Sử Dụng Chứng Nội Trong Xét Nghiệm Sinh Học Phân Tử

Ngày nay, kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng rất rộng rãi trong trong chẩn đoán phòng thí nghiệm với các thiết bị hỗ trợ ngày càng hiện đại như các máy luân nhiệt PCR, máy định lượng Real time PCR, hay máy giải trình tự gen Sanger và máy giải trình tự gen thế hệ mới,…

Trong xét nghiệm sinh học phân tử, việc sử dụng chứng dương và chứng âm là điều bắt buộc. Chứng dương là mẫu chứng có chứa đoạn ADN/ARN mục tiêu đã được biết trước (như các chủng chuẩn, chủng phân lập, mẫu ADN/ARN chuẩn, mẫu ADN nhân tạo), từ đó để so sánh và đánh giá mẫu thử. Chứng âm là mẫu chứng không chứa ADN/ARN mục tiêu (thường sử dụng là nước cất) để kiểm soát quá trình nhiễm chéo khi thực hiện phản ứng. Việc chẩn đoán các gen mục tiêu phụ thuộc rất nhiều vào quá trình chiết tách axit nucleic. Quá trình chiết tách nếu có sai sót sẽ dẫn đến âm tính giả hay định lượng không chính xác đối với các xét nghiệm định lượng. Để kiểm soát quá trình chiết tách, các nhà khoa học đã nghiên cứu các loại chứng nội (Internal control) để áp dụng xét nghiệm cùng với mẫu thử, nhằm đảm bảo quá trình chiết tách là đạt yêu cầu. Chứng nội còn có thể giúp đánh giá cả chất lượng của mẫu bệnh phẩm ban đầu.

Chứng nội thường được sử dụng là các gen luôn biểu hiện bên trong tế bào, còn gọi là các gen giữ nhà (house keeping genes) như Rnase P, GAPDH, beta-actin, beta-globin, 18s rARN… Sự biểu hiện của các gen này hầu như cũng ít biến đổi, nên còn được dùng trong các xét nghiệm định lượng (như xét nghiệm đo tải lượng vi rút, xét nghiệm đo mức độ biểu hiện gen,..) để hạn chế ảnh hưởng của hàm lượng ADN/ARN do sai sót trong quá trình chiết tách. Một số chứng nội được mô tả như:

Rnase P (Rinonuclease P): là một ribonucleoprotein bao gồm nhiều tiểu đơn vị protein có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp các ARN vận chuyển (tARN). Rnase P có ở tất cả các tế bào vi khuẩn, nấm men, đến tế bào động vật và người. Rnase P có chức năng như một enzyme, có khả năng nhận diện trình tự đặc biệt của tiền tARN và bám vào các tiền tARN để xúc tác phản ứng chuyển hóa các tiền tARN thành các tARN trưởng thành. Rnase P hoạt động trong nhân của tế bào, và vì là một enzyme cần thiết cho tARN mang axit amin cho việc tổng hợp bất cứ protein nào nên nó luôn được biểu hiện bên trong tế bào. Trong các xét nghiệm chẩn đoán vi rút, mẫu bệnh phẩm thường là những mẫu tế bào, như tế bào biểu mô đường hô hấp (mẫu dịch ngoáy họng, ngoáy mũi), tế bào máu (mẫu máu, huyết thanh, huyết tương)…., quá trình chiết tách vật liệu di truyền của vi rút từ mẫu bệnh phẩm sẽ đồng thời chiết tách ARN/ADN tổng số có trong mẫu bệnh phẩm, trong đó luôn có Rnase P của tế bào chủ. Do vậy, sự hiện diện của Rnase P vừa đảm bảo quá trình chiết tách đạt yêu cầu, vừa cho thấy mẫu bệnh phẩm đã được lấy đúng cách.

GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase): là một enzyme có trọng lượng phân tử khoảng 37 kDa. Như tên gọi của nó, GAPDH xúc tác chuyển hóa glyceraldehyde 3-phosphate thành D-glycerate 1,3-bisphosphate. Đây là bước thứ 6 trong quá trình glycolysis, một con đường quan trọng giúp chuyển hóa glucose thành năng lượng sống cho tế bào xảy ra trong bào tương của tất cả các tế bào nhân chuẩn. GAPDH thường được sử dụng làm chứng nội trong các chẩn đoán biểu hiện gen của tế bào ung thư.

Beta-actin: là một trong 6 đồng phân của phân tử actin (alpha, beta, gamma,….) là cấu tạo của bộ xương tế bào có vai trò trong việc định hình, và di chuyển của tế bào. Biểu hiện của beta-actin thường rất ổn định nên thường được sử dụng làm chứng nội cho các xét nghiệm định lượng PCR và western bloting. Cũng giống như GAPDH, beta-actin thường được sử dụng làm chứng nội trong các chẩn đoán biểu hiện gen của tế bào ung thư.

Ngoài việc sử dụng chứng nội là các gen nội bào (Endogenous IC), còn có thể sử dụng các ADN bên ngoài trong quá trình chiết tách (Exogenous IC). Trong chẩn đoán các ARN vi rút, ARN của vi rút gây bệnh tả ở bò BVDV (bovine viral diarrhea virus) thường được cho vào mẫu bệnh phẩm trong quá trình chiết tách, đối với chẩn đoán các ADN vi rút, ADN của vi rút herpes ngựa EHV (equine herpes virus 1) lại thường được sử dụng làm chứng nội.

Khi sử dụng chứng nội cần lưu ý đến một số vấn đề như: mồi của các gen mục tiêu có thể bắt cặp chéo với trình tự của chứng nội, nồng độ của chứng nội có thể ức chế phản ứng phát hiện tác nhân mục tiêu (nhất là đối với các chứng nội bên ngoài), phản ứng của chứng nội có thể cạnh tranh về enzyme, nguyên liệu phản ứng với tác nhân mục tiêu. Do đó, phản ứng chứng nội thường được thực hiện riêng. Trong trường hợp kết hợp chung với các tác nhân mục tiêu, chứng nội phải được tính toán kỹ về nồng độ và hàm lượng. Các chứng nội tóm lại cần có những tính chất như: là chứng kiểm soát cho quá trình chiết tách; có thể áp dụng cho nhiều xét nghiệm; có thể phân biệt được lỗi do chiết tách và lỗi phản ứng; hàm lượng thường ổn định, được thiết kế không cạnh tranh với gen mục tiêu. Việc sử dụng chứng nội có thể làm tăng chi phí của xét nghiệm, nhưng đó là chứng được khuyến khích sử dụng giúp đảm bảo chất lượng của các kết quả xét nghiệm sinh học phân tử.

Tài liệu tham khảo:

1. Sharma, Duli Chand, Anurag Shukla, Man Singh, Ravi Kumar Govil, Banke Bihari, Aditya Saxena, A.K. Bhatia, R.K. Singh, InteARNl Controls for the Quality Assessment of Polymerase Chain Reaction Methods for the Diagnosis of Infectious & Autoimmune Diseases. Narotam, Sch. J. App. Med. Sci., 2014; 2(1D):485-48.

2. Nayef Jarrous, Human ribonuclease P: Subunits, function, and intranuclear localization. ARN(2002), 8 :1–7.

3. https://www.qiagen.com/us/spotlight-pages/newsletters-andmagazines/articles/correct-interpretation-negative-results/​

Xét n

Viện Pasteur Nha Trang