SỰ HÌNH THÀNH VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA RỄ BẤT ĐỊNH TỪ NUÔI ...

Phương phápSự phát sinh rễ ở các vị trí phiến lá khác nhau của cây ĐQNB in vitro dưới ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin khác nhau trong môi trường nuôi cấyMẫu cấy là phiến lá của chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS. Mỗi phiến lá được cắt thành 3 phần, mỗi phần được rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương. Môi trường nuôi cấy được bổ sung 30 gl đường sucrose, 8 gl agar, 6 mgl NAA và 1 mgl kinetin (Kin) với pH được điều chỉnh đến 5,8 và hấp vô trùng ở 121oC, 1 atm trong thời gian 20 phút. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu 2 yếu tố: (A) thành phần môi trường, có 2 mức độ: khoáng MS và vitamin Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s B5 4; và (B) là vị trí phiến lá mọc ở chồi in vitro, có 3 mức độ: lá mở 2, 3 hoặc 4 tính từ chồi ngọn xuống. Thí nghiệm có 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 5 bình (V = 130 ml), mỗi bình chứa 18 ml môi trường với 1 mẫu phiến lá được đặt hoàn toàn trong tối. Phòng nuôi cây có nhiệt độ 24 ± 2oC, độ ẩm tương đối 65 ± 5%. Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, thời gian thí nghiệm 42 ngày. Tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ, số rễmẫu, khối lượng tươi (KLT) và khô (KLK) của rễ, được xác định ở ngày thứ 42. Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB in vitroMẫu cấy là phiến lá thứ 2 của chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS. Mỗi phiến lá được cắt thành 3 phần, mỗi phần rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương. Thí nghiệm kế thừa kết quả của thí nghiệm trước, môi trường nuôi cấy với thành phần khoáng và vitamin Gamborg’s B5 có bổ sung 30 gl đường sucrose, 8 gl agar và 6 mgl NAA. Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức với 3 loại cytokinin, bao gồm N6benzyladenine (BA), Kin hoặc TDZ, được bổ sung vào môi trường trước khi khử trùng ở 3 mức nồng độ 0,1; 0,5 hay 1 mgl. Mỗi nghiệm thức có 3 bình (V = 130 ml), mỗi bình chứa 18 ml môi trường với 1 mẫu phiến lá. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Điều kiện nuôi cấy giống như thí nghiệm trên. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ, số rễmẫu, KLT rễ, tỷ lệ (%) KLT rễKLT mẫu, được xác định ở ngày thứ 42.Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định cây ĐQNB khi nuôi cấy trong môi trường lỏng có lắcCùng lúc với nghiên cứu tạo rễ bất định từ phiến lá, thí nghiệm khảo sát sự tăng trưởng của rễ bất định tách rời từ chồi cây ĐQNB khi nuôi cấy trên môi trường lỏng cũng được tiến hành nhằm hướng đến việc sản xuất sinh khối rễ trong hệ thống bioreactor sau này. Mẫu cấy là rễ bất định tách ra từ cây ĐQNB in vitro hình thành trong quá trình phát triển chồi thành cây hoàn chỉnh. Mỗi mẫu có trọng lượng tươi ban đầu là 500 mg được đặt vào trong bình tam giác (V = 370 ml) chứa 50 ml môi trường lỏng gồm khoáng MS, vitamin Morel, 30 gl đường sucrose và được bổ sung indole3butyric acid (IBA) với các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mgl. pH của môi trường được điều chỉnh là 5,8 trước khi hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút. Các bình môi trường lỏng chứa mẫu cấy được đặt trên máy lắc INNOVA (công ty New Brunswick Scientific, Hoa Kỳ), model 2100, với vận tốc 100 vòngphút trong điều kiện hoàn toàn tối. Phòng nuôi cấy có nhiệt độ 24±2oC, độ

SỰ HÌNH THÀNH VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA RỄ BẤT ĐỊNH

TỪ NUÔI CẤY IN VITRO CỦA CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN

(ANGELICA ACUTILOBA KITAGAWA)

Nguyễn Thị Quỳnh*, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Lê Anh Thư

Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *qtnguyen_vn@yahoo.com

TÓM TẮT: Cây Đương quy nhật bản (ĐQNB) là cây thuốc quí, đầu vị trong nhiều bài thuốc cổ truyền,

với dược tính chủ yếu đến từ bộ rễ Trong nghiên cứu này, sự hình thành và tăng trưởng rễ của cây ĐQNB

in vitro đã được thực hiện trong điều kiện tối với nhiệt độ phòng nuôi 24 ± 2oC, độ ẩm tương đối 65 ± 5%

