Thường Quy Kỹ Thuật định Danh Nấm Mốc Aspergillus Flavus ...

1. Nguyên lý phương pháp

Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khóm nấm trên môi trường thạch Sabouraud sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 28 ± 1 o C trong thời gian 5 ngày. Số lượng bào tử nấm mốc có trong 1g(1ml) mẫu kiểm tra được tính từ số khóm nấm đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng.

Sau đó, để xác định tên (định danh) nấm mốc (đến nhóm) phải tiến hành qua nhận xét đại thể về đặc điểm khuẩn lạc nấm mốc (colony characters) và nhận xét vi thể về hình thái học của khuẩn lạc nấm mốc (morphology).

2. Phạm vi áp dụng

Định danh nấm mốc A.flavus, A.niger, A.fumigatus trong các sản phẩm lương thực thực phẩm.

3. Dụng cụ, môi trường và dung dịch cần thiết

3.1. Dụng cụ, thiết bị

Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật.

3.2. Môi trường, dung dịch cần thiết

- Thạch Sabouraud

- Thạch Czapeck

- Nước thạch 1 0 / 00

- Dung dịch Lactofenol Amann

4. Chuẩn bị môi trường và mẫu thử

4.1. Chuẩn bị môi trường

Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110 o C/30 phút hoặc 121 o C/15 phút).

4.2. Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử

4.2.1 Chuẩn bị mẫu

Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.

4.2.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10 -1

Cân chính xác 25g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 25ml thực phẩm lỏng), cho vào bình nón chứa sẵn 225ml nước thạch 1 0 / 00 . Lắc đều 2-3 phút, thu được dung dịch mẫu thử 10 -1.

4.2.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10 -2 , 10 -3, 10 -4 …

- Hút chính xác 1 ml dung dịch mẫu thử 10 -1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9 ml nước thạch 1 0 / 00 . Lắc đều trong 2-3 phút, thu được dung dịch 10 -2 .

- Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10 -3 , 10 -4 … .

4.3. Phương pháp tiến hành

Bước 1 : Nuôi cấy mẫu

- Ghi ký hiệu mẫu và nồng độ dung dịch mẫu thử lên hộp lồng.

- Dùng pipet 1 ml vô trùng, hút chính xác 1 ml từ dung dịch mẫu thử ở từng đậm độ cho vào giữa mỗi hộp lồng. Mỗi mẫu thực phẩm phải được nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ pha loãng. Mỗi đậm độ pha loãng phải được nuôi cấy trong 2 hộp lồng vô trùng và dùng 1 pipet 1 ml vô trùng riêng.

- Đun nóng chảy thạch sabouraud, để nguội đến 45 ± 1 o C. Trong điều kiện vô trùng chỉnh pH của thạch đến 4,5 ¸ 5,5 bằng dung dịch axit lactic 20 % , hoặc 40 % , hay bằng dung dịch axit xitric 20 % .

- Rót vào từng hộp lồng 12 ¸ 15 ml thạch sabouraud, trộn đều dung dịch mẫu thử với thạch bằng cách xoay tròn sang phải và sang trái 3 lần.

- Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang. Sau đó để các đĩa thạch vào tủ ấm 28 ± 1 o C hoặc nhiệt độ phòng thí nghiệm tương ứng trong 5 ngày. Không lật ngược các đĩa.

Lưu ý: Thời gian từ khi bắt đầu pha loãng mẫu thử đến khi rót thạch vào hộp lồng không được quá 30 phút.

Bước 2 : Sơ bộ nhận định kết quả

- Chọn các đĩa có không quá 50 khóm nấm để sơ bộ đọc kết quả.

- Đếm và ghi lại số khóm nấm nghi ngờ là A.flavus (có màu xanh lục hoặc vàng lục) ở từng đậm độ. Sau đó dùng que cấy nhọn đầu lấy một ít bào tử cấy ba điểm cách đều nhau trên đĩa thạch Czapek, ủ ấm 28 ± 1 o C trong 5 ngày. Không lật ngược các đĩa.

