Phân Lập, Tuyển Chọn Và Nghiên Cứu Các đặc Tính Tăng Trưởng, Cố ...

 Đặt vấn đề MỞ ĐẦU Trong khí quyển, nitơ chiếm gần 80% thể tích, tuy nhiên chúng tồn tại ở dạng khí N với liên kết cộng hóa trị rất bền vững (N≡N), thực vật không thể sử dụng trực tiếp được. Để sử dụng được nguồn đạm dồi dào này thì cần phải phá vỡ liên kết bền vững trong phân tử N 2 , tạo ra các loại đạm mà cây trồng có thể hấp thu được. Trong công nghiệp sản xuất phân bón hóa học, để phá vỡ liên kết này người ta thực 2 hiện các phản ứng hóa học dưới điều kiện nhiệt độ, áp suất rất cao và có sự tham gia của nhiều chất xúc tác, do dó, việc sản xuất phân bón bằng phương pháp này sẽ gây tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của con người. Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học trong nông nghiệp, thì việc nghiên cứu và tìm ra cách chuyển hóa để biến nguồn đạm dồi dào từ trong khí quyển vào trong đất mà không tác động đến môi trường và sức khỏe con người đã được nghiên cứu. Một trong những hướng quan trọng và hiệu quả là việc sử dụng vi sinh vật có khả năng cố định đạm nhờ hệ enzyme nitrogenase. Azotobacter là giống vi sinh vật cố định đạm tự do có khả năng làm giàu nguồn đạm trong đất - nguồn đạm cây trồng sử dụng được. Chúng có khả năng này là nhờ quá trình cố định nitơ sinh học, quá trình khử N 2 trong không khí thành NH dưới tác dụng của enzyme nitrogenase. Ngoài ra chúng còn kích thích hấp thu các chất dinh dưỡng khoáng của thực vật (NO 3 - , PO 4 3- , K + , Fe 2+ ), sản sinh ra các chất có khả năng điều hòa sinh trưởng ở thực vật (indole 3-acetic acid, indole- lactic acid…). Loài vi sinh vật trên phân bố rộng rãi trong đất và nước nhưng sự phân bố trên không đồng đều và số lượng hiện diện quá ít không đem lại hiệu quả cao. Do đó, việc phân lập, tuyển chọn chủng giống có hoạt tính cố định đạm cao để bổ sung vào đất trồng trọt là một trong những khâu quan trọng nhằm nâng cao năng suất cây trồng. Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng, cố định đạm của vi khuẩn Azoterbacter – Thử nghiệm trên cây trồng”.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lời cảm ơn

Trong khoảng thời gian hơn một năm làm luận văn tốt nghiệp, ngoài những nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía các thầy cô trong Khoa Sinh học, các thầy cô trong bộ môn Sinh hóa và quý công ty TNHH Gia Tường, giờ đây tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp với rất nhiều cảm xúc khác nhau Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:

Quý thầy cô trong Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh hóa đã nhiệt tình giảng dậy, truyền đạt cho em kiến thức, kinh nghiệm nghiên cứu khoa học, là chìa khóa giúp em trong việc hoàn thành đề tài nghiên cứu tốt nghiệp

PGS TS Phạm Thị Ánh Hồng, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và định hướng cho em trong suốt thời gian em thực hiện đề tài tốt nghiêp

ThS Nguyễn Như Nhứt, Trưởng chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường – Bình Dương, người luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Cảm ơn các anh chị và các bạn trong Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi sớm hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Con xin tỏ lòng thành kính, biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ và gia đình luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để con được học hành và là điểm tựa vững chắc cho con vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống

Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 7 năm 2011

Đỗ Hoành Quân

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

IAA Indol acetic acid

ATP Adenosin triphosphate

ADP Adenosin diphosphate

rH2 Lưu lượng khí hydrogen

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Các con đường cung cấp đạm cho đất trong chu trình chuyển hóa nitơ 4

Bảng 1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số loài thuộc chi Azotobacter 11

Bảng 3.3 Giá trị pH của các mẫu đất 44

Bảng 3.4 Đặc điểm và hình dạng khuẩn lạc của các chủng phân lập được 45

Bảng 3.5 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của 20 chủng phân lập 51

Bảng 3.6 Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của 20 chủng Azotobacter phân lập trên môi trường Ashby 52

Bảng 3.7 Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 59

Bảng 3.8 Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 cố định được trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 61

Bảng 3.9 Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau 62

Bảng 3.10 Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 cố định được khi nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau 63

Bảng 3.11 Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên các loại đường với các nồng độ khác nhau 65

Bảng 3.12 Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên các loại đường với các nồng độ khác nhau 68

Bảng 3.13 Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên môi trường cố bổ sung ion Mn2+ và ion Cu2+ ở các nồng độ khác nhau 70

Bảng 3.14 Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên môi trường cố bổ sung ion Mn2+ và ion Cu2+ ở các nồng độ khác nhau 71

Bảng 3.15 Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy ở tốc độ lắc khác nhau 74

Bảng 3.16 Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy ở tốc độ lắc khác nhau 75

Bảng 3.17 Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi

cấy trong môi trường có các nguồn đạm khác nhau 77 Bảng 3.18 Hàm lượng nitơ cố định được (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07

khi nuôi cấy trong môi trường có các nguồn đạm khác nhau 79 Bảng 3.19 Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 tại

các thời điểm nuôi cấy khác nhau 81 Bảng 3.20 Hàm lượng nitơ tổng cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07

tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau 82 Bảng 3.21 Hàm lượng nitơ cố định được và sự tồn tại của các

chủng Azotobacter trong đất sau 45 ngày 84

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của hỗn hợp hai chủng Az 03 và Az 07

lên sự phát triển của cây cải xanh 85

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ

Biểu đồ 3.1 Hàm lượng nitơ tổng của 20 chủng Azotobacter

cố định được trên môi trường Ashby 53 Biểu đồ 3.2 Khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 và Az 07

trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 60 Biểu đồ 3.3 Khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 và Az 07

trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 61

Đồ thị 3.1 Ảnh hưởng của pH lên khả năng tăng trưởng

của hai chủng Az 03 và Az 07 63

Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng của pH lên khả năng cố định nitơ

của hai chủng Az 03 và Az 07 64

Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả

năng tăng trưởng của chủng Az 03 66

Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả

năng tăng trưởng của chủng Az 07 66

Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng

cố định nitơ của chủng Az 03 68

Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng

cố định nitơ của chủng Az 07 69

Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng của ion Mn2+ và ion Cu2+ ở các nồng độ khác nhau

lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 70

Đồ thị 3.8 Ảnh hưởng của ion Mn2+ và ion Cu2+ ở các nồng độ khác nhau

lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 07 71

Đồ thị 3.9 Ảnh hưởng của ion Mn2+ và ion Cu2+ ở các nồng độ khác nhau

lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 72

Đồ thị 3.10 Ảnh hưởng của ion Mn2+ và ion Cu2+ ở các nồng độ khác nhau

lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 07 72

Đồ thị 3.11 Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng trưởng

của chủng Az 03 và Az 07 74

Đồ thị 3.12 Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng cố định nitơ

của chủng Az 03 và Az 07 75

Đồ thị 3.13 Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng

tăng trưởng của chủng Az 03 77

Đồ thị 3.14 Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng

tăng trưởng của chủng Az 07 78

Đồ thị 3.15 Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng

MỞ ĐẦU

 Đặt vấn đề

Trong khí quyển, nitơ chiếm gần 80% thể tích, tuy nhiên chúng tồn tại ở dạng khí

N2 với liên kết cộng hóa trị rất bền vững (N≡N), thực vật không thể sử dụng trực tiếp được Để sử dụng được nguồn đạm dồi dào này thì cần phải phá vỡ liên kết bền vững trong phân tử N2, tạo ra các loại đạm mà cây trồng có thể hấp thu được

Trong công nghiệp sản xuất phân bón hóa học, để phá vỡ liên kết này người ta thực hiện các phản ứng hóa học dưới điều kiện nhiệt độ, áp suất rất cao và có sự tham gia của nhiều chất xúc tác, do dó, việc sản xuất phân bón bằng phương pháp này sẽ gây tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của con người

Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học trong nông nghiệp, thì việc nghiên cứu và tìm ra cách chuyển hóa để biến nguồn đạm dồi dào từ trong khí quyển vào trong đất mà không tác động đến môi trường và sức khỏe con người đã được nghiên cứu Một trong những hướng quan trọng và hiệu quả là việc sử dụng vi sinh vật có khả năng

cố định đạm nhờ hệ enzyme nitrogenase

Azotobacter là giống vi sinh vật cố định đạm tự do có khả năng làm giàu nguồn

đạm trong đất - nguồn đạm cây trồng sử dụng được Chúng có khả năng này là nhờ quá trình cố định nitơ sinh học, quá trình khử N2 trong không khí thành NH3 dưới tác dụng của enzyme nitrogenase Ngoài ra chúng còn kích thích hấp thu các chất dinh dưỡng khoáng của thực vật (NO3-, PO43-, K+, Fe2+), sản sinh ra các chất có khả năng điều hòa sinh trưởng ở thực vật (indole 3-acetic acid, indole- lactic acid…) Loài vi sinh vật trên phân bố rộng rãi trong đất và nước nhưng sự phân bố trên không đồng đều và số lượng hiện diện quá ít không đem lại hiệu quả cao Do đó, việc phân lập, tuyển chọn chủng giống có hoạt tính cố định đạm cao để bổ sung vào đất trồng trọt là một trong những khâu quan trọng nhằm nâng cao năng suất cây trồng

Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng, cố định đạm của vi khuẩn

Azoterbacter – Thử nghiệm trên cây trồng”

 Mục tiêu của nghiên cứu:

Tuyển chọn được chủng Azotobacter có hoạt tính cố định đạm cao từ các chủng

phân lập, nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng và cố định đạm của các chủng chọn lọc, từ

đó ứng dụng trong lĩnh vực trồng trọt

 Nội dung thực hiện:

- Phân lập chủng Azotobacter từ các mẫu đất ở Hà Nội, Lâm Đồng, Đông Nai,

Long An, Tiền Giang, Bến Tre

- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng phân lập

- Tuyển chọn chủng có hoạt tính cố định đạm cao

- Định danh đến loài các chủng chọn lọc bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA

- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng tăng trưởng và cố định nitơ của chủng chọn lọc

- Thử nghiệm hiệu quả của các chủng chọn lọc trên cây cải xanh (Brassica Juncea).

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đai cương về nitơ

1.1.1 Nguồn nitơ trong tự nhiên

Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật, thực vật và ngay cả với các loài vi sinh vật Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, riêng trong không khí, nitơ chiếm 78,16% thể tích Người ta ước tính rằng, trong bầu khí quyển bao trùm lên một hecta đất đai chứa tới 8 triệu tấn nitơ Lượng nitơ này có thể cung cấp cho cây trồng tới hàng chục triệu năm (nếu như cây trồng có khả năng đồng hóa được nó) Trong cơ thể các loài sinh vật trên trái đất cũng có khoảng 0.4 x 109 tấn nitơ Trong các trầm tích chứa 4 x 1015 tỷ tấn nitơ [36]

Hợp chất đạm mà thực vật hút từ đất, một phần như gốc rễ được trả lại đất, phần còn lại được động vật và thực vật dị dưỡng tiêu thụ, lại biến thành các chất bài tiết và xác trả lại đất Những chất hữu cơ này dưới tác dụng của nhiều loại vi sinh vật, nấm bị khử thành đạm ở dạng hữu hiệu [6]

Trên thực tế trong tuần hoàn này đạm bị mất đi khá nhiều Phần lớn phân người và gia súc theo nước chảy ra biển do tưới, do mưa mà số lượng lớn đạm trong đất bị rửa trôi, cuối cùng chảy vào biển Số đạm này, một phần được trả lại bằng phân bón có nguồn gốc từ sản phẩm của biển, nhưng phần rất lớn là ở dạng mà thực vật hầu như không thể sử dụng được [6]

Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử N2, dạng nguyên tử kép (N2) được khóa chặt với nhau thông qua liên kết cộng hóa trị bền vững (N≡N) Mặc dù rất cần nguyên tố này, nhưng cây chỉ có thể hấp thụ được nitơ ở dạng NO3

và NH4

+ Để sử dụng được nguồn nitơ lớn từ không khí có 2 con đường chính là hóa học và sinh học [6]

 Hóa học: Kể từ năm 1920, biện pháp công nghiệp Haber-Bosch đã giúp con người phá vỡ liên kết ba này Biện pháp này đòi hỏi phải thực hiện ở nhiệt độ rất cao (450 - 500oC), áp suất lớn gấp 400 lần áp suất khí quyển và Fe3+ là chất xúc tác [40] Các hợp chất nitơ được tổng hợp hóa học trên cung cấp cho cây trồng một nguồn nitơ lớn và

ổn định Tuy nhiên, bên cạnh việc sử dụng phân đạm được tổng hợp hóa học cho nông nghiệp có thể làm tăng năng suất cây trồng thì cũng đem lại những tác hại vô cùng to lớn, vì trung bình chỉ có 40-50% lượng đạm bón được cây hấp thu, phần còn lại gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí… từ đó gây hại, thậm chí là tiêu diệt các vi sinh

vật có lợi Các hợp chất chứa nitơ của phân bón hóa học gây hại rất lớn đối với cá, động vật thân mềm và con người Một ví dụ cụ thể ở những người sống ở nông thôn và sử dụng giếng nước chứa nitrat cao thì thường có hiện tượng oxy kết hợp với hemoglobin (gọi là hiện tượng Methemoglobinemia) điều này gây hại đến tế bào máu Ngoài ra, việc lạm dụng phân đạm tổng hợp hóa học còn gây tác hại cho đất (như đất bị bạc màu, chua, chai…) hay ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm (như việc tồn dư các hợp chất chứa đạm như NO3

, NH4 +) [6]

- Sinh học: Nhờ các vi sinh vật có thể tiết ra enzyme nitrogenase để thực hiện được một quá trình sinh học đặc biệt - quá trình cố định nitơ Nhóm vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trình này được gọi là các vi sinh vật cố định nitơ Việc sử dụng phân bón vi sinh chứa các vi sinh vật trên vẫn đảm bảo cho năng suất cây trồng đồng thời hạn chế sử dụng phân bón hóa học làm cho sản phẩm sạch và an toàn hơn, lượng nitrat giảm đáng kể, đất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả năng cải tạo đất

do hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp hơn, cây dễ hút chất dinh dưỡng hơn Ngoài ra, còn có các con đường tạo nitơ khác như do sấm chớp hay cháy [8] Bảng 1.1 Các con đường cung cấp đạm cho đất trong chu trình chuyển hóa nitơ [6]

Cách cố định nitơ Hàm lượng nitơ cố định

(1012 g/năm) Không phải con đường sinh học

1.1.2 Vai trò của nitơ đối với thực vật

Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein, diệp lục, ATP… Hàm lượng nitơ trong thành phần các

chất khô của thực vật dao động từ 1-3% Tuy

hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai

trò sinh lý đặc biệt quan trọng trong đời sống

sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất

của cây trồng [3]

Sự thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém,

chlorophylle không được tổng hợp đầy đủ, lá

vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm

hoạt động quang hợp nên năng suất giảm [3, 10]

Thừa nitơ cũng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất của cây trồng Cây sinh trưởng mạnh thân lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ

đổ, giảm năng suất nghiêm trọng và có khi không có thu hoạch [3, 9]

1.1.3 Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên

1.1.3.1 Quá trình khoáng hóa

Quá trình khoáng hóa là quá trình phân hủy xác hữu cơ dưới tác động của quần thể vi sinh vật thành các chất khoáng hòa tan hay các chất khí và tỏa nhiệt, tùy thuộc vào điều kiện khoáng hóa mà cho các sản phẩm khác nhau Giai đoạn này có sự tham gia của các

chủng vi sinh vật nitrat hóa như Nitrosomonas và Nitrobacter - những vi khuẩn tham gia

vào quá trình oxy hóa những hợp chất chứa nitơ thành nitrat (NO3

), một dạng thích hợp

-để cho cây trồng hấp thu [38]

Hợp chất hữu cơ Vi khuẩn amon hóa NH4+

1.1.3.2 Quá trình phản nitrat hóa

Là quá trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat trong điều kiện yếm khí dưới tác dụng của vi sinh vật tạo thành nitơ [38]

1.1.3.3 Quá trình cố định nitơ phân tử

Quá trình này được thực hiện do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống cộng sinh ở rễ cây họ Đậu hay Azotobacter sống tự do sẽ biến đổi N2 trong không khí thành NH3, từ NH3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất Để quá trình này xảy ra thì phải có lực khử mạnh, ATP và thực hiện ở điều kiện kỵ khí (do chỉ trong điều kiện này enzyme nitrogenase mới hoạt động) [38]