Phiến lá ở ba vị trí khác nhau của chồi in vitro được nuôi cấy trên môi trường khoáng MS kết hợp với

vitamin Morel hay khoáng và vitamin Gamborg’s B5 Tỷ lệ mẫu tạo rễ đạt 100% cũng như khối lượng tươi của rễ (132,7 mg/mẫu) lớn nhất khi phiến lá ở vị trí thứ hai tính từ chồi ngọn được nuôi cấy trên môi trường Gamborg’s B5 Khi phiến lá được nuôi cấy trên môi trường Gamborg’s B5 có bổ sung các cytokinin bao gồm BA, Kin hoặc TDZ ở các nồng độ 0,1; 0,5 hay 1 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi của rễ cũng như tỷ lệ khối lượng tươi rễ/khối lượng tươi mẫu lớn nhất ở nồng độ 0,1 mg/l BA Trong môi trường lỏng gồm khoáng MS, vitamin Morel, và bổ sung IBA ở các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/

l, rễ bất định của cây ĐQNB in vitro khi được nuôi trên máy lắc ở tốc độ 100 vòng/phút đã gia tăng sinh

khối theo sự gia tăng nồng độ IBA và theo thời gian nuôi cấy Ở ngày thứ 28, rễ bất định của cây ĐQNB trong môi trường bổ sung 1 mg/l IBA có khối lượng tươi (2423,7 mg/bình) lớn nhất và tăng gần 5 lần so với khối lượng rễ ở ngày nuôi cấy ban đầu (500 mg/bình)

Từ khóa: Angelica acutiloba, auxin, cytokinin, rễ bất định

MỞ ĐẦU

Cây Đương quy nhật bản (Angelica

acutiloba (Sieb & Zucc.) Kitagawa) là cây

thuốc quí, đầu vị và không thể thiếu trong y học

cổ truyền đối với việc điều trị bệnh phụ nữ và

bồi bổ khí huyết, đồng thời còn là thuốc trị bệnh

như thuốc chữa thiếu máu, đau đầu, kháng

viêm, tăng cường miễn dịch Dược tính của cây

Đương quy đến từ bộ phận rễ nơi có chứa rất

nhiều hợp chất thứ cấp, bao gồm 47 hợp chất

khác nhau, trong đó ligustilide (22,8%) và

butylidenephthalide (19,5%) là hai hợp chất

chính Cây Đương quy nhật bản từ lúc trồng đến

lúc thu hoạch rễ phải mất từ 2-3 năm, dẫn đến

chi phí công lao động và chăm sóc trên đồng

ruộng gia tăng khiến giá thành sản phẩm tăng

theo rất cao [3]

Cây Đương quy nhật bản (ĐQNB) đã được

du nhập vào trồng ở Việt Nam với diện tích mở

rộng từ Tây Bắc đến khu vực sông Hồng gần Hà

Nội [14] Cây ĐQNB ưa khí hậu ẩm mát, vì vậy

việc gieo hạt và sinh trưởng của cây cần trùng

với thời gian có nhiệt độ thấp trong năm Thời

gian gieo hạt ở Việt Nam tốt nhất là đầu tháng

10 Việc gieo hạt vào thời điểm muộn hơn

(tháng 11 đến tháng 2) sẽ dẫn đến tỷ lệ nẩy mầm giảm đáng kể do nhiệt độ giảm mạnh ở thời điểm này Ngoài ra, hạt Đương quy dễ mất khả năng nảy mầm khiến việc sử dụng hạt để nhân giống gặp nhiều khó khăn Nhu cầu rễ cây ĐQNB rất lớn trên thế giới, khoảng 450 tấn năm 2005 trong khi cung chỉ đạt được xấp xỉ

197 tấn, vì vậy cần tìm phương pháp nhân nhanh hữu hiệu cây Đương quy mà vẫn đảm bảo sự đồng nhất về mặt di truyền

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật từ khi ra đời đã đem đến khả năng làm tăng hệ số nhân giống của thực vật chỉ trong một thời gian ngắn, đồng thời việc nuôi cấy các cơ quan hay

mô, tế bào thực vật đã giúp các nhà nghiên cứu thu nhận được các hợp chất thứ cấp có giá trị trong y dược với hiệu suất cao khi không thể sản xuất từ tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hoá học Công trình nghiên cứu

về nuôi cấy mô tế bào cây ĐQNB tại Việt Nam chưa nhiều Hoàng Ngọc Nhung và nnk (2012) [13] đã chứng minh sự tạo chồi trực tiếp của cây ĐQNB bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng

cắt ngang của chồi đỉnh cây in vitro trên môi

trường khoáng MS, vitamin Gamborg’s B5, bổ

sung 0,1 mg/l α-naphthaleneacetic acid (NAA),

1 mg/1 thidiazuron (TDZ), 30 g/l đường

sucrose, 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l

adenine

Trong bài này, ảnh hưởng của thành phần

khoáng và vitamin khác nhau trong môi trường

nuôi cấy, cũng như vai trò của cytokinin lên sự

tạo rễ bất định từ mẫu cấy phiến lá của cây

ĐQNB in vitro đã được khảo sát, đồng thời

nghiên cứu bước đầu về sự tăng trưởng của rễ

bất định khi được tách rời khỏi mẫu và nuôi cấy

trong môi trường lỏng được trình bày

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

Chồi in vitro cây ĐQNB có nguồn gốc từ

cây nảy mầm từ hạt (do Đại học Chiba, Nhật

Bản cung cấp) khi được nuôi cấy trên môi

trường khoáng MS [12] kết hợp với vitamin

Morel [11] có bổ sung 30 g/l đường sucrose

(công ty Đường Biên Hòa), 8 g/l agar (công ty

Cổ phần Đồ hộp Hạ Long) pH của môi trường

trước khi khử trùng là 5,8 Môi trường được

khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong 20

phút

Phương pháp

Sự phát sinh rễ ở các vị trí phiến lá khác nhau

của cây ĐQNB in vitro dưới ảnh hưởng của

thành phần khoáng và vitamin khác nhau trong

môi trường nuôi cấy

Mẫu cấy là phiến lá của chồi in vitro được

nuôi cấy trước đó trên môi trường MS Mỗi

phiến lá được cắt thành 3 phần, mỗi phần được

rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương Môi

trường nuôi cấy được bổ sung 30 g/l đường

sucrose, 8 g/l agar, 6 mg/l NAA và 1 mg/l

kinetin (Kin) với pH được điều chỉnh đến 5,8 và

hấp vô trùng ở 121oC, 1 atm trong thời gian 20

phút Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu

nhiên theo kiểu 2 yếu tố: (A) thành phần môi

trường, có 2 mức độ: khoáng MS và vitamin

Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s B5

[4]; và (B) là vị trí phiến lá mọc ở chồi in vitro,

có 3 mức độ: lá mở 2, 3 hoặc 4 tính từ chồi

ngọn xuống Thí nghiệm có 6 nghiệm thức, mỗi

nghiệm thức có 5 bình (V = 130 ml), mỗi bình

độ 24 ± 2oC, độ ẩm tương đối 65 ± 5% Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, thời gian thí nghiệm 42 ngày Tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi (KLT) và khô (KLK) của rễ, được xác định ở ngày thứ 42

Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB in vitro Mẫu cấy là phiến lá thứ 2 của chồi in vitro

được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS Mỗi phiến lá được cắt thành 3 phần, mỗi phần rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương Thí nghiệm kế thừa kết quả của thí nghiệm trước, môi trường nuôi cấy với thành phần khoáng và vitamin Gamborg’s B5 có bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8 g/l agar và 6 mg/l NAA Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức với 3 loại cytokinin, bao gồm N6-benzyladenine (BA), Kin hoặc TDZ, được bổ sung vào môi trường trước khi khử trùng ở 3 mức nồng độ 0,1; 0,5 hay 1 mg/l Mỗi nghiệm thức có 3 bình (V = 130 ml), mỗi bình chứa 18 ml môi trường với 1 mẫu phiến lá Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Điều kiện nuôi cấy giống như thí nghiệm trên Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, KLT

rễ, tỷ lệ (%) KLT rễ/KLT mẫu, được xác định ở ngày thứ 42

Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định cây ĐQNB khi nuôi cấy trong môi trường lỏng có lắc

Cùng lúc với nghiên cứu tạo rễ bất định từ phiến lá, thí nghiệm khảo sát sự tăng trưởng của

rễ bất định tách rời từ chồi cây ĐQNB khi nuôi cấy trên môi trường lỏng cũng được tiến hành nhằm hướng đến việc sản xuất sinh khối rễ trong hệ thống bioreactor sau này Mẫu cấy là rễ

bất định tách ra từ cây ĐQNB in vitro hình

thành trong quá trình phát triển chồi thành cây hoàn chỉnh Mỗi mẫu có trọng lượng tươi ban đầu là 500 mg được đặt vào trong bình tam giác (V = 370 ml) chứa 50 ml môi trường lỏng gồm khoáng MS, vitamin Morel, 30 g/l đường sucrose và được bổ sung indole-3-butyric acid (IBA) với các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l pH của môi trường được điều chỉnh là 5,8 trước khi hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút Các bình môi trường lỏng chứa mẫu cấy được

với vận tốc 100 vòng/phút trong điều kiện hoàn

toàn tối Phòng nuôi cấy có nhiệt độ 24±2oC, độ

ẩm tương đối 65±5% Thí nghiệm gồm 3

nghiệm thức tương ứng với 3 nồng độ IBA, mỗi

nghiệm thức 3 bình, được lặp lại 3 lần Thời

gian thí nghiệm là 28 ngày Khối lượng tươi của

rễ được đo ở các ngày nuôi cấy thứ 7, 14, 21, 28

và 35

Số liệu các thí nghiệm được phân tích

ANOVA, một hoặc hai yếu tố, bằng phần mềm

thống kê MSTATC, phiên bản 2.1, của Đại học

bang Michigan, Hoa Kỳ và vẽ biểu đồ bằng

phần mềm Microsoft Office Excel 2007

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sự phát sinh rễ ở các vị trí phiến lá khác

nhau của cây ĐQNB in vitro dưới ảnh hưởng

của thành phần khoáng và vitamin khác

nhau trong môi trường nuôi cấy

Sự cảm ứng tạo rễ bất định và dinh dưỡng

khoáng có mối quan hệ mật thiết với nhau

Trong thí nghiệm này, thành phần khoáng và

vitamin có ảnh hưởng rõ rệt lên khối lượng tươi

của rễ bất định ở các vị trí mẫu khác nhau vào

ngày kết thúc thí nghiệm (bảng 1, hình 1) Tất

cả các mẫu phiến lá cấy trên môi trường khoáng

và vitamin Gamborg’s B5 đều cho KLT cao hơn

các mẫu cấy trên môi trường có thành phần

khoáng MS kết hợp với vitamin Morel Mẫu cấy ở công thức B2 cho rễ có KLT cao nhất 132,7 mg/mẫu, trong khi mẫu cấy có KLT của

rễ thấp nhất là ở công thức M2 (3,0 mg/mẫu) Hai loại môi trường MS và Gamborg’s B5 đều tương đồng về chủng loại và hàm lượng các thành phần khoáng vi lượng Vì vậy, sự phát sinh rễ bất định của cây ĐQNB trong nuôi cấy này có thể do sự khác biệt về thành phần và hàm lượng của khoáng đa lượng hay vitamin Schwambach et al (2005) [17] chứng minh Ca,

Zn và N trong môi trường nuôi cấy đã có ảnh hưởng đáng kể đến số lượng rễ hình thành trên

đối tượng Eucalyptus globulus Labill Trong

thành phần khoáng đa lượng của môi trường Gamborg’s B5, NH4 hiện diện chỉ bằng 8% so với môi trường MS ((NH4)2SO4/NH4NO3), nên tính đối kháng giữa sự đồng hoá đạm và hấp thu các cation đa lượng không cao, vì thế sự cảm ứng tạo rễ bất định của mẫu cấy phiến lá cây ĐQNB trên môi trường khoáng Gamborg’s B5 đạt hiệu quả lớn hơn (bảng 1) Nghiên cứu của Nguyễn Thị Liễu và nnk (2010) [8] cũng cho thấy thành phần khoáng đa lượng và vi lượng trong môi trường Gamborg’s B5 là phù hợp cho

sự tạo rễ bất định từ mô sẹo có nguồn gốc từ rễ

của cây Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha

et Gurshv.) khi môi trường có bổ sung 7 mg/l NAA

Bảng 1 Ảnh hưởng của thành phần khoáng, vitamin và vị trí phiến lá của cây ĐQNB lên tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi (KLT) và khối lượng khô (KLK) của rễ ở ngày thứ 42

ANOVAy

z M hoặc B bên trái đại diện cho khoáng MS kết hợp với vitamin Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s B5, các số bên phải đại diện cho vị trí lá thứ 2, 3 hoặc 4; yNS, *, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,05 hoặc 0,01; xCác trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Range Test

Trong thành phần vitamin, thyamine đóng

vai trò quan trọng trong sự chuyển hoá

carbohydrate và trực tiếp tham gia vào quá trình

sinh tổng hợp một số loại acid amin, cho nên

thyamine cần được cung cấp liên tục trong quá

trình nuôi cấy [15] Thyamine hiện diện trong

vitamin Gamborg’s B5 với hàm lượng cao gấp

10 lần so với trong vitamin Morel Vì vậy, có thể thyamine cũng đã ảnh hưởng đến việc làm

gia tăng số lượng rễ bất định của cây ĐQNB.

