Phương Pháp điện Di DNA Trên Gel Agarose Nguyên Tắc - 123doc

1. Trang chủ >
2. Luận Văn - Báo Cáo >
3. Khoa học tự nhiên >

Phương pháp điện di DNA trên gel agarose Nguyên tắc: Nhân gen bằng kỹ thuật PCR

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.39 MB, 75 trang )

Cặn hòa lại trong 500 – 700 µl 10 glycerol.Chia 100 µl dịch tế bào vào mỗi ống Eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và bảo quản ở – 80°C.Quy trình biến nạp vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điệnVector được đưa qua cột thôi gel để tinh sạch, nồng độ sau khi qua cột tinh sạch là 40 – 50 ngµl.Làm tan tế bào khả biến TBKB trên đá 30 phút.Thêm 5 – 10 µl sản phẩm DNA ngoại lai.Để trên đá 10 phút, cuvet được ngâm cồn, chiếu đèn tím khử trùng rồi làm lạnh trong đá 5 phút, sau đó bổ sung dịch TBKB vào trong cuvet.Xung điện ở 25F, 2,5kV, 400Ω.Bổ sung 800 µl SOC vào cuvet, chia ra 3 ống Eppendorf, lắc ở 28°C trong 2 giờ.Trải đĩa với lượng lần lượt là 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl lên đĩa môi trường đặc YEB có bổ sung rifamycin, kanamycin, ampicillin và nuôi ở 28°C trong 2 ngày.Nhặt nuôi một số khuẩn lạc trong 5 ml – 7 ml YEB bổ sung kháng sinh thích hợp.

2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose Nguyên tắc:

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dưới tác động của dòng điệnmột chiều các đoạn DNA có khối lượng và kích thước khác nhau sẽ di chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương.Quy trình:Agarose 0,8 được đun sơi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50° – 60°C, đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lược thích hợp. Sau khoảng 30 phút, khigel đã đông cứng, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel khoảng 2 mm.Tra mẫu: Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào các giếng trên bản gel.32Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 60 – 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừngvào thời gian phù hợp thường sau khoảng 30 phút.Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 10µ gml trong thời gian 20 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó rửasạch bản gel bằng nước cất.Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di được chụp trên máy Bio –Rad với tia UV có bước sóng 320 nm.

2.2.4. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis và cộng sự sáng chế ra năm đầu những năm 80 của thế 19. Kỹ thuật này cho phép nhân nhanh số lượng không hạn chếnguyên bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen của cơ thể sinh vật. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNApolymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khn trong mơi trường có dư các dNTP và cặpmồi đặc hiệu. Một chu kỳ PCR bao gồm ba bước được lặp lại nhiều lần [25]:Biến tính DNA từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94° – 95°C trong thời gian ngắn.Tiếp hợp đoạn mồi primer thông qua hạ nhiệt độ xuống 50° – 60°C. Hai đoạn mới là các oligonucleotide dài khoảng 15 – 30 base sẽ tổng hợp theo nguyên tắcbổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân.Enzyme polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc hiệu, phản ứng tiếp hợp được thực hiện ở 72°C.Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1X đoạn DNA cần nhân sẽ có 2X đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thựctế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của33hai đoạn mồi. PCR bao gồm các thành phần sau đây:Một đoạn DNA khn.Một cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15 nucleotide – 30 nucleotide.Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate dATP, dTTP, dGTP, dCTP.Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Phản ứng kết thúc, điện di kiểm tra 8 μl sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8.Thành phần phản ứng chạy PCR: dNTPs 10 mM :1 µl Buffer 10 X :2.5 µl Primer F 10 µM:1 µl Primer R 10 µM:1 µl Taq 5 Uul:0.2 µl H2O: 18.3µ lDNA plasmid: 2µ lTổng thể tích: 25µ lChu trình nhiệt cho phản ứng PCR của gen mã hóa xylanase và hph: 94°C 92°C 60°C 72°C 72°C 4°C5 phút 43 giây 1 phút 1 phút25chu kỳ10 phút

2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ

Xem Thêm

Tài liệu liên quan

• Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi
  • 75
  • 1,262
  • 2

Tải bản đầy đủ (.doc) (75 trang)

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(2.06 MB) - Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi-75 (trang) Tải bản đầy đủ ngay ×