- Đếm và ghi lại số khóm nấm nghi ngờ là A.niger (có màu đen, hoặc nâu thẫm lấm tấm như bã cafe) ở từng đậm độ. Sau đó dùng que cấy nhọn đầu lấy một ít bào tử cấy ba điểm cách đều nhau trên đĩa thạch Czapek, ủ ấm 28 ± 1 o C trong 5 ngày. Không lật ngược các đĩa.

- Đếm và ghi lại số khóm nấm nghi ngờ là A.fumigatus (có màu xanh lá cây đậm hay còn gọi màu ám khói) ở từng đậm độ. Sau đó dùng que cấy nhọn

đầu lấy một ít bào tử cấy ba điểm cách đều nhau trên đĩa thạch Czapek, ủ ấm 28 ± 1 o C trong 5 ngày. Không lật ngược các đĩa.

Bước 3 : Định danh

Để xác định tên nấm mốc, từ những khóm nấm trên thạch Czapek tiến hành nhận xét đại thể, vi thể.

Đại thể: Bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay ta nhận xét về kích thước, màu sắc,… của khóm nấm.

Vi thể: Để nhận xét nấm mốc về vi thể phải làm tiêu bản nấm mốc, rồi quan sát hình thái học dưới kính hiển vi ở vật kính 10, 40. Có thể chọn 1 trong 2 cách sau để làm tiêu bản nấm mốc:

Cách 1 : Lấy một lam kính sạch, trong, đã sấy khô. Nhỏ 1 giọt Lactophenol Amann lên giữa lam kính. Dùng que cấy nhọn đầu lấy một phần khóm nấm mọc trên đĩa thạch Sabouraud (cả phần mọc trên và dưới mặt thạch) để vào giọt dung dịch Lactophenol Amann. Dùng kim có cán hay que cấy nhọn dìm nấm vào giọt dung dịch Lactophenol Amann để thấm ướt. Khi nấm bị thấm ướt hoàn toàn thì đậy lá kính lên trên và ép nhẹ.

Lưu ý:

- Khi đậy lá kính đừng để có bọt khí, nếu có sẽ gặp khó khăn trong khi soi kính.

- Khi ép nhẹ lá kính, nên dùng giấy thấm bớt dung dịch Lactophenol Amann thừa để dung dịch không tràn lên trên mặt lá kính.

Cách 2 : Lấy một lam kính sạch, trong, đã sấy khô. Lấy một đoạn giấy bóng kính có kích thước rộng khoảng 1cm, dài khoảng 2-3cm, rồi chạm vào khóm nấm mọc trên đĩa thạch Sabouraud sao cho lấy được toàn bộ hình thái của nấm (từ tế bào chân đế đến hạt đính). Sau đó trải dài giấy bóng kính trên lam kính.

Xác định tên nấm mốc

Tên nấm mốc	Đại thể	Vi thể
A.flavus (hình 2)	Khóm nấm mốc có đường kính d = 3 ¸ 5 cm trên thạch Czapek sau 5 ngày. Khóm nấm lúc đầu hơi vàng, cuối cùng trở nên xanh lục hoặc vàng lục, đôi khi hoá nâu khi già.	Bông lớn hình cầu, hình tia, đôi khi tạo thành những cột không rõ rệt. Bọng hình cầu đến gần cầu. Thể bình 1 hoặc 2 tầng, ở đa số loài thể bình 2 tầng. Vách cuống conidi xù xì. Hạt đính hình cầu đến gần cầu, trơn hoặc có gai.
A.niger (hình 3)	Khóm nấm mốc có đường kính 4 ¸ 5 cm trên thạch Czapek sau 5 ngày. Khóm nấm mốc màu đen hoặc nâu đen lấm tấm như bã cafe.	Bông hình cầu có màu đen. Bọng hình cầu. Thể bình 1 hoặc 2 tầng, ở đa số loài thể bình 2 tầng, Metulae dài gấp đôi tầng Phialides. Vách cuống conidi trơn. Hạt đính hình cầu đến gần cầu, có gai rõ.
A.fumigatus (hình 4)	Khóm nấm mốc có đường kính 3 ¸ 5 cm trên thạch Czapek sau 5 ngày. Khóm nấm có màu xanh lá cây đậm hay còn gọi là màu ám khói.	Bông hình cột (hình trụ) dày đặc, điển hình có đường kính chỗ nào cũng đều nhau ( vì chuỗi conidia kết lại tạo thành như những khúc trụ – columnar). Bông non không có hình cột, thường có dạng gục xuống một bên. Trên cùng một khóm nấm mốc ta thấy được cả 2 loại hình ảnh bông này. Vách cuống conidi trơn. Bọng hình chuỳ rõ. Thể bình dứt khoát một tầng.