Hình 1.2 Chu trình nitơ trong tự nhiên [37]

1.2 Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ

1.2.1 Phân loại

Vi khuẩn cố định nitơ được phân ra thành ba nhóm nhỏ: nhóm vi khuẩn sống cộng sinh, nhóm vi khuẩn sống tự do và nhóm vi khuẩn tương tác với thực vật ký chủ Tuy nhiên, sự phân biệt giữa ba nhóm này, đặc biệt là giữa nhóm vi khuẩn cố định đạm sống

tự do và nhóm vi khuẩn cố định đạm tương tác với thực vật thì vẫn chưa được mô tả một cách rõ ràng và một số vi khuẩn được xếp vào nhiều nhóm [6,10]

* Vi khuẩn sống cộng sinh: là những vi khuẩn sống tương tác với thực vật ký chủ theo kiểu hai bên cùng có lợi Khi đó, vi khuẩn cộng sinh sẽ tiến hành trao đổi chất dinh dưỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ở nơi vi khuẩn định cư, điển hình là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ của những cây họ Đậu Hiện tượng cộng sinh giữa vi khuẩn và cây họ Đậu được xem là tương tác gần giữa vi khuẩn và thực vật, trong đó, vi khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh Hầu hết các vi khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn gram

âm , có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ Đậu, hay là những thành viên xạ khuẩn

thuộc chi Frankia – là vi khuẩn gram dương có khả năng hình thành nốt sần trên cây

thân gỗ, cây hai lá mầm và cây bụi Ban đầu, những vi khuẩn cộng sinh với cây họ đậu

được phân loại thành chi Rhizobium, do đó, những vi khuẩn này thường được nói đến

như là những vi khuẩn nốt rễ (rhizobia) Ngày nay, những vi sinh vật cộng sinh ở cây họ

Đậu được phân thành nhiều chi, trong đó, hầu hết các loài thuộc chi Rhizobium,

Sinorhizobium (Ensifer), Mesorhizobium và Bradyrhizobium [6,10]

* Vi khuẩn cố định nitơ tự do: là những vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thực vật mà không xâm nhập vào cơ thể của chúng theo hướng cộng sinh chuyên biệt Trong

số này quan trọng nhất là các loài thuộc chi Azotobacter, Pseudomonas và Clostridium

[6,10]

* Vi khuẩn cố định nitơ tương tác: là những vi sinh vật tham gia vào quá trình trao đổi chất dinh dưỡng với thực vật nhưng không làm thay đổi cấu trúc của rễ thực vật Để phân biệt được vi sinh cố định nitơ cộng sinh hay tương tác với thực vật ký chủ thì chủ yếu dựa vào mức độ tương tác Sự cố định nitơ tương tác được hiểu là quá trình cố định nitơ bởi những vi sinh vật sống tự do nhưng lại chịu ảnh hưởng trực tiếp bởi cây trồng Theo Klucas (1991), trong mối quan hệ tương tác, cả cây trồng và vi khuẩn cố định nitơ

đều có lợi nhưng mối quan hệ này thường diễn ra ngẫu nhiên nhiều hơn là sự cộng tác bắt buộc Sự cố định nitơ tương tác là một quá trình sinh thái trung gian giữa cố định nitơ cộng sinh và nitơ tự do Và vi khuẩn cố định nitơ tương tác bao gồm những vi khuẩn sống tự do trong vùng lân cận rễ cây thực vật đến những vi sinh vật sống nội sinh trong

mô tế bào thực vật Để quá trình cố định nitơ của vi sinh vật tương tác có thể diễn ra cần những yêu cầu sau đây [10]:

+ Thực vật ký chủ + Chất nền thực vật + Môi trường thích hợp để enzyme nitrogenase hoạt động

+ Quá trình chuyển nitơ được cố định từ vi khuẩn sang cây trồng

Một số vi khuẩn tham gia vào quá trình cố định nitơ tương tác điển hình như:

Azospirillum, Burkholderia, Enterobacter, Gluconoacetobacter, Herbasspirillum và Klebsiella [10]

1.2.2 Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ

Vai trò quan trọng nhất của những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định nitơ cung cấp đạm cho cây trồng Bên cạnh đó, các vi khuẩn cố định nitơ còn được biết đến với nhiều vai trò khác có ích cho cây trồng như:

- Kích thích sinh trưởng ở thực vật bằng cách tạo ra các enzyme như ACC deaminase (1-aminocyclopropane-1-carbonxylate deaminase), hay tạo ra các hormone

thực vật như auxin, cytokinin và gibberellin Đặc biệt các chủng Azotobacter kích thích

sự nẩy mầm của hạt và giúp phát triển hệ rễ của cây trồng [18, 22]

- Giảm tác động có hại của mầm bệnh bằng cách cạnh tranh về dinh dưỡng, cạnh tranh về nơi cư trú hay tạo ra các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân chống lại bệnh

sự xâm nhập của kẻ thù hay cảm ứng hệ thống phòng vệ của cây ký chủ [18,20, 22]

- Ngoài ra, chúng còn giúp cây trồng hấp thu hiệu quả các ion như sắt, kẽm và các nguyên tô vi lượng khác [24]

1.3 Vi khuẩn Azotobacter

1.3.1 Đặc điểm phân loại

Theo khóa phân loại Bergey (2005), Azotobacter được chia thành 7 loài:

A chroococcum, A beijerinckii, A vinelandii, A salinestris, A paspali, A

nigricans, A armeniacus

- A chrococcum (Beijerinck, 1901): tế bào hình que thẳng đến hình elíp, kích thước

đường kính 1,6 x 2,5 m và 3-5 m chiều rộng, tạo nang xác, có khả năng di động được,

có tiên mao Khuẩn lạc khi già có màu nâu đen, sắc tố không khuếch tán vào môi trường

Có khả năng đồng hóa mannitol, tinh bột, glucose… Khuẩn lạc mờ đục, lồi, hầu hết các chủng đều nhầy, trơn và bóng [14, 23]

- A beijerinskii (Lipman, 1904): tế bào có kích thước 2,4 x 5,0 m, có khả năng tạo

nang xác, không có lông roi, không di động được Khi già có màu vàng hoặc màu nâu sáng Sắc tố không khuếch tán vào môi trường Có khả năng đồng hóa mannitol, không đồng hóa tinh bột nhưng đồng hóa được benzoat natri [14, 23]

- A vinelandii (Lipman, 1903): tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 µm, có khả năng tạo nang xác, có tiên mao, có khả năng di động Loài này sinh sắc tố màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố này khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannitol và Sodium benzoat [14, 23]

- A salinestris (Page và Shivprasad, 1991) tế bào có hình cầu que (cocobacilli), kích thước 2 x 3-4 m khi tế bào còn non, khi già có hình cầu với bán kính từ 3-5 m, nhiều dạng và thường tìm thấy dạng kết đôi hoặc dạng chuỗi (6-8 tế bào), tạo nang xác

Tế bào di động bởi chu mao (Peritrichous flagella) dài 9-10 m Tế bào già thì không di động, có khả năng tăng trưởng tốt ở dãy nhiệt độ 30-360C Nhiệt độ cố định nitơ tốt nhất

là 350C, tế bào phát triển trong khoảng pH 6.2 – 8.0 và tối ưu ở pH 7.2 Khả năng sử dụng nguồn carbon bao gồm fructose, galactose, glucose, sucrose, mannitol, melibiose, 0.25% sodium benzoate và tinh bột Nguồn nitrate và amomonium được sử dụng như nguồn nitơ Sắc tố màu nâu nhạt đến nâu đen được tạo thành bởi hầu hết các chủng khi chúng phát triển trên môi trường vô đạm và thông khí tốt [14, 23]

- A paspali (Dobereiner, 1966): đặc điểm hình thái giống với các chủng loài

Azotobacter khác, nhưng tế bào dài hơn, kích thước tế bào thường 5 – 10 µm, có thể dài

tới 60 µm Tế bào di động bởi chu mao (peritrichous flagella) Khuẩn lạc thường mờ đục với đường mép liên nhau hoặc lượn sóng, thường không nồi và bề mặt nhám Có thể sử dụng ammonium nhưng không sử dụng được glutamate như là nguồn nitơ duy nhất cho

sự tăng trưởng Theo Thompson và Skerman (1979),Nguồn carbon sử dụng được bao gồm maltose, trihalose, raffinose, mannitol [14, 23]

- A nigricans (Krasil’ nikov, 1949): Tế bào hình que đầu tròn, không di động và

không có tiêm mao Khuẩn lạc thường trơn, nhưng có thể thay đổi do lượng polysaccharide ngoại bào Hầu hết tế bào mờ đục nhưng có thể trong mờ Sắc tố được tạo ra thường có màu đỏ tím Tăng trưởng yếu hoặc không tăng trưởng ở 370C

Ammonium và nitrate được sử dụng như là nguồn nitơ thích hợp Loài này mang gen nif

và vnf nhưng không có anf, có khả năng tổng hợp nitrogenase-1 và nitrogenase-2 [14,

23]

- A armeniacus (Thompson và Skerman, 1981): đặc điểm hình thái của loài này

giống hầu hết các chủng khác Tế bào di động bằng chu mao, khuẩn lạc mờ đục, rất nhầy

và bề mặt nhám nhiều hơn các chủng khác Sắc tố tan trong nước màu nâu đen đến đỏ tím [14, 23]

(a) (b) (c)

Hình 1.3 Tế bào sinh dưỡng các chủng Azotobacter [14]

A chrococcum (a), A nigricans (b), A paspali (c) 1.3.2 Tổng quan về Azotobacter

Azotobacter thuộc chi vi khuẩn gốc rễ sống tự do, không sinh bào tử nhưng tạo bào

xác (cyst) giúp chúng chống chịu được với điều kiện khô hạn và bất lợi Chúng được tìm

Tên loài

Đặc điểm

thấy trong đất trung tính đến kiềm, trong môi trường nước và trên một số thực vật

Azotobacter được quan tâm nhiều do chúng có khả năng cố định nitơ phân tử từ không

khí thành ammonia Quá trình cố định này được thực hiện nhờ hệ nitrogenase [17]

Chủng đầu tiên thuộc chi Azotobacter được phân lập từ đất là chủng Azotobacter

chrococcum ở Holland vào năm 1901 Kể từ đó các loài vi khuẩn này đã được nghiên

cứu bởi nhiều tác giả A chrococcum và A algilis được nghiên cứu bởi Beijerinck (1901) Trong nhiều năm tiếp theo thì các loài thuộc nhóm vi khuẩn Azotobacter khác đã được tìm thấy trong đất và xung quanh vùng rễ như A vinelandii (Lipman, 1903), A

beijernckii (Lipman, 1904), A nigricans (Krassilnikov, 19490), A paspali (Dobereiner,

1966); A armenicus (Thompson và Skerman, 1981), A salinestris (Page và Shivprasad,

1991) Các loài vi khuẩn cố định nitơ này rất quan trọng trong ngành nông nghiệp và môi trường [23]

Bảng 1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số loài thuộc chi Azotobacter [14]

-

- +

-

-

- + +

-

- +

+ +

-

-

-

d +

d +

-

- +

-

- + + + + + + + +

Sử dụng như nguồn carbon duy nhất

Fuctose, glucose, acetate, pyruvate,

fumarate, malate, succinate,

α-oxoglutarate, lactate, DL-gluconate,

-

- + +

+ +

-

-

d + +

d +

d + +

d

-

+

+ +

d +

-

d

d

d + +

- + + + +

-

- +

d

d

d +

d +

- + + +

+ +

-

d + + +

-

d

d + +

d

-

+

+ +

- +

- + +

d +

d

d +

+ +

-

d

d + +

- +

d + +

-

d + +

+ + +

- + + + +

-

- + +

-

d +

d + +

nd +

nd

+

-

- + +

- + + +

+ + +

- + + + +

d + + +

+

d

+

+ + + + +

d +

- + +

Azotobacter là vi khuẩn gram âm, có dạng hình que đầu tròn (rods with rounded

ends) đến hình trái xoan (ellipsoidal) hoặc hình cầu (coccoid), hình dạng của chúng tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy và thời gian nuôi cấy Trên môi trường vô đạm Winogradsky với glucose là nguồn carbon, tế bào còn non của các chủng khác nhau xuất hiện rất giống nhau: hình que kích thước 1.6-2.7 x 3.0-7.0 µm, khi già chúng có khuynh

d + +

d

-

d

- + +

d

d +

d + + + + +

hướng chuyển thành hình trái xoan

đến hình cầu, một số có dạng chuỗi

và dạng sợi như A paspali tạo thành

dạng sợi dài có chiều dài lên đến 60

µm [14]

Theo Tchan và New (1984), khi

chúng phát triển trên môi trường có

bổ sung chiết nấm men – peptone

agar thường tạo ra các tế bào biến

dạng [14]

Azotobacter tăng trưởng dưới điều kiện cố định nitơ thường có kích thước nhỏ hơn

khi phát triển trên môi trường có ammonia Azotobacter thường tồn tại ở dạng đơn, hoặc đôi hoặc thành từng nhóm không đều (A paspali), hiếm khi tồn tại dạng chuỗi [14] Khi già, tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến thành dạng

hình cầu, tế bào được bao bọc bởi một lớp vỏ nhầy khá dày, vỏ nhầy đó chứa khoảng 75% là chất hydrid của uronic acid và chỉ chứa khoảng 0,023% nitơ và sinh chất xuất hiện nhiều hạt lổn nhổm, đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ… [19]

Khuẩn lạc của Azotobacter thường trơn, bóng, đục, lồi và nhầy Khi còn non khuẩn

lạc có màu trắng đục, sau đó dần dần chuyển sang màu vàng hoặc nâu đen Tuy nhiên

các đặc điển trên có thể thay đổi trong một số trường hợp Như A vinelandii, các khuẩn lạc biến thể nhỏ hơn có thể xuất hiện do sự tạo thành polysaccharide ngoại bào giảm A

armeniacus thỉnh thoảng tạo ra những khuẩn lạc trong mờ (translucent) và khuẩn lạc A paspsli dạng viền gợn sóng (undulate edged) và lồi không đều (unevenly convex) với bề

mặt xám hoặc nhám Trên môi trường có sucrose hoặc raffinose, tùy thuộc vào chủng giống thì có sự tạo thành các homopolysaccharide, chúng có thể khuếch tán ra xung

quanh khuẩn lạc Theo Thompson và Skerman (1979) loài A chrococcum và một số chủng thuộc loài A beijerinckii và A nigricans tạo ra các homopolysaccharide khuếch tán từ cả hai loại đường trên, trong khi đó loài A meniacus và một số chủng thuộc loài

Hình 1.4 Tế bào sinh dưỡng chủng A paspali

A beijerinckii và A nigricans khác tạo ra các homopolysaccharid khuyếch tán khi môi

trường có bổ sung nguồn sucrose [14]

Hình 1.5 Một số dạng khuẩn lạc Azotobacter chủng A beijerinskii (a); chủng A vinelandii (b)

1.3.4 Đặc tính di động

Azotobacter có khả năng di động với tiêm mao (flagella) hoặc không di động Sự sắp

xếp của tiêm mao có rất nhiều tranh cãi nhưng theo quan sát của Hofer, Krasilnikov và

cộng sự bằng kính hiển vi thì hầu hết Azotobacter có lông roi nằm ở bên; ngoại trừ A

insique có tiêm mao nằm ở một cực Kích thước trung bình khoảng 2,0 - 7,0 µmvà 1,0 -

2,5µm, đôi khi có chiều dài đạt đến 10-12 µm [19] A beijerinckii và A nigricans thì không di động Các chủng khác thì di động bằng chu mao (peritrichous flagella) A

vinelandii OP là chủng vi khuẩn di động

nhanh, với vận tốc trung bình đo được là

74 µm/giây (Haneline et al., 1991) Nồng

độ oxy và một số chất được tìm thấy làm

tăng tốc độ di chuyển của tế bào như là

những chất có chức năng dẫn dụ Các chất

này như là fructose, glucose, xylitol,

mannitol, hexose, hexitol, pentiol, pentose,

disaccharide và các đường amino [14]

Hình 1.6 Hai tế bào A chroococcum bắt cặp

(diplococcus) di động bằng chu mao [23]

1.3.5 Sự hình thành bào xác (cyst)

Bào xác được hình thành ít hơn 1% số tế bào ở cuối pha ổn định khi nuôi cấy trên glucose hoặc mannitol Sự hình thành nang bào xác (encystment) có thể lớn hơn 90% sau khi bổ sung butan-l-ol hoặc β-hydrobutyrate vào môi trường nuôi cấy (Lin và Sadoff,

1968) Sự có mặt isopropanol có thể tốt hơn cho chủng A chrococcum (Marengo, 1983)

[25] Trong thời gian kết bào xác thì hầu

hết các hoạt động trao đổi chất bị ngưng

lại Chúng có sức chịu đựng khô hạn và

sự hủy hoại do tác nhân vật lý và hóa

chất tốt hơn đáng kể so với tế bào sinh

dưỡng (Socolofsky và Wyss, 1962) Khi

nghiên cứu cấu trúc siêu vi, cho thấy

chúng được cấu thành từ một cơ quan

trung ương (central body)

có chứa β-hydrobutyrate bao quanh bởi lớp trong và lớp ngoài giống màng bao (capsule), với alginate là thành phần chủ yếu Sự lắng đọng vật liệu của vỏ và các thành phần màng trong trường hợp không phân chia tế bào tạo ra lớp màng bao bên ngoài (exine coat) (Hitchins và Sadoff, 1970) Các túi bên trong di chuyển ra phía màng ngoài nơi chúng hình thành một lớp màng ở bên trong Các túi này có thể đã được tạo ra trong thời gian tế bào sinh dưỡng (Vela và cộng sự, 1970) Quan sát này cung cấp những bằng chứng cho thấy bào xác chỉ đơn giản là tế bào sinh dưỡng ở trạng thái nghỉ ngơi và chúng không giống bào tử vi khuẩn Theo Lin và Sadoff (1969), thành phần của lớp

màng bao bên ngoài ở A vinelandii bao gồm: 32% carbohydrate, 28% protein và 30%

lipid [14, 25]

1.3.6 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

1.3.6.1 Khả năng sử dụng nguồn carbon

Khả năng sử dụng đa dạng nguồn carbon của loài Azotobacter là rất quan trọng đối

công việc nghiên cứu và ứng dụng, đặc biệt, nguồn carbon có thể ảnh hưởng đến hiệu

quả của việc cố định nitơ phân tử [14] Azotobacter có thể sử dụng các hợp chất alcohol

(ethanol, propanol, butanol, 2,3-butylene glycol, glycerol, sorbitol, mannitol, inositol);

Hình 1.7 Dạng bào xác của chủng chủng Azotobacter

acid hữu cơ (acetic, propionic, butyric, valeric, malic, lactic, malonic, …) và các loại mono-, di-, tri- và polysaccharide (glucose, fructose, sucrose, maltose, lactose, trihalose, raffinose, dextrin, tinh bột, glycogen) là nguồn carbon [14, 25, 16] Một số nguồn carbon được sử dụng ở tất cả các loài, trong khi các nguồn carbon khác chỉ được sử dụng ở một

số loài Kể từ khi Thompson và Skerman (1979) công bố, đã có thêm vài nghiên cứu

khác về việc sử dụng nguồn carbon của các loài, trong đó, ấn phẩm của Manulal Theo

De La Vega và cộng sự (1991), sucrose bị suy thoái (degrade) bởi enzyme invertase

ngoại bào ở A chrococcum ATCC 4412, trong khi ở A vinelandii UW (ATCC 13705),

sự suy thoái ấy lại do enzyme invertase nội bào Chen và cộng sự (1993) thấy rằng, A

chrococcum (ATCC 9043) và A vinelandii UW sử dụng không chỉ được các hợp chất

thơm (aromatic compounds) benzoate và 4-OH-benzoate mà còn catechol, naphthalene,

procatechuate và 4-toluate A chrococcum biểu hiện dioxygenase chỉ phân cắt ở vị trí

ortho khi tăng trưởng trên naphthalene và 4-toluate và chỉ cắt ở vị trí meta của các hợp

chất thơm khác (Thompson và Skerman, 1979) A vinelandii biểu hiện enzyme phân cắt

cả vị trí ortho và meta (Chen và cộng sự, 1993) Điều thú vị là tỉ lệ tăng trưởng và hoạt tính nitrogenase gần như cao hoặc cao hơn khi nguồn carbon là các hợp chất thơm –

benzoate và naphthalene, đặc biệt đối với A chrococcum và A vinelandii Trong số các

chủng phân lập từ đất ở gần Leiceter nước Anh được tăng sinh làm giàu trên monochloroacetate, một chủng – RC26 – có nhiều đặc điểm nuôi cấy và sinh lý mà xếp

nó trong chi Azotobacter (Diez et al., 1995) Chủng này có thể khử một số hợp chất

halogen khác nhau được sử dụng như là thuốc trừ sâu sinh học giống với loài

Pseudomonas đã xác định [14]

Việc sử dụng các nguồn carbon như trên rất có ý nghĩa trong việc định danh loài, như

loài A chrococcum có khả năng đồng hóa tốt lactose và glycerol, trong khi A

beijerinckii lại sử dụng tốt mannitol và tinh bột. A agile dường như chỉ sử dụng hạn chế

một số nguồn carbon nào đó, chúng lựa chọn nguồn carbon hơn các loài khác, chúng

không sử dụng mannitol và benzoate [34] A insigne bị giới hạn bởi ethanol và acid hữu

cơ đặc biệt là formic acid và benzoic acid [19]

1.3.6.2 Khả năng sử dụng nguồn Nitrogen

Các kết quả thử nghiệm của Vermani và cộng sự (1997) cho thấy hầu hết các loài

Azotobacter đều có khả năng cố định đạm Khi bổ sung nitơ vào môi trường nuôi cấy sẽ

làm giảm thời gian của pha lag, thời gian thế hệ (generation time), do đó làm giảm thời gian lên men Khi nitơ được cung cấp dưới dạng NaNO3 ở nồng độ lên đến 0.5 g/l sẽ làm gia tăng sự tăng trưởng, nhưng khi tăng nồng độ hơn nữa cũng không làm thay đổi kiểu tăng trưởng và KNO3 cho kết quả tương tự Kết quả tốt nhất thu được với NH4Cl ở nồng

độ 0.1 g/l Kết quả của nghiên cứu của Iwahash và Someyo (1992), cho thấy khi bổ sung

NH4Cl và NaNO3 vào môi trường nuôi cấy làm gia tăng sự tăng trưởng của một chủng

hoang dại và 3 chủng đột biến A vinelandii [17] Các chủng A vinelandii OP tăng

trưởng tốt với nguồn nitơ N2, ammonia, nitrate và các amino acid, tuy nhiên theo Joel Oppenheim và Leon Marcus (1969), khi tăng trưởng trên các nguồn nitơ khác nhau chúng sẽ có kết cấu siêu vi của màng khác nhau [21] Nghiên cứu khác của tác giả George J Sorger (1968), trong môi trường nuôi cấy có bổ sung Cao nấm men, Casamino acid, Methylalanine và NH4Cl thì hoạt tính nitrogennase của chủng Azotobacter

vinelandii OP sẽ giảm [16]

1.3.6.3 pH

Azotobacter phát triển và cố định đạm tốt nhất ở pH trung tính, chúng có thể phát

triển trên môi trường với khoảng pH từ 4.5-5.5 đến 9.0 (Gül Fidan Saribay, 2003) Các

loài Azotobacter có sự khác nhau về độ nhậy cảm với môi trường acid, ví dụ, pH trung bình tối thiểu cho A chrococcum và A beijerckii là pH 5.5 còn đối với A

macrocytogenes là pH 4.6 pH tối ưu cho Azotobacter phát triển là pH 7.2 – 8.2

(Mishutin và Shilnikova, 1969) và quan sát thấy ở pH 7.5 (Dhanasekar, 2003) Hơn nữa,

sự tăng trưởng và cố định đạm giảm cả ở pH axít hoặc kiềm [17]

1.3.6.4 Nhiệt độ

Liên quan đến nhiệt độ, Azotobacter là vi khuẩn điển hình sống trong môi trường có

nhiệt độ vừa phải (mesophillic) Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và cố định đạm của

Azotobacter nằm trong khoảng 25 – 300C (Mishustin và Shilnikova, 1969) Nhiệt độ tối

thiểu cho sự tăng trưởng của Azotobacter nằm trên 00C một chút Tế bào sinh dưỡng của

