THAO TÁC TRONG PTN NUÔI CẤY VI SINH VẬT (Phần 3)

THAO TÁC TRONG PTN NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Cung cấp những kiến thức về kỹ năng thực hành các chỉ tiêu cơ bản trong đánh giá kiểm tra môi trường bằng phương pháp vi sinh vật trong việc phân tích vi sinh trong nước, đất và không khí. Nhận diện các đa dạng của vi sinh vật trong môi trường cùng sự phát triển và ảnh hưởng của chúng.

CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VÀ QUAN SÁT

HÌNH THÁI VI SINH VẬT

I. Phương pháp làm tiêu bản tạm thời :

1.1. Cách làm tiêu bản giọt ép

- Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi.

- Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí. Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống.

- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi.

1.2. Cách làm tiêu bản giọt treo

Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích

- Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.

- Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính.

- Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính.

- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính.

1.3. Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu

a. Nguyên tắc :

Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu.

b. Cách nhuộm :

+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh mêtylen 0,001% lên phiến kính.

+ Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm.

+ Đậy lá kính lên giọt dịch.

+ Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) rồi (x 40)

II. Phương pháp làm tiêu bản cố định :

2.1. Các bước tiến hành làm tiêu bản cố định

1. Làm vết bôi :

2. Cố định vết bôi :

Các cách cố định :

+ Cố định bằng nhiệt :

+ Cố định bằng hoá chất :

􀂃 Cách này tuy phức tạp nhưng không gây biến dạng tế bào, không gây biến đổi cấu trúc tế bào và không làm đứt các tiên mao.

􀂃 Người ta thường dùng các hoá chất là rượu và axêtôn để cố định vết bôi.

􀂃 Cách cố định : Có thể thực hiện một trong những cách sau :

o Nhúng vết bôi vào rượu. Với rượu 950 ngâm vết bôi từ 5 – 15 phút. Với rượu mêtylíc ngâm khoảng 2 - 5 phút.

o Ngâm vết bôi vào dung dịch axêtôn trong 5 phút.

o Nhỏ vài giọt rượu 90 - 950 lên vết bôi. Đốt cháy và dập tắt ngay. Làm như vậy vài lần rồi để khô.

2.3. Nhuộm màu tiêu bản cố định

a. Nguyên tắc :

- Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững.

- Tuỳ theo mục đích nghiên cứu và khả năng bắt màu khác nhau của các

thành phần tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm và cách nhuộm cho phù hợp.

- Có 2 cách nhuộm chính :

+ Nhuộm đơn : Chỉ dùng 1 loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản.

+ Nhuộm kép : Dùng đồng thời 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên

1 tiêu bản.

b. Cách nhuộm :

- Đặt tiêu bản lên cầu thuỷ tinh (đặt nằm ngang miệng một khay nhân, hoặc thuỷ tinh).

- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin Ziehl, để yên từ 1 - 2 phút.

- Rửa vết bôi bằng cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy nhẹ qua vết bôi đến khi nước chảy ra không còn màu nữa

- Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn

- Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 40) rồi chuyển sang vật kính (x 100) dùng dầu soi.

III. Quan sát đặc điểm sinh học của các nhóm vi sinh vật :

3.1. Quan sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn (Bacteria).

Người ta thường làm tiêu bản giọt ép và giọt treo để quan sát hình thái vi khuẩn sau khi nuôi cấy chúng ở nhiệt độ 370C sau 24 - 48h

3.2. Quan sát đặc điểm sinh học của xạ khuẩn (Actinomycetes)

Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát

- Hình dạng bào tử

- Đặc điểm cuống sinh bào tử.

- Phương thức hình thành chuỗi bào tử

Cách quan sát

- Làm tiêu bản giọt ép với Streptomyces griseus cấy trên thạch nghiêng.

3.3. Quan sát đặc điểm sinh học của nấm mốc (Molds)

Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát:

- Đặc điểm của sợi nấm: Màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn.

- Đặc điểm của cơ quan sinh sản: hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của cơ quan sinh sản.

- Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử.

Cách quan sát:

- Làm tiêu bản nấm mốc không nhuộm màu

- Vẽ hình và nhận xét về hình dạng chung của sợi nấm; vị trí, hình dạng, cách sắp xếp của bào tử, thể bình, cuống thể bình, cuống bào tử đính của 2 giống

nấm mốc trên.