Chée (1995) [1] cũng đã chứng minh thyamine cần thiết cho quá trình cảm ứng tạo rễ bất định ở

loài Taxus sp

Hình 1 Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin trong môi trường nuôi cấy

lên sự hình thành rễ ở các vị trí khác nhau của mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB

M hoặc B bên trái đại diện cho khoáng MS và vitamin Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s B5, các số

bên phải đại diện cho vị trí lá thứ 2, 3 hoặc 4

Môi trường nuôi cấy là yếu tố tác động

chính gây cảm ứng ở mô nuôi cấy, tuy nhiên,

tuổi sinh lý của mô cấy cũng cần quan tâm do

ảnh hưởng của nó liên quan đến sự phát sinh

hình thái ở thực vật nuôi cấy như sự tạo mô sẹo,

tạo chồi hay rễ bất định Ở ngày thứ 42, tỷ lệ

mẫu cấy hình thành mô sẹo ở vết thương và tạo

rễ giảm dần ở các vị trí phiến lá càng xa chồi

ngọn dù cấy trên loại môi trường nào, cùng với

số mẫu phiến lá hóa nâu đen và chết tăng dần Ở

mẫu phiến lá thứ 4 tuy cho lượng rễ nhiều,

nhưng tỷ lệ mẫu không tạo rễ cao Mẫu nuôi cấy

trên môi trường khoáng và vitamin Gamborg’s

B5 có tỷ lệ tạo rễ ở phiến lá thứ 2 lên đến 100%

mặc dù không khác biệt về phương diện thống

kê so với các nghiệm thức còn lại (bảng 1) Mẫu

cấy càng già, khả năng phản biệt hoá bị suy

giảm khiến khiến khả năng tái biệt hoá thành rễ

Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB in vitro

Mỗi loại mẫu cấy đều chứa một lượng auxin

và cytokinin nội sinh nhất định Auxin sẽ

cảm ứng mẫu cấy tạo mô sẹo và hình thành sơ

khởi rễ khi phối hợp với cytokinin theo một tỷ

lệ thích hợp Khi môi trường nuôi cấy có bổ

sung auxin và cytokinin ngoại sinh, tùy vào tỷ

lệ auxin tổng: cytokinin tổng mà mẫu cấy sẽ có

những đáp ứng khác nhau, nếu tỷ lệ auxin:

cytokinin lớn thì kích thích sự ra rễ Trong thí

nghiệm này, phiến lá cây ĐQNB được nuôi cấy

trong môi trường có 6 mg l-1 NAA và khi bổ

sung thêm Kin hoặc BA đều có sự hình thành rễ

bất định (bảng 2) Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu tạo rễ ở

các công thức có sự hiện diện của BA cao hơn

so với các nghiệm thức có Kin, đồng thời tỷ lệ

mẫu tạo rễ và số rễ/mẫu giảm dần khi nồng độ

BA tăng từ 0,1 lên 1 mg/l Gaspar et al (1996)

[5] cho rằng việc bổ sung cytokinin có thể gây

ức chế một số hoạt tính của auxin Vì vậy, KLT của rễ cùng với tỷ lệ KLT rễ/KLT mẫu giảm dần khi nồng độ BA bổ sung vào môi trường tăng dần Tuy nhiên, tùy theo loại cytokinin mà

sự phối hợp với auxin trong môi trường đem đến sự khác biệt về tỷ lệ mẫu tạo rễ, số lượng rễ hay khối lượng rễ, tương tự như thí nghiệm ở

cây đậu (Phaseolus vulgaris), kinetin ức chế sự

hình thành rễ trên trụ hạ diệp [6], trong khi lại kích thích hình thành rễ bất định ở trụ hạ diệp

và cuống lá của Pinus radiata [18], hay của cây

hoa hồng [21] Tương tự trong thí nghiệm này,

tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ, đồng thời KLT rễ cùng với tỷ lệ KLT rễ/KLT mẫu tăng cùng với sự tăng nồng độ Kin trong môi trường nuôi cấy (bảng 2, hình 2)

Bảng 2 Ảnh hưởng của cytokinin lên tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ, khối lượng tưới (KLT) và tỷ lệ khối lượng tươi rễ/khối lượng tươi mẫu (KLT rễ/KLT mẫu) của rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB ngày th 42 ở ngày thứ 42 ứ 42

ANOVAy

z B, K, hoặc T bên trái đại diện cho BA, Kin hoặc TDZ; các số bên phải đại diện cho nồng độ (0,1; 0,5 hoặc 1

mg l-1); y NS, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,01; xCác trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Range Test

Hình 2 Ảnh hưởng của BA, Kin hay TDZ ở các nồng độ khác nhau

lên sự hình thành rễ của mẫu cấy phiến lá cây ĐQNB

Chữ B, K hoặc T bên trái đại diện BA, Kin hoặc TDZ; các số bên phải

đại diện cho nồng độ (0,1; 0,5 hoặc 1 mg l-1)

