Quang Phổ Huỳnh Quang – Phần 3

Phân tích dữ liệu Ở nồng độ thấp, cường độ huỳnh quang sẽ tương ứng với nồng độ của chất fluorophore.

Không giống như trong quang phổ UV / nhìn thấy, ‘tiêu chuẩn’, quang phổ thiết bị độc lập không dễ dàng đạt được. Một số yếu tố ảnh hưởng và bóp méo phổ, và điều chỉnh là cần thiết để đạt được sự thật ‘, nghĩa là máy độc lập, quang phổ. Các loại méo mó khác nhau sẽ được phân loại như là dụng cụ hoặc liên quan đến mẫu. Thứ nhất, sự méo mó phát sinh từ nhạc cụ được thảo luận. Khi bắt đầu, cường độ nguồn ánh sáng và các đặc tính bước sóng khác nhau theo thời gian trong mỗi thí nghiệm và giữa mỗi thí nghiệm. Hơn nữa, không có đèn có cường độ không đổi ở tất cả các bước sóng. Để sửa lỗi này, bộ tách chùm có thể được áp dụng sau khi bộ xử lý đơn sắc hoặc trực tiếp ánh sáng tới phần của máy dò.

Ngoài ra, phải tính đến hiệu quả truyền tải của các đơn sắc và bộ lọc. Những điều này cũng có thể thay đổi theo thời gian. Hiệu suất truyền của máy sắc đơn cũng khác nhau tùy thuộc vào bước sóng. Đây là lý do mà một máy dò tham khảo tùy chọn nên được đặt sau khi đơn sắc kích thích hoặc bộ lọc. Tỷ lệ huỳnh quang thu được bởi máy dò cũng phụ thuộc vào hệ thống. Hơn nữa, hiệu suất lượng tử của máy dò, đó là, tỷ lệ phát hiện các photon, khác nhau giữa các máy dò khác nhau, với bước sóng và thời gian, vì máy dò có thể bị hư hỏng nghiêm trọng.

Hai chủ đề khác cần được xem xét bao gồm quang học được sử dụng để chỉ đạo bức xạ và phương tiện giữ hoặc chứa vật liệu mẫu (được gọi là cuvette hoặc tế bào). Đối với hầu hết các phép đo UV, nhìn thấy và NIR thì cần sử dụng cuvet thạch anh chính xác. Trong cả hai trường hợp, điều quan trọng là lựa chọn vật liệu có sự hấp thụ tương đối ít trong dải bước sóng quan tâm. Quartz là lý tưởng vì nó truyền từ 200 nm-2500 nm; Thạch anh cấp cao hơn thậm chí có thể truyền lên đến 3500 nm, trong khi tính chất hấp thụ của các vật liệu khác có thể che dấu sự huỳnh quang từ mẫu.

Việc hiệu chỉnh tất cả các yếu tố thiết yếu này để có được phổ chuẩn ‘tiêu chuẩn’ là một quá trình tẻ nhạt, nó chỉ được áp dụng trong thực tế khi nó là điều cần thiết. Đây là trường hợp khi đo năng lượng lượng tử hoặc khi tìm ra bước sóng có cường độ phát xạ cao nhất chẳng hạn.

Như đã đề cập ở trên, sự méo mó phát sinh từ mẫu. Do đó, cần phải tính đến một số khía cạnh của mẫu. Thứ nhất, photodecomposition có thể làm giảm cường độ huỳnh quang theo thời gian. Sự tán xạ ánh sáng cũng phải được tính đến. Các loại phổ biến nhất của scattering trong bối cảnh này là Rayleigh và tán xạ Raman. Ánh sáng bị tán xạ bởi tán xạ Rayleigh có cùng bước sóng của ánh sáng tới, Xét thấy trong Raman phân tán những thay đổi ánh sáng tán xạ bước sóng Thông thường với các bước sóng dài hơn. Sự tán xạ Raman là kết quả của một trạng thái điện tử ảo được gây ra bởi ánh sáng kích thích. Từ trạng thái ảo này, các phân tử có thể thư giãn trở lại mức độ rung động khác với trạng thái nền rung động. Trong quang phổ huỳnh quang, nó luôn luôn nhìn thấy ở một số sóng liên tục chênh lệch tương đối so với kích thích số sóng ví dụ đỉnh xuất hiện ở một số sóng thấp hơn so với ánh sáng kích thích trong nước 3600 cm-1.

Các khía cạnh khác để xem xét là các hiệu ứng bộ lọc bên trong. Chúng bao gồm hấp thụ lại. Tái hấp thu xảy ra vì một phân tử hoặc một phần của một đại phân tử hấp thụ tại bước sóng mà tại đó huỳnh quang phát ra bức xạ. Nếu đúng như vậy, một số hoặc tất cả các photon phát ra bởi chất fluorophore có thể được hấp thụ lại. Một hiệu ứng lọc bên trong xảy ra do nồng độ cao của các phân tử hấp thụ, bao gồm chất fluorophore. Kết quả là cường độ kích thích ánh sáng không liên tục trong suốt dung dịch. Kết quả là, chỉ một phần nhỏ của kích thích ánh sáng fluorophores có thể nhìn thấy được cho hệ thống phát hiện. Các hiệu ứng lọc bên trong thay đổi cường độ và cường độ của ánh sáng phát ra và vì vậy chúng phải được xem xét khi phân tích phổ phát xạ của ánh sáng huỳnh quang