Azotobacter không chịu được nhiệt độ cao, và nếu giữ ở 45 – 480C chúng sẽ bị thoái hóa

và chết (Mishustin và Shilnikova, 1969) Theo nghiên cứu của Dhanasekar (2003),

Azotobacter sử dụng glucose và nuôi cấy trong bể phản ứng (batch reactor) có nhiệt độ

tối ưu là 300C Azotobacter cố định được nitơ từ N2 là nhờ hệ enzyme nitrogenase, chúng hoạt động trên phạm vi nhiệt độ tương đối hẹp và rất nhạy cảm với nhiệt độ cao Tại các giới hạn thấp hơn từ 5-100C, nitrogenase hoạt động thấp, trong khi ở giới hạn trên 37 –

400C, hoạt tính nitrogenase giảm đi nhanh chóng [17]

1.3.6.5 Nhu cầu về oxy

Azotobacter là loài hiếu khí, chúng cần oxy trong quá trình tăng trưởng Nhiều

nghiên cứu cho thấy, sự thông khí sẽ kích thích sự tăng sinh của Azotobacter (Mishustin

và Shilnikova, 1969) Ảnh hưởng của oxy khác nhau lên sự tạo thành sinh khối của A

vinelandii đã được nghiên cứu Sự tạo thành sinh khối tối ưu nhất ở pO2 2-3% (không khí bão hòa) và sự hình thành sinh khối sẽ giảm khi tăng pO2 lên (Sabra et al., 1999) Trong một nghiên cứu khác (Pena et al., 2000), cho thấy khi tăng cả nồng độ oxy hòa tan

và tốc độ khuấy sẽ làm tăng mật độ tế bào của vi khuẩn cố định đạm Azotobacter [8] Tuy nhiên sự cố định đạm của vi khuẩn lại bị ưc chế bởi oxy Ở vi khuẩn hiếu khí, sự cố định N2 xẩy ra khi có sự hiện diện của oxy trong tế bào, nhưng không hiện diện trong hệ enzyme nitrogenase của vi khuẩn Các enzyme này được bảo vệ từ sự bất hoạt O2 bằng cách loại bỏ O2 bởi hô hấp, việc tạo ra các lớp chất nhầy làm chậm sự khuyếch tán của

O2 (O2-retarding) hoặc sự chia thành ngăn riêng biệt chứa enzyme nitrogenase (Brock và

cộng sự, 1994) Ở nồng độ 4% oxy, A vinelandii cố định được 23.5 mg nitơ và A

chrococcum là 21.6 mg nitơ khi cung cấp 1g sucrose, khi tăng nồng độ lên 20% oxy thì

sự cố định nitơ của hai chủng sẽ giảm di chỉ còn tương ứng là 8.1 mg và 7.4 mg nitơ khi cung cấp 1g sucrose Những kết quả này cho thấy, hiệu quả cố định nitơ sẽ tăng lên với việc giảm một phần áp suất của oxy (Parker, 1954) Khi tỉ lệ oxy hòa tan cao sẽ ức chế nitrongenase trong tế bào vi khuẩn (Yates, 1970), kết quả này chỉ ra rằng sự cố định đạm

bởi A chrococcum giảm khi tăng tốc độ lắc ở điều kiện nuôi cấy liên tục [17]

1.3.6.6 Dinh dưỡng khoáng

Azotobacter cần một số nguồn dinh dưỡng khoáng cơ bản cho sự tăng trưởng và cố

định đạm Bên cạnh nguồn carbon, chúng cần nhiều loại muối khoáng cho sự cố định đạm để tăng sinh khối Fe và Mo là các co-factor của enzyme nitrogenase, chịu trách

nhiệm cố định đạm vì vậy chúng cần thiết cho sự tăng trưởng của vi khuẩn (Brock và cộng sự, 1994) Tuy nhiên, khi bổ sung FeSO4 sẽ làm giảm sự phát triển tổng số tế bào

của chủng đột biến A vinelandii (Edward và cộng sự 2000), trong khi một nghiên cứu

khác (Vermani và cộng sự, 1997) lại làm gia tăng sự phát triển Sự tăng trưởng của

Azotobacter phụ thuộc nhiều vào sự hiện diện của các hợp chất phospho và kali trong

môi trường nuôi cấy (Mishustin và Shilnikova, 1969) Sự vắng mặt hoặc thiếu hụt

phospho trong môi trường sẽ làm sự tăng trưởng của vi khuẩn Azotobacter chậm lại

(Sabra va cộng sự, 1999) Ca và Mg có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất

của Azotobacter, một sự thiếu hụt Ca trong môi trường sẽ dẫn đến kéo dài thời gian của

pha lag, nhưng hoạt động được coi là không liên quan trực tiếp đến quá trình cố định đạm Mặc dù, Mn không phải là một nguyên tố thiết yếu cho việc cố định đạm, tuy nhiên

ở nồng độ nhất định thì hoạt tính cố định đạm của chủng A chroococcum đạt giá trị cao

nhất (Mishustin và Shilnikova, 1969) Trong bài báo cáo của Becling (1961), về sự ảnh

hưởng của Cu lên sự sinh trưởng và phát triển của Azotobacter thì Cu là chất độc đối với

Azotobacter ngay cả khi ở nồng độ rất thấp [17]

Các hợp chất phospho trong môi trường cũng ảnh hưởng đến sự cố định đạm của vi

khuẩn Quá trình cố định đạm của Azotobacter bắt đầu khi nồng độ của PO4

-3 đạt 4 mg/100ml môi trường Nếu nồng của PO4

-3 trong môi trường khoảng 800 mg/ml quá trình đồng hóa đạm bị ngưng hoàn toàn (Becking, 1961) Salmeron và cộng sự (1990) nghiên cứu sự tác động của phosphate lên sự cố định đạm và mối tương quan của chúng, tức khi tăng nồng độ PO4

-3

sẽ làm tăng hoạt tính của nitrogenase Phức hợp nitrogenase cần ion Mg+2 để hoạt động (Sylvia và cộng sự, 1999), do đó, trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung ion Mg+2 Mo là nguyên tố cần thiết cho hầu hết các chủng Azotobacter

Nguyên tố này cần trong cả quá trình cố định nitơ phân tử và trong quá trình tạo thành nitrate (Mishustin và Shilnikova, 1969) Nguyên tố này rất cần trong quá trình biểu hiện của phức hợp nitrogenase Theo Brock và cộng sự (1994), Vanadi kích thích việc cố

định nitơ ở một số vi sinh vật bao gồm các loài khác nhau của Azotobacter, một số vi khuẩn Cynobacteria, Phototrophic, và loài Clostridium pasteurianum [17]

1.4 Sự cố định đạm của vi sinh vật

1.4.1 Cấu trúc và sự hoạt động của nitrogenase

Nitrogenase chứa 2 loại protein molybdoferredoxin và azoferredoxin Ở hầu hết vi khuẩn, các điện tử được chuyển từ NAD(P)H hoặc pyruvate đến ferredoxin, một FeS protein Nếu Fe trong ferredoxin thiếu sẽ được thay thế bởi flavodoxin, một flavoprotein Azoferredoxin chuyển điện tử từ sự khử flavodoxin (hoặc ferrodoxin) đến molybdoferredoxin [37]

Molybdoferrodoxin là một tetramer gồm 2 chuỗi alpha và 2 chuỗi beta Các tiểu đơn

vị alpha và beta tương tự nhau nhưng khác nhau là được mã hóa bởi gen hai gen khác

nhau (nifK và nifD) Mỗi tetramer chứa 2 nguyên tố Mo và nhiều nhóm FeS Molypden

này là một phần cofactor của phân tử trọng lượng thấp có chứa Mo liên kết với cụm Fe7S8 và homocitrate Cofacter MoFe này là duy nhất trong cố định đạm và nó khác với các cofactor Mo-protein của Mo protein khác (như nitrate reductase, xanthine oxidase)[37]

Azoferredoxin là một dimmer của các tiểu đơn vị giống nhau được mã hóa bởi gen

nifH và chứa một nhóm Fe4S4 duy nhất cho mỗi dimmer Azoferrdoxin được biến đổi

bởi NifM protein Molybdoferrodoxin từ một chi (genus) thường có thể tương tác với các azoferredoxin từ các chi khác nhau cho hoạt động enzyme Hai loại protein này có nhiều tên khác nhau [37]:

Molybdoferredoxin = thành phần I, MoFe protein, hoặc "nitrogenase"

Azoferredoxin = thành phần II, Fe protein, hoặc reductase nitrogenase

Hình 1.8 Cấu trúc của enzyme nitrogenase [17]

Nitrogenase không phải là tạo thành rất nhanh (tốc độ là khoảng 50 mol/phút cho mỗi mol Mo) và khoảng 2-5% tổng số protein tế bào là nitrogenase Các phản ứng N2 + 3H2