Sự hiện diện của TDZ trong môi trường

nuôi cấy đã không cảm ứng mẫu cấy tạo rễ bất

định như BA hay Kin mà chỉ cảm ứng tạo mô

sẹo có màu vàng trắng nơi có vết thương Điều

này chứng tỏ TDZ kết hợp với auxin nội sinh

trong mô cấy đã cảm ứng sự tăng sinh tế bào,

nhưng hoạt tính tạo sơ khởi rễ bất định có thể đã

bị TDZ ức chế nên không hình thành sơ khởi rễ

bất định Theo Mok et al (1982) [10], cấu trúc

phân tử của TDZ có 2 nhóm chức năng là nhóm

phenyl và nhóm thidiazon Do đó, tùy theo sự

hoạt động của hai nhóm này mà kết quả cảm

ứng của mô nuôi cấy sẽ khác nhau

Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định

cây ĐQNB khi nuôi cấy trong môi trường

lỏng có lắc

Việc bổ sung các auxin như IBA vào môi

trường nuôi cấy ở nhiều loài thực vật dẫn đến sự

cảm ứng tạo rễ bất định [9] Trong thí nghiệm

này, sự gia tăng sinh khối rễ theo thời gian nuôi

cấy chịu ảnh hưởng rõ rệt bởi sự hiện diện và sự

gia tăng nồng độ của IBA (hình 3 và 4) Khối

lượng tươi của rễ gia tăng khi nồng độ IBA

đều gia tăng nhanh, gấp đôi hay gấp ba khi nồng

độ IBA bổ sung ở mức 0,5 hay 1 mg/l so với rễ nuôi trong môi trường có bổ sung IBA 0,2 mg/l (hình 3) Ở ngày nuôi cấy thứ 28, sự gia tăng sinh khối rễ ở nghiệm thức bổ sung IBA 1 mg/l

là lớn nhất (1923,7 mg/bình) với khối lượng tươi trung bình của nghiệm thức này là 2423,7 mg/bình Sự gia tăng khối lượng tươi rễ bất định

ở bất kỳ nồng độ IBA nào của cây ĐQNB theo thời gian nuôi cấy đã thể hiện động học tăng trưởng rễ điển hình (hình 3) Từ ngày nuôi cấy đầu tiên đến ngày nuôi cấy thứ 7, khối lượng rễ gia tăng tương đối chậm (lag phase - pha tiềm tàng) Từ ngày nuôi cấy thứ 7 đến ngày nuôi cấy thứ 21, khối lượng rễ gia tăng nhanh ở tất cả các nghiệm thức (log/exponential phase - pha tăng trưởng) Sự tăng trưởng của rễ trở nên chậm, tương đối ổn định từ ngày nuôi cấy 21 đến ngày 28 (stationary phase - pha ổn định), và

có khuynh hướng đi vào trạng thái suy thoái, không tăng trưởng thêm từ ngày 28 vào ngày thứ 35 (diminishing growth phase - pha suy thoái) (hình 3) Từ kết quả này, việc nuôi cấy rễ bất định cây ĐQNB trên môi trường lỏng có bổ

khối, hoặc môi trường mới cần được bổ sung

cho chu kỳ nuôi cấy rễ tiếp theo

0

100

200

300

400

Ngày

I0.2

I0.5

I1

Hình 3 Sự biến thiên sinh khối rễ cây ĐQNB

theo thời gian nuôi cấy

Chữ I đại diện cho IBA, các số bên phải của chữ

I đại diện các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l

Sự không tăng sinh khối tươi rễ ở tất cả các

công thức khi kéo dài thời gian nuôi cấy từ ngày

28 đến ngày thứ 35 có lẽ do sự giảm pH của

môi trường nuôi cấy thông qua việc hấp thu dinh dưỡng khoáng của các tế bào rễ Sau 35 ngày nuôi cấy, pH của môi trường bổ sung IBA 0,2; 0,5 hay 1 mg/l lần lượt là 4; 3,9 hay 3,8 pH của môi trường giảm càng mạnh, chứng tỏ tế bào hấp thu lượng dinh dưỡng khoáng từ môi trường càng lớn Rễ cây luôn có sự hấp thu tích cực và chọn lọc các chất dinh dưỡng thông qua quá trình trao đổi chất của tế bào Để hấp thu các chất dinh dưỡng dưới dạng cation, rễ cây phải tiết ra các ion H+ để trao đổi với môi trường xung quanh Ion H+ tích lũy dần trong vùng rễ, làm cho pH của môi trường giảm dần Mặt khác sự hấp thu tích cực cũng dẫn đến tiêu hao nhiều năng lượng của tế bào, vì vậy rễ hô hấp mạnh và thải ra nhiều khí CO2 vào môi trường hệ rễ Lượng khí CO2 này kết hợp với nước tạo ra một lượng acid carbonic, tích lũy ngày càng nhiều dẫn đến việc làm giảm pH của môi trường [20] Tuy nhiên, Dilorio et al (1992) [2] đã chứng minh sự gia tăng khí CO2

trong bình nuôi cấy do sự hô hấp của rễ cùng với sự thiếu hụt O2 đã kích thích rễ tơ tăng trưởng mạnh hơn

Hình 4 Rễ cây ĐQNB trên các môi trường nuôi cấy khác nhau

Chữ I đại diện cho IBA, các số bên phải chữ I đại diện các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l

