Real-time PCR Sử Dụng Probe Làm Chất Phát Huỳnh Quang. - 123doc

1. Trang chủ >
2. Khoa học tự nhiên >
3. Sinh học >

Real-time PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang.

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.06 MB, 25 trang )

chất phát huỳnh quang cho real-time PCR. Trong phạm vi bài này, chúng tôi xin trìnhbày kỹ một số thường được sử dụng hiện nay.a. Real-time PCR sử dụng Taqman probe.Nguyên tắc kỹ thuật real-time PCR sử dụng Taqman probe:Trong kỹ thuật này, real-time PCR mix ngoài các thành phần cơ bản của PCRmix, còn chứa hai thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang được khicó sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là: (1) Taqmanprobe, là những oligonucleotides có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trênDNA đích, và trình tự này dài khoảng 24 đến 30 bases với đầu 5’ có gắn chất pháthuỳnh quang (gọi là reporter) còn đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi làquencher) để hấp phụ được ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter. (2)Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease để có khả năng thủy giải cắtbỏ probe khi probe này bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme kéodài mồi tổng hợp sợi bổ sung. Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe trong cácchu kỳ nhiệt được trình bày minh họa trong hình 25. Có thể tóm tắt như sau: (1) Khichưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probevẫn còn nguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra được từ reporter ở đầu 5’ sẽ bịquencher ở đầu 3’ của probe hấp phụ, ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnhquang khi nhận được nguồn sáng kích thích. (2) Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩmkhuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ởgiai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổnghợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quenchervà phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Càng nhiều sản phẩmkhuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đócường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệuhuỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích.Reporter và quencher của Taqman probe:17Như đã nói ở trên, reporter là một chất gắn vào đầu 5’ của Taqman probe, cókhả năng phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Có nhiều loạihóa chất được sử dụng làmreporter.Quencher là chất cókhả năng hấp phụ được ánhsáng huỳnh quang phát ra từreporter khi reporter nhậnđược ánh sáng kích thích.Có hai loại quencher, đó làquencher phát huỳnh quangvàquencherphátnhiệt.Quencher phát huỳnh quanglà quencher khi hấp phụ ánhsánghuỳnhquangtừreporter sẽ chuyển nănglượng hấp phụ được thành ánh sáng, do vậy quencher sẽ phát ra huỳnh quang nhưngkhông đến được CCD hay cảm biến quang vì bị cản lại bởi kính lọc chỉ dành cho ánhsáng huỳnh quang phát ra từ reporter. TAMRA là một ví dụ minh họa cho quencherphát huỳnh quang, thường được dùng cho taqman probe có reporter là FAM (bảng 6).Dùng quencher phát huỳnh quang sẽ có một trở ngại là huỳnh quang phát ra từquencher có thể trùng với phổ huỳnh quang của reporter của một Taqman probe khác,nếu real-time PCR được thiết kế multiplex, do vậy mà khi chọn lọc reporter choprobe thứ 2 hay thứ 3 thì nhà nghiên cứu phải để ý để tránh trở ngại này. Quencherphát nhiệt là quencher sẽ chuyển năng lượng hấp phụ được thành nhiệt, ví dụDABCYL hấp phụ huỳnh quang bước sóng 425, BHQ0 hấp thụ huỳnh quang bướcsóng 430-520 (tối ưu 493), BHQ1 hấp thụ huỳnh quang 480-580 (tối ưu 534), BHQ2hấp thụ huỳnh quang 560-670 (tối ưu 579), BHQ3 hấp thụ huỳnh quang 620-730 (tốiưu 672). Quencher phát nhiệt hiện nay được ưa chuộng hơn quencher phát huỳnhquang vì khả năng hấp phụ huỳnh quang rất mạnh, các BHQ được xem như các lỗ đen(black hole quencer, BHQ) hút lấy tất cả các huỳnh quang từ reporter không cho bất cứhuỳnh quang nào phát ra được từ reporter, đồng thời rất dễ dàng để thiết kế các taqman18probe dùng cho multiplex PCR mà không lo đến phổ huỳnh quang của các reporter cóbị trùng với phổ huỳnh quang của quencher vì quencher không hề phát huỳnh quang.Bảng 6: Trình bày các reporter hiện nay đang được các nhà nghiên cứu sử dụng cùng với bước sóng kíchthích, huỳnh quang phát ra, và quencher tương ứngTên reporterBước sóngthíchFAMBHQ1TAMRA495TET521TEXAS REDDABCYLVIC557590Bước sóngHQ phát ra520583536610Quencher kíchTAMRA, DABCYL,BHQ2, DABCYLBHQ1, DABCYLBHQ2, BHQ3,Tên reporterCy3TMBước sóngthích548Bước sóng HQphát ra566Quencher kíchBHQ2522544BHQ1Cal Fluor Orange 560538559BHQ1Cal Fluor Red 590569591BHQ2Cal FluorGold 540538554BHQ1Cal Fluor Red 610590610BHQ2BHQ1, BHQ3,Cal Fluor Red 635618637BHQ2HEXDABCYLJOE535556529555Cy5647667BHQ2, BHQ3Pulsar 650Cy5.5690705BHQ2RoxDABCYL586610BHQ2, BHQ3,BHQ1LC red 640618637BHQ2460650BHQ2Quasar 670647667BHQ2Quasar 705690705BHQ3Thiết kế mồi và Taqman probeThiết kế mồi cho real-time PCR dùng Taqman probe cũng theo các qui luậtthiết kế mồi chung cho PCR (trình bày trong phần thiết kế mồi dành real-timePCR dùng màu huỳnh quang chèn). Trong real-time PCR dùng Taqman probe thìnên thiết kế mồi có nhiệt độ chảy khoảng 55oC - 60oC và thấp hơn nhiệt độ chảycủa Taqman probe khoảng 5oC - 10oC. Để thiết kế Taqman probe, nên thiết kế đểkhông dài quá 30 bases, tỷ lệ GC trong probe khoảng 30-80 % với C nhiều hơn G,vị trí bắt cặp của đầu 5’ của Taqman probe chỉ 2-5 bases cách vị trí 3’ của mồi bắtcặp trên cùng sợi đích, và rất quan trọng là đầu 5’ gắn reporter không phải là G vìG có thể là quencher cho rất nhiều reporter. Có thể sử dụng phần mềm BeaconDesigner để thiết kế mồi và Taqman probe. Phần mềm này được cấp miễn phí chocác phòng thí nghiệm mua máy PCR iCycler cua Biorad. Ngoài ra, việc chọnreporter và quencher cũng là một vấn đề hết sức quan trọng. Xin tham khảo bảng 6để có nhiều khả năng lựa chọn cho phù hợp.Khi thiết kế mồi cho real-time PCR dùng Taqman probe thì cũng nên lưuý để chiều dài sản phẩm khếch đại trong khoảng 75-150 bps, không nên quá 150bps để hiệu quả PCR có thể đạt được tối hảo. Tuy nhiên trên thực tế cũng còn tùythuộc vào DNA đích có cho phép chúng ta chọn được mồi đạt được tối hảo để có19sản phẩm khuếch đại đạt như vậy hay không. Công ty Nam Khoa đã có bộ thửnghiệm RT real-time PCR sử dụng Taqman probe để phát hiện và định lượng HCVRNA dựa trên sự khuếch đại sợi cDNA đích dài 240 bps phiên mã ngược từ vùng5’NC của bộ gene của virus mà vẫn đạt được hiệu quả PCR tối hảo thể hiện qua E% luôn đạt 90-105 % (biểu đồ 6); cũng chính nhờ vậy mà công ty triển khai đượcthử nghiệm giải trình tự sản phẩm real-timePCR này để xác định được genotypecủa HCV nhiễm trên bệnh nhân.Chương trình luân nhiệt realPCR dùng taqman probe thường chỉgiai đoạn nhiệt độ là: biến tínhtimecóhaio94– 95 Cgiây, kế đó là giaiđoạnvừa bắt cặp vừa kéo dài ở 60oCtrong30-60 giây và thiết bị real-time sẽhoạtđộng ở giai đoạn này. Ở giai đoạnnhiệttrong 15 – 30osẽ bắtcặp vàosợi đích trước vì đây là nhiệt độ bắtcặp tốihảo của Taqman probe (thấp hơnTm củaTaqman probe là 65 – 70oC, nhưngbằngđộ 60 C thì Taqman probehay cao hơn Tm của mồi là 55oC - 60oC) rồi sau đó mồi mới bắt cặp vào. Chính nhờvậy mà khi Taq polymerase tổng hợp sợi bổ sung, enzyme này mới có cơ hội thủy giảiđược Taqman probe cản đầu nó. Nếu mồi bắt cặp trước vào sợi đích thì sẽ không cócơ hội để Taqman probe bắt cặp vào sợi đích và như vậy thì Taqman probe sẽ khôngthể bị thủy giải khi enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi bổ sung. Đây chính là lýdo giải thích tại sao phải thiết kế mồi có Tm khoảng 55-60oC và thấp hơn Tm củaTaqman probe 5oC - 10oC.b.Real-time PCR sử dụng Beacon probe.Trong kỹ thuật này, probe được sử dụng có tên là Beacon molecular probe. Đâylà probe có trình tự dài khoảng 25-40 bases, có đầu 5’ gắn với reporter và đầu 3’ gắn20với quencher. Probecótrình tự 15-39 basesởgiữa là bổ sung vớimột trình tự đặc hiệutrênmột sợicủaDNA đích, còn haiđầu của probe thìmỗi đầu có một trìnhtự5-6 bases bổ sung vớinhau làm cho probetạo thành cấu trúchình kẹp tóc do trìnhtựcủa hai đầu bắt cặpnhau. Cơ chế hoạt động của Beacon probe được minh họa trong hình 26, tóm tắt nhưsau:(1) Ở giai đoạn nhiệt độ biến tính, cấu trúc kẹp tóc của Beacon probe không cònnên nếu ở giai đoạn này reporter nhận nguồn sáng kích thích thì nó sẽ phát huỳnhquang.(2) Ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, nếu chưa có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu,Beacon probe sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thíchvì cấu trúc kẹp tóc của hai đầu đã làm cho reporter gần với quencher khiến tất cả huỳnhquang phát từ reporter đều bị quencher hấp phụ. Nhưng nếu có mặt sản phẩm khuếchđại đặc hiệu, Beacon probe sẽ bắt cặp vào trình tự đặc hiệu trên sợi đích của sản phẩmkhuếch đại, nhờ vậy reporter cách xa quencher nên reporter phát được huỳnh quang khinhận nguồn sáng kích thích.(3) Trong giai đoạn nhiệt độ kéo dài, enzyme Taq polymerase không thủy giảiBeacon probe mà chỉ làm tách Beacon probe khỏi sợi đích khi sợi bổ sung được tổnghợp kéo dài đến trình tự mà probe bắt cặp vào. Cuối giai đoạn kéo dài, Beacon probetách khỏi sợi đích và trở lại cấu trúc kẹp tóc nên không cho reporter phát được huỳnhquang nếu nhận được nguồn sáng kích thích.21V.ĐỌC KẾT QUẢ REAL TIME PCR.Thông số đầu tiên là hệ số tương quan R 2 đánh giá độ chính xác của thao tácpipetting lấy có đúng thể tích mong muốn hay không. Trị số R 2 phải đạt là trên haybằng (≥) 0.99 có nghĩa là đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao. Khi ngườilàm thử nghiệm không lấy được các thể tích chính xác thì chắc chắn các thể tích mẫuchuẩn cho vào real-time PCR mix sẽ không thể nào chính xác được, nên R2 chắc chắnsẽ không thể nào đạt ≥ 0.99.Một trị sốngườithửnghiệm phải biết rõ đó làPCR,được gọi là E% (PCRefficiency). Một khiPCR đạt hiệu quả lýtưởng, thì cứ saumỗi chu kỳ nhiệt cườngđộquangtrong một ống phản ứngphải tăng gấp đôi,còn nếu ở hai ống phảnứng có số lượngbản DNA đích ban đầucách nhau một hệsố pha loãng A, thì haiđườngkhuếch đại sẽ cách nhauhiệulàmnữa rất có giá trị màquảhuỳnhbiểudiễnn chu kỳ với cường độ huỳnh quang của hai ống phản ứng cũng sẽ cách nhau một hệsố pha loãng A = 2n. Như vậy, nếu độ pha loãng là 10 lần thì Ct của các độ pha loãngDNA đích của mẫu chuẩn liên tiếp nhau sẽ cách nhau là 3.32 chu kỳ (tính toán từ côngthức trên với A = 10, sẽ tính được n = 3.32 chu kỳ).Trong biểu đồ chuẩn với các mẫu chuẩn cách nhau qua độ pha loãng hệ số 10thì hiệu quả khuếch đại E được tính là bằng công thức 10-1/slope với slope chính là độđốc của đường biểu diễn chuẩn. Một cách lý tưởng, hiệu quả khuếch đại E của PCRphải đạt được là 2 nghĩa là số lượng bản sao nhân bản từ bản DNA đích phải tăng gấpđôi sau mỗi chu kỳ nhiệt trong giai đoạn tăng trưởng lũy thừa, tức là 2 = 10-1/slope.Từ công thức này, chúng ta sẽ tính ra được đường biểu diễn chuẩn lý tưởng phải có độđốc (slope) là -3.32. Như vậy, chúng ta thấy độ dốc chính là sự cách biệt nhau về chukỳ ngưỡng giữa các ống chuẩn có số lượng giảm dần theo hệ số pha loãng 10. Hiệuquả khuếch đại cũng có thể tính bằng phần trăm (%) với công thức tính từ E là: E% =(E-1) x 100%. Với E đạt lý tưởng là 2 thì E% = 100 %. Đối với bất cứ một đường biểudiển chuẩn nào, đều có thể tính được hiệu quả khuếch đại E % = (10-1/slope – 1) x22100 %. Do vậy nếu độ dốc của một đường biểu diễn chuẩn là -3.436 thì E sẽ là 10-(1/3.436) = 1.954, vậy thì hiệu quả % của khuếch đại (hiệu quả PCR) sẽ là: E % = (1.954– 1) x 100% = 95.4 %, có nghĩa là trong giai đoạn tăng trưởng lũy thừa số lượng bảnsao sau mỗi chu kỳ nhiệt sẽ được nhân lên 1.954 lần hay hiệu quả PCR là 95.4 %. Dĩnhiên hiệu quả PCR lý tưởng là 100 %, nhưng trong thực tế thì hiệu quả PCR chấpnhận được phải trong khoảng 90 % - 105 %.Người làm thí nghiệm phải biết dùng hiệu quả PCR hiển thị trong biểu đồchuẩn để đánh giá thao tác pipetting để pha loãng mẫu của mình. Sai lầm đầu tiên cóthể gặp trong thao tác pha loãng mẫu là mang lượng DNA đích từ mẫu nồng độ caoxuống mẫu có nồng độ thấp hơn, mà thường là do không thay đầu pipette sau khimang thể tích từ nồng độ cao xuống nồng độ thấp, vì vậy mà số lượng bản DNA đíchcó trong các mẫu chuẩn được pha loãng sẽ nhiều hơn tính toán. Ví dụ nếu thao tác phaloãng chính xác, thì từ 10.000 copies xuống 1.000 copies rồi 100 copies sẽ chính xácnhư vậy; nhưng nếu không thay đầu pipette sau mỗi lần hút mẫu và lượng bản đíchmang theo ở đầu pipette là 40% thì chúng ta sẽ có các số lượng sẽ là 10.000 copiesxuống 4.000 copies rồi 1.600 copies.Vì vậy nên hiệu quả PCR được tính toán bằng giá trị E sẽ không đạt được lýtưởng 90 % đến 105 % mà sẽ cao hơn 105 %. Lý do là chu kỳ ngưỡng của các mẫuchuẩn sẽ bị gần nhau hơn làm cho độ dốc của đường biểu diễn chuẩn thấp đi. Ngượclại nếu thao tác pha loãng mà không cho đủ thể tích mẫu chuẩn hút từ mẫu có số lượngDNA chuẩn cao để pha mẫu chuẩn lượng thấp hơn (sai lầm này có thể gặp khi dùngcác đầu pipette bị dính dung dịch trên thành nên không đẩy được hết lượng mẫu từ đầupipette xuống mẫu kế), và chính như vậy nên chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn liêntiếp nhau sẽ cách xa nhau làm cho độ dốc của đường biểu diễn chuẩn thấp đi, và hiệuquả PCR sẽ dưới 95 %. Hiệu quả PCR cũng là một thông số rất có giá trị để nhànghiên cứu tối ưu được kỹ thuật real-time PCR mà mình. Nếu hiệu quả PCR thấp thìnguyên do có thể là thiết kế mồi chưa đạt độ nhạy, do tách chiết DNA đích còn các ứcchế ngăn cản phản ứng khuếch đại. Nếu hiệu quả PCR cao thì nguyên do lại có thể làdo sự bắt cặp không đặc hiệu của mồi hay của đoạn dò.Như vậy, việc thiết lập biểu đồ chuẩn là rất cần thiết khi làm real-time PCRchẩn đoán, đặc biệt khi để xác định chính xác số lượng tác nhân đích ban đầu có trongmẫu thử. Biểu đồ chuẩn có công dụng trước tiên là đánh giá được thao tác pipetting23

Xem Thêm

Tài liệu liên quan

• BÁO CÁO BÀI SEMINAR CHỦ ĐỀ : CHẤT KÍCH KHÁNG Ở THỰC VẬT
  • 25
  • 835
  • 2
• Giáo án toán 9(Đại số 3 cột t19-37)
  • 154
  • 1
  • 0

Tải bản đầy đủ (.docx) (25 trang)

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(3.08 MB) - BÁO CÁO BÀI SEMINAR CHỦ ĐỀ : CHẤT KÍCH KHÁNG Ở THỰC VẬT-25 (trang) Tải bản đầy đủ ngay ×