- Thao tác sử dụng kính hiển vi soi nổi

- Làm tiêu bản nấm mốc nhuộm màu:

3.4. Quan sát đặc điểm sinh học của nấm men (Yeasts)

Những đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát.

- Hình thái, kích thước tế bào nấm men.

- Sự nảy chồi của nấm men

- Hình dạng, số lượng bào tử trong 1 túi bào tử.

Cách quan sát:

- Làm tiêu bản nhuộm đơn nấm men cấy trong môi trường dịch thể với

xanh mêtylen Loeffler.

- Quan sát sự nảy chồi của nấm men.

IV. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM KÉP - QUAN SÁT CẤU TẠO TẾ BÀO VI SINH VẬT

4.1 Các phương pháp nhuộm kép - Quan sát cấu tạo tế bào sinh vật:

- Nhuộm kép là phương pháp nhuộm trong đó người ta sử dụng 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản.

- Nguyên tắc của việc nhuộm kép

+ Các cấu trúc khác nhau, thậm chí các phần khác nhau của một cấu trúc

thường có tính chất lý học, hoá học cũng như khả năng bắt màu khác nhau.

+ Việc sử dụng đồng thời các loại thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản cho phép ta có thể quan sát và phân biệt các cấu trúc dễ dàng hơn.

1.Phương pháp nhuộm Gram :

a. Nguyên tắc :

- Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iôt mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.

+ Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương.

+ Loại phức chất thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm.

b. Cách tiến hành :

- Làm tiêu bản :

+ Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm 3 vết bôi trên phiến kính (hai đầu và giữa phiến kính).

+ Dùng que cấy lấy một chút khuẩn lạc của chúng làm vết bôi theo thứ tự sau:

􀂃 Bên trái phiến kính là Bacillus subtilis

􀂃 Bên phải phiến kính là Escherichia coli

􀂃 Ở giữa phiến kính là Bac.subtilis trộn lẫn với E. coli

+ Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên ngọn đèn cồn.

- Nhuộm tiêu bản

+ Đặt 3 miếng giấy lọc lên 3 vết bôi.

+ Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1phút

+ Nhuộm lugol trong 1 phút.

+ Rửa nước.

+ Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu.

+ Rửa nước.

+ Nhuộm bổ sung Fuchsin hay Safranin từ 10 - 30 giây

+ Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu.

- Kết quả:

+ Vết bôi của Bac. sublitis màu tím - gram dương.

+ Vết bôi của Bac. sublitis + E.Coli có màu hồng lẫn màu tím.

+ Vết bôi của E.Coli màu hồng - gram âm.

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG

TẾ BÀO VI SINH VẬT

Trong bất kỳ một loại mẫu vật nào, muốn biết số lượng chung của các nhóm vi sinh vật cũng như số lượng riêng của mỗi nhóm thành phần, đều cần phải đếm số lượng tế bào của chúng.

Để xác định số lượng vi sinh vật trong đất, nước, không khí và dịch nuôi cấy … người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau. Trong đó có 2 phương pháp dưới đây được dùng nhiều hơn cả :

- Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng phiến kính có khung đếm Goriaep (phòng đếm hồng cầu).

- Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch.

Nói chung cả 2 phương pháp trên đều phải tiến hành theo 2 bước sau đây:

I. Chuẩn bị mẫu:

Để xác định gián tiếp hoặc trực tiếp tế bào vi sinh vật

1.1. Lấy mẫu:

Tuỳ theo loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu để nghiên cứu với số lượng và khối lượng khác nhau cho phù hợp. Yêu cầu của việc lấy mẫu.

- Lấy mẫu có tính chất đại diện.

- Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý, hoá, sinh học.

- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng.

- Lấy mẫu xong phải phân tích ngay và không được để quá 24h.

- Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu và ghi vào sổ những đặc điểm của mẫu và nơi thu mẫu.

1.2. Pha loãng mẫu :

Chuẩn bị một số bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng và một số ống hút (1ml) vô trùng.

a. Mẫu ở trạng thái lỏng :

- Pha loãng mẫu theo dãy thập phân

b. Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực phẩm)

- Chuẩn bị 2 bình hình nón có dung tích 250 ml

+ Bình 1 chứa 90ml nước cất vô trùng

+ Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì

- Khử trùng cối chày sứ bằng cách cho một ít cồn vào và đốt lên. Sau đó để nguội.

- Cân 1 g đất (hoặc mẫu) cho vào cối sứ và nghiền nát mẫu.

- Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển toàn bộ mẫu sang bình 2.

- Lắc 5 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như mẫu ở trạng thaí lỏng.

- Tuỳ theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít

II. Phương pháp định lượng vi sinh vật :

Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau như đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển vi, định lượng gián tiếp thông qua mức độ cản ánh sáng (độ đục), đếm số khuẩn lạc mọc trên một môi trường xác định, định lượng một cách thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn ( phương pháp MPN) ...

2.1. Phương pháp cấy gạt:

a. Phương pháp cấy gạt (hộp trải)

- Tiến hành pha loãng mẫu theo phương pháp đã nêu trên.

- Ghi vào đáy đĩa Petri có môi trường thạch các thông tin :

. Nồng độ pha loãng.

. Ngày cấy.

- Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 md dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch (tương đương với 2 giọt dịch). Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều và không nên vượt quá vài trăm.

Lưu ý : có thể dùng thể tích mẫu cấy từ 0,05 - 0,5 ml. Tuy nhiên, thể tích mẫu cấy càng nhỏ thì sai số có thể xảy ra càng lớn.

Khi tất cả các thể tích 0,1 ml tế bào ở các độ pha loãng khác nhau đều đã được chuyển lên bề mặt thạch của đĩa Petri, sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch. Lưu ý rằng que cấy gạt thuỷ tinh phải được vô khuẩn trước khi được đưa vào đĩa Petri tiếp theo, bằng cách nhúng vào trong cồn, vẩy nhẹ để loại đi lượng cồn dư bám bằng que cấy, đốt cháy phần cồn còn lại trên que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Làm nguội que cấy bằng cách nhẹ nó vào bề mặt thạch, rồi dàn đều lượng chất lỏng chứa tế bào trên đó. Nếu thể tích chất lỏng đem cấy quá nhiều, các tế bào sẽ trôi dạt trong chất lỏng, và sau khi tế bào phân chia, hai khuẩn lạc xuất phát từ một tế bào có thể hình thành. Các đĩa thạch được chuẩn bị một ngày trước khi cấy thường hấp thu nhanh lượng chất lỏng đem cấy.

Lớp chất lỏng trên thạch càng mỏng, sự hấp thu xảy ra càng nhanh.

Dưới đây là phần thực nghiệm định lượng số tế bào vi sinh vật có trong mẫu bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc trên thạch đĩa.

Cách tiến hành :

- Cho một ít giống vi sinh vật vào ống nghiệm chứa 1 ít nước cất vô khuẩn nhờ que cấy vòng để tạo huyền phù tế bào. Cán bộ hướng dẫn có thể chuẩn bị trước các dịch huyền phù tế bào có nồng độ nằm trong khoảng xác định.

- Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở các nồng độ thích hợp như : 10-1 , 10-2 , … 10-n

tiến hành cấy mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào cac đĩa Petri (lặp ba, tức là cấy mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 3 đĩa Petri) theo hai phương pháp trên. Lưu ý rằng ở phương pháp cấy gạt, chỉ cấy 0,1 ml dịch mẫu lên môi trường thạch rắn đã đổ sẵn, còn đối với phương pháp đổ đĩa thì cấy 1 ml dịch mẫu vào đĩa trước khi thêm môi trường thạch lỏng đã nguội vào.

- Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài ở nhiệt độ 30oC và ủ trong 48 giờ.

- Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng tế bào trong 1ml mẫu theo công thức đã nêu trên.

Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng D1 được tính theo công thức là :

Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V

Trong đó : Ai là số khuẩn lạc trung bình/ đĩa

Di là độ pha loãng

V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)

Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.

2.3. Phương pháp định lượng bằng cách thống kê VSV bằng phương pháp pha loãng tới hạn:

Phương pháp MPN (Most Probable Number)

Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất ; số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.

Quy trình thực hiện định lượng theo phương pháp này là như sau : Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 1/10, 1/100, 1/1000). Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả biểu kiển chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục …), ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng ;

Bảng tra mpn dùng cho loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp

Số lượng ống dương tính	Số MPN/100 ml	Số lượng ống dương tính	Số MPN/1 00 ml
Số mo mẫu sử dụng		Số mo mẫu sử dụng