Trong thí nghiệm này, rễ tăng trưởng còn

nhờ vào nguồn carbon hữu cơ có mặt trong môi

trường nuôi cấy, chủ yếu là của đường sucrose

Rễ cây ĐQNB thông qua hô hấp sẽ tiêu thụ

carbon đồng hóa để có năng lượng cần thiết cho

sự duy trì và gia tăng sinh khối, vì vậy tiến trình

này cần thiết phải có sự hiện diện của oxy Theo

Yu et al (2000) [22], sự thông khí của hệ thống nuôi cấy là yếu tố quan trọng trong sự hình thành rễ bất định Soffer và Burger (1988) [19] cũng đã chứng minh rằng oxy hòa tan thiết yếu cho sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định Do bình nuôi cấy rễ bất định của cây ĐQNB là bình kín, không có sự trao đổi khí với

bên ngoài, lượng oxy hòa tan trong môi trường

nuôi cấy sẽ giảm dần trong giai đoạn tăng

trưởng nhanh của rễ từ ngày 14 đến ngày 28 Vì

vậy, ở ngày thứ 35, hoạt động phân chia của tế

bào rễ có thể đã giảm dẫn đến sinh khối của rễ ở

tất cả các công thức đều giảm Rễ bất định ở

ngày đầu tiên nuôi cấy không có sự hiện diện

của các rễ thứ cấp Sau 35 ngày nuôi cấy, các rễ

thứ cấp được hình thành từ rễ sơ cấp ban đầu ở

tất cả các công thức khảo sát (hình 4) Tuy

nhiên, sự gia tăng nồng độ IBA trong môi

trường nuôi cấy đã làm gia tăng số lượng rễ thứ

cấp Kim et al (2003) [7] cũng chứng minh IBA

có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự hình thành rễ thứ

cấp sau 7 ngày nuôi cấy rễ bất định của cây sâm

Panax ginseng; San José et al (2012) [16] cũng

đã chứng minh sự hiện diện của IBA 0,1 mg/l

trong môi trường nuôi cấy đã làm sự hình thành

rễ thứ cấp của cây Alnus glutinosa gia tăng rõ

rệt so với đối chứng trên môi trường không có

IBA

KẾT LUẬN

Kết quả nghiên cứu đã cho thấy tính khả thi

của việc tạo rễ bất định từ nuôi cấy phiến lá cây

ĐQNB in vitro trên môi trường thạch cũng như

việc nuôi cấy rễ bất định trong môi trường lỏng

với sự hỗ trợ của máy lắc để làm tăng sinh khối

rễ Các nghiên cứu sâu hơn về nuôi cấy rễ cần

được tiến hành để có thể hoàn thiện quy trình

nuôi rễ bất định đồng thời cần triển khai các

nghiên cứu về sự tích lũy các hợp chất thứ cấp

trong rễ in vitro của cây ĐQNB.

Lời cảm ơn: Nghiên cứu nhận được sự hỗ trợ về

nguồn hạt giống cây ĐQNB của GS Toyoki

Kozai, Đại học Chiba, Nhật Bản, kỹ thuật của

Trịnh Thị Thanh Vân và Phạm Minh Duy,

phòng Công nghệ Tế bào Thực vật và trang

thiết bị của Phòng Thí nghiệm trọng điểm về

Công nghệ tế bào thực vật phía Nam, Viện Sinh

học nhiệt đới

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Chée P., 1995 Stimulation of adventitious

rooting of Taxus species by thiamine Plant

3 J., 1992 Carbon dioxide improves the growth of hairy roots cultures on solid medium and in nutrient mists Appl Microbiol Biotechnol., 37: 463-467

4 Fukuda K., Murata K., Matsuda H., Taniguchi M., Shibano M., Baba K., Shiratori M., Tani T., 2009 Quality of

Angelica acutiloba roots cutivated ang

processed in Sichuan provice of China, J Trad Med., 26: 169-178

5 Gamborg L., Miller A., Ojima K., 1968 Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells Exp Cell Res., 50: 151-158

6 Gaspar T., Kevers C., Greppin H., Reid M., Thrope A., 1996 Plant hormones and plant

growth regulators in plant tissue culture In vitro Cell Dev Biol Plant, 32: 272-289.

7 Humphries E.C., 1960 Inhibition of root development on pertioles and hypocotyls of

dwarf bean (Phaseolus vulgaris) by kinetin.

Physiol Plant, 13: 659-663

8 Kim J S., Hahn E J., Yeung E C., Paek K Y., 2003 Lateral root development and saponin accumulation as affected by IBA or

NAA in adventitious root cultures of Panax ginseng C A Meyer In-Vitro Cel.Dev.

Biol Plant, 39(2): 245-249

9 Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết, 2010 Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong nuôi cấy in vitro Tạp chí khoa học Đại học

quốc gia Hà Nội, Khoa học tự nhiên và Công Nghệ, 27: 30-36

10 Ludwig-Muller J., 2000 Indole-3-butyric acid in plant growth and development Plant Growth Reg., 32: 219-230

11 Mok M C., Mok D W S., Amstrong D J.,

1982 Cytokinin activity of

N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazon-5-ylurea (TDZ)

Phytochem., 21: 1509-1511.

12 Morel G., Wetmore R., 1951 Tissue culture

of monocotyledons, American Jour Bot.,

14 medium for rapid growth and bioassays

with tobacco tissue cultures Physiol

Plant, 15(3): 473-497

15 Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Thị Quỳnh,

Nguyễn Vũ Ngọc Anh, Nguyễn Lê Anh

Thư, Kozai T., 2012 Nghiên cứu sự phát

sinh cơ quan từ lớp mỏng tế bào cây đương

quy Nhật Bản - Angelica acutiloba nuôi cấy

in vitro Tạp chí Sinh học, 34(3SE):

196-204

16 Ninh T P., Nojima H., Tashiro T., 2009

Effect of pretreatment of seeds by

gibberellin (GA3), kinetin and temperatures

on germination and seedling growth of

Angelica acutiloba Kitagawa J Sci Dev., 7

(Eng.Iss.2): 217-224

17 Polikarpochkina R T., Gamburg K Z.,

Khavin E.E., 1979 Cell-suspension culture

of maize (Zea mays L.) Z.P

flanzenphysiol., 95: 57-67.

18 San José M C., Romero L., Janeiro L.V.,

2012 Effect of indole-3-butyric acid on root

formation in Alnus glutinosa microcuttings.

Silva Fennica, 46(5): 643-654

19 Schwambach J., Fadanelli C., Fett-Neto

A.G., 2005 Mineral nutrition and

adventitious rooting in microcutting of

Eucalyptus globules Tree Physiol., 25:

487-494

20 Smith D R., Thorpe T A., 1975 Root

initiation in cuttings of Pinus radiata

seedlings II Growth regulator interactions

J Exp Bot., 26: 193-202.

21 Soffer H., Burgur D W., 1988 Effects of dissolved oxygen concentrations in aero hydroponics on the formation and growth of adventitious roots, J Am Soc Hort Sci., 113: 218-221

22 Thorpe T., Stasolla C., Yeung E C., de Klerk G J., Roberts A., George E F., 2008 The components of plant tissue culture media II: Organic additions, osmotic and pH effects, and support systems In: Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition, Vol 1: The Background, George E.F., Hall M.A., de Klerk G.J (eds.), Springer, Dordrecht, The Netherlands, 115-174

23 Vries D P., Dubois L A M., 1988 The effect of BAP and IBA on sprouting and adventitous root formation of ‘Amanda’ rose single - node softwood cuttings, Sci

Hortic., 34: 115-121.

24 Yu T A., Yeh S D., Cheng Y H., Yang

J S., 2000 Efficient rooting for establishment of papaya plantlets by micropropagation, Plant Cell Tiss Org Cult., 61(1): 29-35

FORMATION AND GROWTH OF ADVENTITIOUS ROOTS FROM IN VITRO

ANGELICA ACUTILOBA KITAGAWA TISSUE CULTURE

Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu

Institute of Tropical Biology, VAST

SUMMARY

Japanese touki is considered of high and prior value in many traditional remedies due to medicinal

properties in the root system In this study, root formation and growth of Japanese touki cultured in vitro were

carried out in the dark condition of a culture room having temperature of 24 ± 2oC and RH of 65 ± 5% Leaf

blades from three different positions of the in vitro touki shoot were cultured either on basal mineral MS

medium supplemented with Morel vitamins or Gamborg’s B5 medium Percent of root formation was 100%

as well as root fresh weight (132.7 mg explant-1) was the greatest when the second leaf blade was cultured on the Gamborg’s B5 medium Percent of root formation, root number, root fresh weight and root fresh

weight/explant fresh weight were the greatest when the leaf blade was cultured on the Gamborg’s B5 medium supplemented with 0.1 mg/l BA

In the MS liquid medium including Morel vitamin, shaked at 100 ppm, and supplemented with different

IBA concentrations (0.2, 0.5 or 1 mg/l), adventitious roots of in vitro touki plants grew and increased their

biomass over time with the increase in IBA concentrations On day 28, touki roots had the greatest fresh weight (2423.7 mg/vessel) in the medium supplemented with 1 mg/l IBA, almost 5 times higher than that (500 mg/vessel) at the first day of culture

Keywords: Angelica acutiloba, adventitious rout, auxin, cytokinin.

Ngày nhận bài: 30-6-2013