RT-qPCR – Các Nguyên Lý Cơ Bản - BioMedia Vietnam Group

BioMedia

PCR phiên mã ngược định lượng (RT-qPCR) là kỹ thuật PCR định lượng với khuôn ban đầu là ARN. ARN được phiên mã ngược thành ADNc và sử dụng làm khuôn cho phản ứng qPCR. Kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực bao gồm phân tích biểu hiện gen, xác nhận iARN (RNAi validation), xác nhận microarray (microarray validation), phát hiện sinh vật gây bệnh, thử nghiệm di truyền và nghiên cứu bệnh.

1. RT-qPCR một bước và hai bước

RT-qPCR có thể được tiến hành theo phương thức một bước và hai bước. Với kiểu RT-qPCR một bước, giai đoạn tổng hợp ADNc và qPCR được tiến hành trong cùng một ống phản ứng bằng cùng một enzym. Phương thức này chỉ có thể sử dụng mồi đặc hiệu. Ngược lại, với phương thức RT-qPCR hai bước, giai đoạn tổng hợp ADNc và qPCR được tiến hành trong hai ống phản ứng riêng biệt với enzym, đệm, thành phần và điều kiện phản ứng được tối ưu cho mỗi giai đoạn. Ưu và nhược điểm của hai phương thức RT-qPCR này được trình bày trong Bảng 1.

Bảng 1. So sánh hai phương thức RT-qPCR một bước và hai bước

Ưu điểm	Nhược điểm
Một bước	– Ít sai số do cả hai phản ứng diễn ra trong cùng một ống phản ứng – Giảm nguy cơ nhiễm do ít thao tác pipet – Phù hợp cho những ứng dụng khuếch đại/sàng lọc có đầu vào mẫu cao, nhanh và ổn định	– Không thể tối ưu riêng biệt cho hai giai đoạn của phản ứng – Ít nhạy hơn RT-qPCR hai bước do thành phần phản ứng phải cân đối cho cả 2 phản ứng phiên mã ngược và qPCR – Phát hiện được ít gen đích hơn trong một mẫu
Hai bước	– Tạo ra hỗn hợp ADNc bền,có thể lưu trữ lâu dài và dùng cho nhiều phản ứng – Cho phép khuếch đại cùng lúc gen đích và gen tham chiếu – Mỗi giai đoạn của phản ứng đều được tối ưu hóa – Nhiều lựa chọn mồi phiên mã ngược	– Sử dụng nhiều ống phản ứng và thao tác pipet tăng nguy cơ nhiễm ADN và tốn thời gian hơn – Cần tối ưu nhiều hơn RT-qPCR một bước

Hình 1. So sánh hai phương thức RT-qPCR một bước và hai bước

2. Lựa chọn giữa ARN tổng số và mARN

Phản ứng RT-qPCR yêu cầu khuôn là ARN, ARN này có thể nằm trong hỗn hợp ARN tổng số hoặc chỉ riêng mARN. Tách chiết ARN tổng số đòi hỏi ít bước thực hiện hơn tinh sạch riêng mARN giúp cho hiệu suất tách chiết cao hơn đồng thời thuận lợi hơn khi định mức lượng tế bào đầu vào. Ngoài ra, do không có bước làm giàu riêng mARN, sử dụng ARN tổng số không gây khác biệt trong hiệu suất tách chiết các loại mARN khác nhau. Tuy sử dụng mARN tinh sạch giúp phản ứng có độ nhạy cao hơn một chút, nhưng do với phản ứng PCR định lượng, trong phần lớn các ứng dụng, định lượng tương đối của các ARN đích quan trọng hơn định lượng tuyệt đối của chúng, nên những ưu thế trên của ARN tổng số khiến cho đây là vật liệu khởi đầu phù hợp cho phản ứng RT-qPCR.

3. Mồi cho phản ứng phiên mã ngược

Phương thức RT-qPCR hai bước cho phép sử dụng nhiều loại mồi khác nhau trong phản ứng phiên mã ngược (Hình 2, Bảng 2). Mồi này sẽ liên kết bổ sung với khuôn ARN và làm điểm bắt đầu cho phản ứng tổng hợp ADNc. Hai loại mồi thường được dùng phổ biến là oligo dT và mồi ngẫu nhiên.

