc với trypsin (enzym tiêu hủy protein). Tuy nhiên hiện nay các nghiên cứu về tính an toàn và hiệu quả của Bromelain trong điều trị các bệnh về đường tiêu hóa vẫn đang được tiếp tục. . Trong điều trị viêm xương khớp: Bromelain có tác dụng trợ giúp làm giảm đau khi bị viêm khớp xương, nhưng chưa được nghiên cứu lâm sàng trên phạm vi lớn để đánh giá tính hiệu quả. . Trong điều trị ung thư: Bromelain và nhóm enzym protease cũng được dùng như là thuốc hỗ trợ điều trị ung thư trong 1 số nghiên cứu lâm sàng trên trên bệnh nhân ung thư: Bromelain tác dụng như một yếu tố điều hòa miễn dịch bằng cách làm tăng khả năng gây độc tế bào của các tế bào đơn nhân để kháng lại các tế bào ung thư của bệnh nhân và bằng cách kích thích tổng hợp các cytokin như yếu tố gây hoại tử khối u (Tumor 12 necrosis factor-a), interleukin -1β, interleukin-6 và Interleukin-8. Một số nghiên cứu trên động vật thí nghiệm đã thu được kết quả khả quan về hiệu quả ngăn ngừa các tế bào ung thư di căn khi phối hợp bromelain với dược chất nghiên cứu có hoạt tính diệt tế bào ung thư [18]. 2.1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym bromelain Hoạt tính của enzym Bromelain được xác định dựa trên khả năng thủy phân các cơ chất khác nhau, cụ thể như sau: . Thủy phân cơ chất là casein: tạo ra sản phẩm là tyrosin. Định lượng tyrosin bằng phương pháp quang phổ UV-VIS. Hoạt tính được xác định theo lượng tyrosin: 1 đơn vị bromelain là lượng enzym có khả năng thủy phân casein để giải phóng 1 mcg tyrosin trong 1 phút trong điều kiện nhất định [3, 4]. . Thủy phân cơ chất là gelatin: tạo ra sản phẩm là acid amin. Định lượng acid amin bằng phương pháp chuẩn độ acid kiềm [7]. . Thủy phân cơ chất Nα- carbobenzoxy-L-lysin p-nitrophenyl ester: tạo ra sản phẩm p-nitrophenol, làm thay đổi giá trị độ hấp thụ quang của dung dịch theo thời gian. Hoạt tính của bromelain được xác định dựa theo lượng p-nitrophenol tạo thành. . Thủy phân các protein có trong hỗn dịch sữa làm đông vón hỗn dịch sữa. Hoạt tính của bromelain được xác định bằng cách so sánh thời gian đông vón sữa với chất chuẩn đã biết hoạt tính. 2.2. Enzym Trypsin 2.2.1. Cấu trúc và tính chất của enzym trypsin Enzym trypsin có mặt trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật có xương sống, có khả năng thủy phân protein. Trypsin được sản xuất tại tuyến tụy dưới dạng tiền enzym là trypsinogen với trọng lượng phân tử là 34 Kdalton, sau khi cắt chuỗi gồm 6 acid amin ở đầu N tạo thành trypsin hoạt động có trọng lượng phân tử 23,8 KDalton. Phân tử trypsin là 1 chuỗi peptid đơn có khoảng 223 acid amin [26]. 13 Tải về bản full