= 2NH3 thực sự giải phóng năng lượng Tuy nhiên năng lượng cần thiết để phá vỡ liên kết N≡N là rất cao và năng lượng có ích như ATP được tiêu thụ bởi protein NifH (azoferrodoxin) Nếu có một lượng lớn azoferrodoxin, khi đó ATP có khuynh hướng bị

phá hủy Ở Klebsiella, nifHDK tạo thành một operon giúp cân đối tỷ lệ giữa các thành

phần [37]

Sự cố định đạm dưới điều kiện hiếu khí là đặc tính cơ bản của chi Azotobacter Các

cụm lớn và nhỏ của gene mã hóa các enzyme tham gia cố định đạm trong điều kiện đủ

Mo ở A vinelandii Một số chức năng cụ thể của gene nif được đề cập dưới dây Các gene mã hóa nifHDK, protein cấu trúc cơ bản của enzyme nitrogenase Các sản phẩm gene khác được mã hóa bởi cụm nif (nifV, nifEN, nifH) này là cần thiết cho sự tổng hợp

của Fe-Mo-cofactor, một thành phần thiết yếu của enzyme giúp cho việc gắn với cơ chất

và thực hiện phản ứng Sự hình thành các cụm Fe-S nằm ở các vị trí khác trong enzyme

có liên quan đến vận chuyển điện tử đến cofactor (NifU, NifS) và tham gia vào các khía cạnh khác của sự trưởng thành enzyme Thêm vào đó là một cụm, nằm ở nơi khác trong

bộ gene của A vinelandii, trong đó bao gồm nifL và nifA trong một operon mã hóa cho

protein điều hòa NifL và NifA, và các protein khác tham gia vào tổng hợp cofactor của

nitrogenase và chế biến Mo (sản phẩm của operon nifB, fdxN, nifO, nifQ) NifL cản trở

sự biểu hiện của các gen nif khác nếu hàm lượng cao của ammonia và oxy có mặt, điều

kiện đó tương ứng, hoặc sẽ làm cho nitrogenase không cần thiết cho sự tăng trưởng hoặc trở nên không hoạt động Protein NifL, mang một cofactor flavin, ức chế hoạt tính của

NifA, nhưng lại hoạt hóa phiên mã của các gen nif và operon khác dưới điều kiện này (Dixon, 1998) Sự hiện diện của gen nif là đặc điểm của các vi khuẩn cố định đạm

(diazotroph) ở Gammaproteobacteria, bao gồm các vi khuẩn cố định đạm quan trong

khác của khóa phân loại này như Klebsiella pneumoniae, cũng như A vinelandii – hai loài được nghiên cứu nhiều nhất Gen nif đã không được xác định trong các nhóm

Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria hoặc Deltaproteobacteria [14].

Sơ đồ 1.1 Vai trò của các thành phần trong nitrogenase [37]

Các protein Nif (liên quan đến cố định nitơ) thường được gọi bằng tên của các gen [37]:

nifJ = pyruvate flavodoxin reductase

nifF = flavodoxin

nifH = azoferredoxin

nifM = quá trình chế biến NifH protein

nifK,D = molybdoferredoxin

nifB,N,E,V,W,Z = tổng hợp MoFe cofactor

nifY = sự gắn MoFe cofactor

nifQ = thu hút các molybdenum

nifA,L,R = điều hòa

nifU,S = Trung tâm tổng hợp kim loại (metal center biosynthesis)

nifX,T = chưa rõ chức năng

Giảm sự cân bằng (Reducing equivalents)

1.4.2 Cơ chế của nitrogenase

Phản ứng cố định nitơ được xúc tác bởi enzyme nitrogenase theo phương trình sau:

N2 + 8 H++ 8 e- +16 ATP → 2 NH3 + H2 +16 ADP +16 Pi

Cơ chế cố định đạm có thể được tóm tắt như sau (Sylvia và cộng sự, 1999) [17]: + Dinitrogenase reductase nhận các electron từ chất khử yếu, chẳng hạn như ferrodoxin hoặc flavodoxin và liên kết với hai phức hợp MgATP

+ Phức hợp này chuyển electron cùng một lúc cho dinitrogenase

+ Dinitrogenase reductase và dinitrogenase từ một phức hợp, điện tử được chuyển

và 2 MgATP được thủy phân thành MgADP+Pi

+ Dinitrogenase reductase và dinitrogenase tách ra và quá trình này được lập đi lập lại

+ Khi dinitrogenase đã nhận đủ các điện tử, nó liên kết với phân tử N2, khử N2, tạo thành amoni

+ Dinitrogenase sau đó nhận thêm điện tử từ dinitrogenase reductase để lập lại chu kỳ

Sơ đồ 1.2 Cơ chế hoạt động của nitrogenase [17]

H2

H3N-NH3

HN=NH

H2N-NH2 2H 2H

Pyruvate

Pyruvate: Flavodoxin oxidoreductase

Flavodoxin Flavodoxin

khu vực thượng nguồn của các operon nifLA và kích hoạt phiên mã [37]

NtrA (=GlnF = RpoN = 54) là một nhân tố nitơ sigma, nó cần thiết cho sự biểu hiện

của operon nifLA và ổn định cấu trúc các gen nif NtrA là một nhân tố sigma thay thế

được sử dụng bởi RNA polymerase để nhận ra nhiều gen tham gia vào quá trình chuyển

hóa nitơ mà không được nhận biết bởi các yếu tố sigma tiêu chuẩn Các gen nifA mã hóa các protein yêu cầu mở tất cả các gen nif, ngoại trừ điều hòa các gen thuộc operon nifLA Nếu protein NifA được tạo thành, nó thực hiện chức năng hoạt hóa các gen nif khác Gen

nifL cần thiết cho sự ngăn chặn O2 Trong trường hợp không có protein NifL, nitrogenase được tạo thành trong sự có mặt của O2 (nhưng bị bất hoạt bởi O2) Khi O2 hiện diện, preotein NifL liên kết với protein NifA và ngăn cho nó không kích hoạt các

gen nif khác [37]

Sơ đồ 1.3 Sự điều hòa hoạt động trong cố định nitơ [37]

1.5 Khả năng của Azotobacter sử dụng trong nông nghiệp

Vi khuẩn Azotobacter được sử dụng cho nghiên cứu cố định nitơ và xâm nhiễm thực

vật bởi nó làm tăng tốc độ tăng trưởng và mức độ cố định nitơ cao (Jagnow, 1987; Gouri

và Jagasnnatathan, 1995; Maltseva và cộng sự, 1995; Mrkova-ki,1996) Tuy nhiên, các

dữ liệu thực nghiệm liên quan đến vi khuẩn Azotobacter kích thích phát triển thực vật, các cơ chế hoạt động mà vi khuẩn Azotobacter làm tăng cường tăng trưởng thực vật còn

chưa được hiểu rõ Có ba cơ chế được đề xuất: cố định N2; cung cấp kết hợp nitơ cho cây trồng; sản xuất các chất giống như hormon tăng trưởng thực vật (phytohormon), từ đó làm thay đổi tăng trưởng, hình thái thực vật và vi khuẩn khử nitrate, mà làm tăng tích lũy nitơ trong thực vật [27]

Vấn đề là xác định được nguyên nhân gây ra những ảnh hưởng khác nhau giữa các kiểu gen thực vật và các chủng vi sinh vật cố định nitơ tự do được ứng dụng Theo Sari

và cộng sự (1988), nó có thể được giả định rằng mối liên hệ giữa một kiểu gen thực vật

và một chủng vi khuẩn phụ thuộc vào các đặc tính các thành phần trong hệ thống bao gồm [27]:

- Thành phần định lượng và chất lượng các dịch tiết ở rễ của kiểu gen thực vật

- Các đặc trưng trao đổi chất của chủng vi sinh vật

- Khả năng của chủng vi sinh vật và các kiểu gen thực vật để tổng hợp các hormon tăng trưởng thực vật (phytohormone)

- Khả năng của chủng vi sinh vật để tổng hợp các hợp chất ức chế

- Ảnh hưởng của hệ thống kiểu gen thực vật – chủng vi sinh vật

- Các chủng vi sinh vật có khả năng xâm nhiễm bề mặt của rễ và xâm nhập vào mô thực vật

- Ảnh hưởng hệ thống kiểu gen thực vật – chủng vi sinh vật lên những thay đổi của vùng rễ về các yếu tố môi trường (pH, rH2, pO2, CO2 )