Hình 2. Các loại mồi khác nhau cho phản ứng phiên mã ngược

Bảng 2. Các mồi được sử dụng cho bước tổng hợp ADNc của RT-qPCR. Mồi oligo dT và mồi ngẫu nhiên thường được kết hợp sử dụng để tăng hiệu suất phiên mã ngược và độ nhạy của qPCR

Các loại mồi	Cấu trúc và chức năng	Ưu điểm	Nhược điểm
Oligo dT (hoặc Oligo dT dạng neo)	– Là một chuỗi Timin (sẽ liên kết với đuôi polyA của các mRNA).- Oligo dT dạng neo có thêm G,C hoặc A ở đầu 3’	– Giúp tổng hợp ARN nguyên vẹn từ mARN có đuôi polyA- Phù hợp với lượng mẫu sử dụng ít- Cấu trúc neo đảm bảo mồi sẽ liên kết vào đuôi polyA ở đầu 5’ của mARN	– Chỉ giới hạn với các mARN có đuôi polyA- ADNc dễ bị thiếu đoạn nếu oligo dT bám vào đoạn polyA ở giữa của mARN- Ưu tiên nhân lên đoạn 3’ của mARN
Mồi ngẫu nhiên	Dài khoảng 6-8 nucleotide, liên kết với rẩt nhiều vị trí trên ARN	– Sử dụng được với tất cả các loại ARN (rARN, mARNvà tARN)- Phù hợp cho các khuôn ARN có nhiều vùng cấu trúc bậc hai, hoặc lượng mẫu đầu vào thấp- Hiệu suất tổng hợp ADNc cao	– ADNc được tổng hợp từ tất cả các ARN, trong đó có nhiều ARN không mong muốn làm giảm tín hiệu từ mARN- ADNc không nguyên vẹn
Mồi đặc hiệu	Được thiết kế đặc hiệu trên đoạn trình tự đích	– Tổng hợp các ADNc đặc hiệu- Tăng độ nhạy- Là chính mồi ngược của cặp mồi qPCR	Chỉ tổng hợp được ADNc từ một gen đích

Enzym phiên mã ngược

Đây là loai enzym tiến hành phản ứng phiên mã ngược, tổng hợp ADNc từ khuôn ARN. Một số enzym có hoạt tính RNAse cho phép phân hủy khuôn ARN sau khi đã tổng hợp ADNc. Nếu enzym không có hoạt tính này, có thể cần bổ sung RNAse nhằm tăng hiệu quả của qPCR. Loại enzym phiên mã ngược thường dùng là enzym phiên mã ngược của virus ung thư bạch cầu chuột moloney (M-MLV) và virus cúm gia cầm (AMV). Tiêu chuẩn của một enzym phiên mã ngược lý tưởng cho phản ứng RT-qPCR là có độ bền nhiệt tốt, cho phép tổng hợp hiệu quả ADNc ở nhiệt độ cao trên những khuôn ARN có nhiều vùng cấu trúc bậc hai.

Hoạt tính của RNAse H trong RT-qPCR

RNAse H có hoạt tính phân giải khuôn ARN trong cấu trúc mạch đôi ARN-ADN giúp tăng hiệu suất tổng hợp mạch đôi ADN từ ADNc. Tuy nhiên với những mARN dài, ARN có thể bị phân hủy dẫn đến ADNc tổng hợp bị ngắn đi, do vậy hoạt tính RNAse H thường bị hạn chế để có thể nhân dòng ADNc từ những mARN dài. Ngược lại, những enzym phiên mã ngược có tích hợp hoạt tính RNAse H thường được ưa chuộng hơn trong phản ứng RT-qPCR bởi chúng tăng cường khả năng biến tính cấu trúc mạch kép ARN-ADN trong chu kỳ đầu tiên của PCR (hình 3).

Thiết kế mồi qPCR

Cặp mồi lý tưởng cho phản ứng qPCR trong RT-qPCR thường được thiết kế nằm trùm qua vị trí nối giữa hai exon. Một trong hai mồi sẽ nằm vắt ngang vị trí nối giữa 2 exon này, khiến cho mồi chỉ bắt cặp đặc hiệu với ADNc mà không thể liên kết với ADN tổng số do ở ADN tổng số chứa intron nằm xen giữa các exon (Hình 4). Thiết kế này giúp loại bỏ nguy cơ khuếch đại nhầm ADN tổng số.

Nếu không thể thiết kế mồi trùm qua vị trí nối giữa exon hoặc nằm trên 2 exon được ngăn cách bới intron dài, cần phải xử lý mẫu ARN với enzyme RNAse-free DNAse I hoặc ds-DNAse để loại bỏ ADN tổng số.

Đối chứng cho RT-qPCR

Đối chứng phiên mã ngược âm thường được đi theo tất cả các thí nghiệm RT-qPCR nhằm kiểm tra sự nhiễm ADN (ADN tổng số hoặc sản phẩm PCR từ những thí nghiệm trước đó). Đối chứng này chứa toàn bộ những thành phần của phản ứng trừ enzym phiên mã ngược. Phản ứng phiên mã ngược không thể diễn ra, do vậy nếu sản phẩm khuếch đại được phát hiện trong đối chứng âm này, thì rất có thể chúng bắt nguồn từ ADN nhiễm vào.

Dịch và tổng hợp từ Thermo Scientific

BioMedia VN