Thế Nào Là ADN Tái Tổ Hợp - Thả Rông

Kỹ thuật tái tổ hợp ADN được thực hiện như thế nào?Bao gồm 6 bước:1. Hai loại ADN được ly trích: ADN có chứa gen cần tạo dòng vàplasmid của vi khuẩn đóng vai trò của một vector.2. Cả ADN và plasmid được xử lý với cùng một loại enzyme giới hạn.Enzyme giới hạn tạo ra đầu dính ở plasmid và ADN cần tạo dòng.3. Đoạn ADN cần tạo dòng được trộn với plasmid.4. Nhờ enzyme ligase, các base ở đầu dính của plasmid sẽ gắn vớicác base bổ sung ở đầu dính của ADN tạo thành plasmid tái tổ hợp.5. Plasmid tái tổ hợp được chèn vào tế bào vi khuẩn.6. Sự tạo dòng gen. Vi khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp sẽ sinh sản.Khi vi khuẩn tạo thành một dòng tế bào, tất cả các gen của plasmid tái tổhợp cũng được tạo dòng.Hình 1: tr49LỚP 2NT1 TỔ 1CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN NỘI DUNG:Các enzyme giới hạnPhương pháp điện diCác vector chuyển genSự tạo ADN tái tổ hợpChèn ADN tái tổ hợp vào tế bào chủLỚP 2NT1 TỔ 1CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Các enzyme giới hạn: (retriction enzyme)Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhậnbiết những đoạn trình tự ADN nhất định và cắtADN ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận.Có 2 đặc tính:- Không cắt các liên kết photphodiesteở đầu tận cùng, thay vào đó là cắt bên trong phântử ADN.- Chỉ cắt khi nhận ra các trình tự đặcthù (trình tự nhận biết) bao gồm 4 đến 8 nucleotide( thường là 4 hay 6).LỚP 2NT1 TỔ 1CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN 1. Hiện tượng giới hạn:Các phage xâm nhiễm tế bào vi khuẩnvà sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vikhuẩn. Khi số lượng phage tăng lên hàng triệu bảnsao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên,trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn vẫnnguyên vẹn và phage cũng không sinh sôi. Nguyênnhân là do ADN của phage bị một hệ thống bảo vệcủa vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập. Đâychính là hiện tượng giới hạn.LỚP 2NT1 TỔ 1CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN 2. Tên gọi:Nguyên tắc:- Chữ thứ nhất viết hoa là chữ đầu tên của giống vi khuẩn từđó enzyme giới hạn được ly trích.- Chữ thứ hai và thứ ba không viết hoa, ứng với tên loài của vikhuẩn nói trên.- Chữ thứ tư viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng (nếu có).- Chữ số La mã chỉ thứ tự enzyme giới hạn được phát hiện( trong trường hợp nhiều enzyme giới hạn cùng được tìm thấy ở mộtloài vi khuẩn).Ví dụ tr50: enzyme EcoRIE = giống Escherichiaco = loài coliR = chủng RYI3I = enzyme đầu tiên được tìm thấy ở E.coliLỚP 2NT1 TỔ 1CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN 3. Phân loại:Có 3 nhóm chính:- Loại I: Khi enzyme nhận biết được trình tự, nó sẽ di chuyểntrên ADN đến cách đó khoảng 1000 -5000nucleotide.- Loại II: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.- Loại III: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ADN ở vị trí cách đókhoảng 20 nucleotide. Enzyme giới hạn loại II được sử dụng chủ yếu vì nó cắt tại vị trí giớihạn. Thường cắt ở trình tự chiều xuôi ngược như nhau. VD: EcoRILỚP 2NT1 TỔ 1CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Bảng 1: Nguồn, trình tự nhận biết và vị trí cắt của một số enzyme giới hạn. (tr51)ENZYMENGUỒNTRÌNH TỰ NHẬN BIẾT VÀ VỊ TRÍ CẮTAlu IAthrobacter lutues5 ------- A G C T ------ 33 ------- T C G A ------ 5Bal IBrevibaterium5 ------- T G G C C A ------ 33 ------- A C C G G T ------ 5Bam H IBacillus amyloliquefaciens5 ------- G G A T C C ------ 33 ------- C C T A G G ------ 5Eco RIEscherichia coli5 ------- G A A T T C ------ 33 ------- C T T A A G ------ 5Hae IIIHaemophylus aegypticus5 ------- G G C C ------ 33 ------- C C G G ------ 5Hind IIIHaemophylus influenzae5 ------- A A G C T T ------ 33 ------- T T C G A A ------ 5Sau 3AStaphylococcus aureus5 ------- G A T C ------ 33 ------- C T A G------ 5Taq IThermus aquaticus5 ------- T C G A ------ 33 ------- A G C T ------ 5LỚP 2NT1 TỔ 1CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Phương pháp điện di: (electrophoresis)Phương pháp điện di là quá trình phân tách một hỗnhợp các phân tử ADN nhờ một chất nền cố định (gel) trongmột điện trường. Điện di ADN:- Ở độ pH gần trung tính, ADN tích điện âm nên khichịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển về điệndương của điện trường.LỚP 2NT1 TỔ 1CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Điện di ADN- Bản gel hoạt động như một giá thể phân tách các đoạnADN.- Các lỗ được tạo ra trong bản gel được xem như cácgiếng chứa dung dich ADN.- Hai loại gel thường được sử dụng trong nghiên cứuADN là gel polyacrylamide và gel agaroseLỚP 2NT1 TỔ 1CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Điện di ADN- Dung dịch ADN chứa hỗnhợp các đoạn ADN cókích thước khác nhauđược đổ vào các giếngtrong bản gel.- Chất nền gel hoạt độngnhư một tấm sàng(sieve). Các phân tử ANDlớn đi qua các lỗ trongbản gel khó khăn hơn vàsẽ bị chậm lại so với cácphân tử AND nhỏ.LỚP 2NT1 TỔ 1CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN