RealTime PCR Là Gì? - Thiết Bị Bình Phú

Pcr là kỹ thuật nhân bản AND thành nhiều phần giống nhau, tuy nhiên nó chỉ có một hạn chế là không thể xác định thời gian thực trong quá trình phân tách ADN. Vì vậy mà một kỹ thuật mới được áp dụng để giải quyết vấn đề này là phương pháp real time PCR.

RealTime PCR là phương pháp gì?

Kỹ thuật PCR thông thường, sản phẩm DNA khuếch đại hoặc amplicon, được phát hiện trong một phân tích điểm cuối. Trong PCR read time, sự tích lũy của sản phẩm khuếch đại được đo khi tiến trình phản ứng diễn ra, theo thời gian thực, với định lượng sản phẩm sau mỗi chu kỳ.

Đầu tiên, các phản ứng khuếch đại được thiết lập với các thuốc thử PCR và các đoạn mồi hoặc tùy chỉnh. Các phản ứng sau đó được chạy trong các công cụ PCR thời gian thực và dữ liệu thu thập được phân tích bằng phần mềm công cụ độc quyền.

Việc phát hiện các đoạn AND được nhân bản PCR trong thời gian thực được kích hoạt bằng cách đưa vào một phân tử phóng viên huỳnh quang trong mỗi phản ứng để mang lại sự phát huỳnh quang với số lượng DNA sản phẩm ngày càng tăng. Các hóa chất huỳnh quang được sử dụng cho mục đích này bao gồm thuốc nhuộm gắn kết DNA và mồi hoặc đầu dò đặc hiệu theo trình tự huỳnh quang.

Các chu trình nhiệt chuyên dụng được trang bị các môđun phát hiện huỳnh quang được sử dụng để theo dõi tín hiệu huỳnh quang khi khuếch đại xảy ra. Các huỳnh quang đo được tỷ lệ thuận với tổng số lượng của amplicon. Sự thay đổi huỳnh quang theo thời gian được sử dụng để tính toán số lượng amplicon được tạo ra trong mỗi chu kỳ.

Ưu điểm chính của realtime PCR là cho phép bạn xác định số lượng bản sao ban đầu của DNA mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao trên phạm vi động rộng. Kết quả Realtime PCR có thể là định tính (sự hiện diện hay vắng mặt của một chuỗi) hoặc định lượng (số bản sao). Định lượng RealtimePCR do đó còn được gọi là phân tích qPCR.

Ngoài ra, dữ liệu qPCR thời gian thực có thể được đánh giá mà không có điện di gel, dẫn đến giảm thời gian chờ đợi và tăng thông lượng. Cuối cùng, vì các phản ứng qPCR thời gian thực được chạy và dữ liệu được đánh giá trong hệ thống qPCR thống nhất, khép kín, cơ hội giảm ô nhiễm và nhu cầu xử lý postamplification được loại bỏ trong phân tích qPCR.

Những ứng dụng của Realtime PCR

Các xét nghiệm PCR hay qPCR thời gian thực đã trở thành công cụ được lựa chọn để xác định nhanh chóng định lượng axit nucleic trong các mẫu sinh học khác nhau, với các ứng dụng đa dạng như phân tích biểu hiện gen, phát hiện sinh vật biến đổi gen trong thực phẩm và kiểu ung thư .

Trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu, các xét nghiệm qPCR được sử dụng rộng rãi cho phép đo định lượng số lượng sao chép gen (liều lượng gen) trong các dòng tế bào được chuyển đổi hoặc sự hiện diện của các gen đột biến.

Kết hợp với PCR phiên mã ngược (RT-PCR), các xét nghiệm qPCR có thể được sử dụng để định lượng chính xác những thay đổi trong biểu hiện gen, ví dụ, tăng hoặc giảm biểu hiện để đáp ứng với các điều kiện môi trường khác nhau hoặc điều trị bằng thuốc. mức mRNA.

Nguyên lý hoạt động của Realtime PCR

Để hiểu cách thức hoạt động của PCR thời gian thực, mình sẽ minh họa một phân tích qPCR sử dụng một cơ chế khuếch đại điển hình. Trong ví dụ này, số chu kỳ PCR được hiển thị trên trục x, và huỳnh quang từ phản ứng khuyếch đại, tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm khuếch đại trong ống, được hiển thị trên trục y.

Ban đầu, huỳnh quang vẫn ở mức nền, và tăng huỳnh quang không thể phát hiện được  mặc dù sản phẩm tích lũy theo cấp số nhân. Cuối cùng, sản phẩm khuếch đại đủ tích lũy để mang lại tín hiệu huỳnh quang phát hiện được. Số chu kỳ mà tại đó điều này xảy ra được gọi là chu trình định lượng, hoặc C q . Do giá trị C q được đo trong pha mũ khi các thuốc thử không giới hạn, qPCR thời gian thực có thể được sử dụng để tính toán chính xác số lượng mẫu ban đầu có trong phản ứng dựa trên hàm mũ đã biết mô tả tiến trình phản ứng.

Cq của một phản ứng được xác định chủ yếu bởi số lượng mẫu có mặt tại sự bắt đầu của phản ứng khuếch đại. Nếu một lượng lớn mẫu có mặt khi bắt đầu phản ứng, thì cần có ít chu kỳ khuếch đại để tích lũy đủ sản phẩm để tạo ra tín hiệu huỳnh quang trên nền. Như vậy, phản ứng sẽ có mức thấp. Ngược lại, nếu một lượng nhỏ mẫu có mặt khi bắt đầu phản ứng, thì cần có thêm chu kỳ khuếch đại để tín hiệu huỳnh quang tăng lên trên nền. Như vậy, phản ứng sẽ có một cao, hoặc muộn, C q . Mối quan hệ này tạo cơ sở cho khía cạnh định lượng của PCR thời gian thực.

Việc sử dụng nguyên lý realtime pcr giúp mang lại hiệu quả cao hơn so với kỹ thuật pcr thông thường. Tuy nhiên tùy trường hợp mà bạn nên lựa chọn cho mình một giải pháp thích hợp nha.