- Đặc trưng của kiểu di truyền thực vật liên quan đến sự hấp thu và vận chuyển đạm Trên cơ sở của cuộc thảo luận về các nhân tố hệ thống cố định đạm (Quispel, năm 1991; Kennedy và Tchan năm 1992 - những người nghiên cứu cố định nitơ trong ngũ cốc) đã cho một số đề xuất mới liên quan đến các nghiên cứu trong tương lai về sự kết hợp của vi khuẩn cố định đạm và ngũ cốc, sự cố định nitơ sẽ hiệu quả hơn Triplett

(1996) kết luận rằng sự phát triển của vi khuẩn cố định nitơ bên trong bắp có khả năng thành công nhất với sự phát triển của cây bắp mà không cần bón phân đạm cho phát triển

và năng suất tối ưu [27]

Khả năng của một số chủng vi khuẩn Azotobacter sống ở vùng rễ cây củ cải đường

và hoạt động nitrogenase trong nghiên cứu giống củ cải đường lai có tương quan với

chuyển động của các tế bào Azotobacter đối với gốc cây (Mrkova-ki và cộng sự, 1995) Bằng cách đánh giá, phân tích các dữ liệụ từ các thí nghiệm gây nhiễm Azotobacter

với củ cải đường trong hơn 10 năm qua, có thể kết luận rằng vi khuẩn này có khả năng cải thiện năng suất của cây trồng nông nghiệp quan trọng là

củ cải đường bằng cách sử dụng các chủng A chroococcum khác nhau và giống cây

trồng Theo Mrkova-ki và cộng sự (2001), thì do sự xâm nhiễm của các vi khuẩn này với của củ cải đường này làm tăng 4-26% năng suất củ cải đường; 2.5 – 5.39% hàm lượng đường và 2 – 24% sản lượng đường kết tinh [27]

1.6 Các nghiên cứu, ứng dụng trong và ngoài nước

Trên thế giới cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về chủng Azotobacter và ứng dụng của chúng trong cây trồng Việc ứng dụng của Azotobacter trên cây trồng đã được

thử nghiệm thành công trong phòng thí nghiệm và trên đồng ruộng (Becking, 1992) Sử

dụng A chroccocum và Glomus intranradices có lợi cho cây trồng là nhờ sự phân phối

nitơ đã cố định của vi khuẩn cho cây, sự tăng khả năng hòa tan của phospho (M Mirzakhani và cộng sự, 2009) [26], sinh kháng sinh chống lại các nấm có hại như

Aspergillus flavus, Aspergillus terrus, Alternaria alternata, Fusarium oxysporum của A chrococcum (G V Mali và M G Bodhankar, 2009) [18] Sản phẩm hormone thực vật

(như IAA) và vitamin hòa tan cũng được tạo bởi Azotobacter, các chất ngoại sinh này có

hoạt tính sinh học kích thích sự phát triển của cây trồng ở các mức độ khác nhau (Oertli, 1987; Okon và Itzigsohn, 1995) Các hormone thực vật như IAA (indol acetic acid) tạo

ra bởi các chủng Azotobacter được phân lập bởi Farah Ahmad, Iqhal Ahmad và Mohd

Saghir Khan (2004), có tác dụng kích thích sự phát triển của bộ rễ trên cây Điên điểm

(Sesbania aculeata) và cây Đậu xanh (Vigna radiata) [15] Nghiên cứu của Zahera Abbass và Yaacov Okon (1993), cho thấy Azotobacter paspali kích thích sự phát triển

của rễ cây cà chua và lúa mì ở mật độ 108 tế bào/ml [35] M Constantino và cộng sự

(2008), nghiên cứu hiệu quả của vi khuẩn nốt rễ (rhizobacteria) và nấm cộng sinh với

cây bụi (arbuscular mycorrhizal fungi) sự tăng trưởng và năng suất của cây ớt (Capsicum

chinense jacquin) cho thấy hiệu quả cao nhất khi sử dụng vi khuẩn A chroococcum với

năng suất trung bình đạt 2.3-2.5 kg/cây, so với 1 kg/cây khi chỉ sử dụng phân NPK [24] Một nghiên cứu khác của B R Chandrasekar, G Ambrose và N Jayabalan, nghiên cứu

trên loài Cỏ kê (Echinochloa frumentacea) cho thấy cả về hình thái và năng suất đều tốt hơn khi bón kết phân sinh học (Azospirilum và Azotobacter) với phân đạm urea [11] S

Ravikumar và cộng sự (2004), đã phân tích 44 gốc và mẫu đất từ một môi trường sống

rừng ngập mặn của Ấn độ, từ các mẫu đất tác giả đã phân lập được 3 loài Azotobacter (A chroococcum, A virelandii và A beijerinckii), những loài này có khả năng cố định

đạm và sinh phytohormon (IAA) ở độ mặn 30g/lít, và làm tăng đáng kể sinh khối gốc trung bình lên đến 98,2%, chiều dài gốc 48,45%, diện tích lá bằng 277,86%; sinh khối thân bằng 29,49% so với đối chứng và chúng cũng làm tăng hàm lượng chlorophyll và carotenoid tổng số lên đến 151,0% và 158,73% [31] Cũng một

nghiên cứu khác của S Ravikumar và cộng sự (2007), Azotobacter cũng có tác dụng kích thích đáng kể sự sinh trưởng và tạo sắc tố trong cây ngập mặn Mắm ổi (Avicennia

marina) và Dà đỏ (Ceriops decandra), chúng có thể làm tăng trọng lượng gốc khô lên

đến 75.8%, và sinh khối tối đa là 56,12% ở độ mặn 30g/lít [30], các kết quả nghiên cứu này sẽ giúp cải thiện các đặc điểm tăng trưởng của một số loài cây trong rừng ngập mặn với độ mặn cao

Ở nước ta, việc sử dụng các loại phân vi sinh ứng dụng trong trồng trọt còn rất hạn chế, nông dân thường vẫn theo thói quen sử dụng phân hóa học, tuy nhiên việc lạm dụng phân hóa học sẽ dẫn đến bạc màu và xói mòn đất, đặc biệt chúng gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng tới sức khỏe con người và tiêu diệt các loài sinh vật có lợi trong đất dẫn đến làm mất cân bằng hệ sinh thái trong đất Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, trong những năm gần đây việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh trong nông nghiệp được đặc biệt được quan tâm Tuy nhiên phần lớn các nghiên cứu tập trung trên

đối tượng nấm mốc Trichoderma, Bacillus và Streptomyces Azotobacter là một trong

những vi khuẩn cố định đạm tự do phân bố trong đất rất có lợi cho cây trồng được

nghiên cứu rất hạn chế Một số nghiên cứu trên đối tượng Azotobacter như Nguyễn Kim

Anh (2008) trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng đã phân lập và tuyển chọn một số chủng

Azotobacter có hoạt tính nitrogenase và sinh tổng hợp IAA (indol acetic acid) từ đất thôn

Bình Kỳ - Hòa Quý – Ngũ Hành Sơn – Tp Đà Nẵng, tác giả đã phân lập được 8 chủng

Azotobacter có hoạt tính cố định đạm và sinh tổng hợp IAA, sau đó tác giả thử khả năng

nẩy mầm trên hạt đậu đen, kết quả cho thấy khi xử lý hạt đậu đen ở nồng độ 10-2 của dịch nuôi cấy cho kết quả nẩy mầm tốt hơn khi không xử lý [1] Cũng trên đối tượng là

Azotobacter thì nhóm tác giả Trần Tú Thủy và cộng sự (2005) ở viện khoa học kỹ thuật

miền Nam đã nghiên cứu sử dụng vi sinh vật cố định đạm và vi sinh vật phân giải lân để sản xuất phân hữu cơ, nhóm tác giả đã đánh giá hiệu quả của của phân hữu cơ trên cây cải ngọt và cây đậu phộng, kết quả cho thấy trên hai vụ xuân và vụ hè thu thì năng suất của lô khi sử dụng chế phẩm đếu cao hơn so với lô thí nghiệm không dùng chế phẩm là 10-11% [7]

PHẦN 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu phân lập

Các mẫu đất lấy ở các địa điểm khác nhau (Hà Nôi, Lâm Đồng, Đồng Nai, Long An, Tiền Giang, Bến Tre)

2.1.2 Các môi trường dùng trong thí nghiệm

 MT1 Môi trường Ashby [29, 33]