Tách Chiết Plasmid - Sinh Học Phân Tử

• Home
• About
• Contact
• Shop

Bài đăng nổi bật

Công nghệ DNA tái tổ hợp

I. Mở đầu Vào năm 1973, một nhóm các nhà khoa học đã tạo ra cơ thể sinh vật đầu tiên với các phân tử DNA tái tổ hợp. Theo đó, Cohen...

• Home
• Liên kết trang
• _Labinsider.vn
• _hoachatthinghiem
• _SBC Scientific
• _Biospace
• Micropipettes
• _Gilson Pháp
• __Pipet Cơ
• __Pipet điện tử
• __Kỹ thuật Pipet
• _Metler Toledo
• __Pipet cơ
• __Pipet điện tử
• __Kỹ thuật Pipet
• _Vật tư tiêu hao
• _Khuyến mãi
• SHPT là gì
• Di Truyền
• Chuyển gene
• Điện Di
• Sinh Hóa
• PCR

Danh sách Blog của Tôi

Thứ Hai, 25 tháng 12, 2017

di truyen Tách chiết Plasmid Tách chiết Plasmid by Nguyen Dang on tháng 12 25, 2017 in di truyen

Nguyên lý tách plasmid

Việc tách plasmid ra khỏi ADN hệ gen (genome) là rất khó khăn. Tuy nhiên người ta có thể dựa vào sự khác nhau về mặt lý hóa của 2 loại ADN, bao gồm: kích thước, hình dạng, cấu trúc chung. Plasmid là những phân tử ADN nhỏ, mạch vòng, thường ở dạng siêu xoắn, có khả năng tái bản độc lập và có kích thước 0.05 – 10% kích thước của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Trên cơ sở đó, người ta tiến hành dùng các hóa chất có tác dụng phá vỡ các liên kết hidro giữa các nucleotide của cả ADN plasmid và ADN genome dẫn đến ADN bị biến tính. Sau đó, tiến hành hồi tính: ADN hệ gen không thể hồi tính do kích thước lớn và dễ dàng loại bỏ bằng ly tâm. Trong khi đó, ADN plasmid ở dạng siêu xoắn (supercoiled configuration) có đặc điểm là dễ dàng phục hồi lại hình dạng ban đầu dưới điều kiện hồi tính.

Một số phương pháp tách plasmid ở vi khuẩn.

Phương pháp thuỷ phân bằng kiềm

• Tế bào vi khuẩn được xử lý với dung dịch chứa SDS và NaOH. Trong đó’
• SDS: biến tính protein – phá vỡ màng tế bào.
• NaOH: làm biến tính ADN genome và ADN plasmid.
• Sau đó, hỗn hợp được trung hoà bằng potassium acetate (CH3COOK) à ADN plasmid sẽ được hồi tính nhanh chóng và hoà tan trong dung dịch, còn ADN genome và các protein khác bị kết tủa và giữ lại trong phức hợp SDS-kali à ly tâm lại tủ và thu ADN plasmid tinh sạch.

Phương pháp đun sôi

• Vi khuẩn có chứa ADN plasmid được phá vỡ bằng lysozyme, Triton-X100 và nhiệt độ à DNA genome vẫn bám vào màng tế bào vi khuẩn, còn DNA plasmid được giải phóng và hoà tan trong dung dịch.
• Thu nhận ADN plasmid bằng cách tủa với alcohol.

Phương pháp dựa bào Lithium

• Xử lý mẫu với hỗn hợp Triton X-100/LiCl à màng trong của tế bào vi khuẩn bị phân huỷ.
• Bổ sung phenol/chloroform à biến tính và kết tủa các protein nội bào. Đồng thời, tế bào sẽ co lại nhanh chóng và đẩy dung dịch nội bào (có chứa ADN plasmid) ra ngoài; ADN genome và protein sẽ bị giữ lại trong sinh khối tế bào.
• Ly tâm à thu ADN plasmid

Phương pháp truyền thống trong tách chiết plasmid

1. Cấy chuyển 1 khuẩn lạc vào 5 ml môi trường LB có bổ sung kháng sinh và nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ 37o
2. Chuyển dịch nuôi cấy vào các ống effendorf 1.5 ml và ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi.
3. Hoà tan tế bào trong 200 ml dung dịch I (GTE solution) dẫn đến phá vỡ màng tế bào, voltex mạnh để tế bào trộn đều trong dung dịch. Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
4. Bổ sung 200 ml dung dịch II (0.2N NaOH, 1% SDS) dẫn đến biến tính ADN NST, lắc nhanh vài lần, ủ hỗ hợp trong đá 5 phút.
5. Bổ sung 300 ml dung dịch III để lạnh, vortex nhẹ, ủ hỗ hợp trong đá 10 phút.
6. Ly tâm 14000 vòng/phút, 10 phút ở nhiệt độ phòng.
7. Hút phần dịch sang một ống effendorf mới, bổ sung 0.5 ml isopropanol hoặc ethanol 100% lạnh, vortex.
8. Ly tâm 15000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch nổi.
9. Rửa tủa bằng cách thêm từ từ 0.5 ml ethanol 70%, chắt bỏ cẩn thận, không làm mất tủa.
10. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng trong 10 – 15 phút.
11. Nhẹ nhàng hoà tan tủa trong 100 đệm TE 1X. Bảo quản ở -20o

Một số kit tách chiết DNA plasmid

1. ISOLATE II Plasmid Mini Kit- Bioline Anh Quốc: Dùng để tách chiết DNA plasmid
2. Plasmid Extraction Kit – Invitrogen: dùng để tách chiết DNA từ vi khuẩn.
3. Plasmid Extraction Kit – Invitrogen: có thể tách chiết được 10µg DNA plasmid, độ tinh sạch cao, sử dụng LyseBlue cho sự phân tách tối ưu và thu tối đa sản lượng DNA
4. Kit QIAprep Spin Miniprep: có thể tách chiết lên đến 20µg DNA plasmid với độ tinh sạch cao, thời gian nhanh. Khả năng tách cao hơn khi sử dụng High-Yield Supplementary Protocol (lượng tách được là 30µg)
5. ChargeSwitch™ NoSpin Plasmid Micro Kit: Kích cỡ mẫu 0,5-1 ml nuôi cấy qua đêm; Năng suất tiêu biểu lên tới 5 μg, tránh được các chất gây ô nhiễm enzym cho kết quả tốt hơn và tối ưu hóa cho qua trình tự động hóa. Chất phản ứng NoSpin mới tạo ra sự kết tụ tế bào vi khuẩn và cho phép các tế bào được viên kết tụ mà không cần ly tâm.
6. ChargeSwitch™ Plasmid ER Mini Kit: sử dụng công nghệ hạt từ tính cho phép tinh sạch DNA plasmid nhanh chóng và hiệu quả từ 1-5 ml nuôi cấy vi khuẩn qua đêm mà không sử dụng muối hỗn hợp, dung môi hữu cơ hoặc ethanol và tách được 20 μg DNA plasmid với tổng thời gian khoảng 10 phút sau khi chuẩn bị mẫu.

Tối ưu hóa cho việc chiết xuất DNA có độ tinh khiết cao hơn Cải thiện hiệu suất với giá đỡ từ đi kèm Share This: Facebook Twitter Google+ Pinterest Linkedin Whatsapp di truyen By Nguyen Dang at tháng 12 25, 2017 Gửi email bài đăng nàyBlogThis!Chia sẻ lên XChia sẻ lên FacebookChia sẻ lên Pinterest Labels: di truyen

4 nhận xét:

1. Unknownlúc 08:45 29 tháng 9, 2020

   Cho em hỏi dung dịch III là dung dịch gì ạ

   Trả lờiXóaTrả lời
   1. Unknownlúc 07:43 11 tháng 11, 2020

      sol III

      XóaTrả lời
      Trả lời
   2. ....lúc 03:18 16 tháng 5, 2021

      KOAc 5M

      XóaTrả lời
      Trả lời
   Trả lời
2. Dương Dươnglúc 06:48 16 tháng 9, 2021

   Tại sao khi cho SOl III vào lại chỉ trộn đều không vortex mạnh ạ

   Trả lờiXóaTrả lời
   Trả lời

Thêm nhận xétTải thêm... Bài đăng Mới hơn Bài đăng Cũ hơn Trang chủ Đăng ký: Đăng Nhận xét (Atom)

CHÚC BẠN MỘT NGÀY TỐT LÀNH!

SBC Scientific

Recent

Popular

• Tái bản DNA I. Chứng minh tái bản DNA theo cơ chế bán bảo thủ 1. Cơ chế tái bản bán bảo thủ 1.1. Cơ chế tái bản ở prokaryote Đặc điểm cơ bả...
• Phiên mã Phiên mã là quá trình tổng hợp RNA từ khuôn mẫu DNA. Quá trình này về phương diện hóa học và enzyme rất giống với quá trình tái bản DNA...
• Công nghệ DNA tái tổ hợp I. Mở đầu Vào năm 1973, một nhóm các nhà khoa học đã tạo ra cơ thể sinh vật đầu tiên với các phân tử DNA tái tổ hợp. Theo đó, Cohen...
• Dịch mã Dịch mã là quá trình các thông tin di truyền chứa trong các trình tự nucleotide của mRNA được sử dụng để tạo ra các chuỗi amino aci...
• Điều hòa biểu hiện gen Như chúng ta đã biết ba quá trình thiết yếu cho sự tồn tại của tế bào, đó là: tái bản, phiên mã và dịch mã. Tuy nhiên, tế bào không t...

Comments

Tags

chuyen gene (8) di truyen (40) dien di (1) PCR (4) sinh hoa (13)

Lưu trữ

Lưu trữ tháng 6 (11) tháng 5 (24) tháng 4 (3) tháng 3 (9) tháng 2 (2) tháng 1 (1) tháng 12 (14) Designed with by SBC Scientific | Powered By SBC Scientific