Tính kết quả

Để xác định tổng số bào tử nấm mốc có trong 1g (1ml) mẫu kiểm nghiệm, chọn những đĩa có không quá 50 khóm nấm của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp. Sự phân bố các khóm nấm phải hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số khóm nấm càng ít. Kết quả được tính theo công thức sau:

N = C / ( n 1 + 0,1 x n 2 )x d

C : Số khóm nấm mốc đếm được trên các đĩa đã chọn.

n 1 , n 2 : Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp.

d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng thấp hơn.

1. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ lớn hơn 2 lần thì lấy giá trị ở đậm độ pha loãng thấp hơn để tính kết quả bằng cách tính trung bình cộng.

2. Nếu 2 đĩa của đậm độ pha loãng ban đầu có ít hơn 5 khóm nấm thì tính kết quả theo trung bình cộng.

Pha chế môi trường

1. Nước thạch

Thạch 1g

Nước cất 1000 ml

Pha chế: Đun nhỏ lửa, quấy đều đến khi sôi để hoà tan thạch. Rót vào các bình nón có dung tích 500 ml mỗi bình 225 ml môi trường và vào các ống nghiệm 18 mỗi ống 9 ml môi trường. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 120 o C/15 phút.

Môi trường được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 5 o C không quá 30 ngày.

2. Thạch Sabouraud

Pepton	10g
Glucose	20g
Thạch	15-20g
Nước cất	1000 ml

Pha chế: Đun nhỏ lửa, quấy đều đến khi sôi để hoà tan các chất. Rót vào bình cầu có dung tích 250 ml mỗi bình 150 ml môi trường. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 110 o C/30 phút.

Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội đến 45 ± 1 o C ở nồi cách thuỷ, nếu chưa sử dụng thì bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 5 o C không quá 30 ngày.

3. Thạch Czapek

NaN0 3	3,5g
K 2 HP0 4	1,5g
MgS0 4	0,5g
KCl	0,5g
FeS0 4	0,1g
Đường kính	30g
Thạch	20g
Nước cất	1000ml
pH = 4,5 ¸ 5,5

Pha chế: Đun nhỏ lửa, quấy đều đến khi sôi để hoà tan các chất. Để thạch nguội đến 45 ± 1 o C rồi chỉnh pH đến 4,5 ¸ 5,5. Rót vào bình cầu có dung tích 250 ml mỗi bình 150 ml môi trường. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 110 o C/30 phút. Thạch để nguội đến 45 ± 1 o C rồi đổ vào các hộp lồng, mỗi hộp 15 ¸ 18 ml thạch. Để đĩa thạch đông tự nhiên, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 5 0 C không quá 15 ngày.

4. Dung dịch Lactofenol Amann

Axít fenic tinh khiết	10g
Axít lactic	10g
Glyxerin	20g
Nước cất	10g

Pha chế: Các thành phần trên đều cân chứ không đong. Trộn đều và lắc kỹ 3 chất axít lactic, glyxerin, nước cất, rồi cho axít fenic vào lắc đều. Sau đó đựng hỗn hợp dung dịch trên trong lọ thuỷ tinh có nút mài tối màu, bảo quản nơi khô ráo, trong bóng tối ở nhiệt độ phòng. Dung dịch Lactofenol Amann khi mới pha thì không màu, nhưng để lâu dung dịch chuyển sang màu nâu nhưng vẫn dùng được.

Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng cho các loại rượu thu được từ quá trình chưng cất trực tiếp dịch lên men có nguồn gốc tinh bột, đường, hoặc thu được bằng cách pha chế từ cồn thực phẩm và nước.

2 Tiêu chuẩn viện dẫn

Quyết định 3742/2001/QĐ-BYT: "Quy định danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm".

Quyết định 1329/2002/BYT/QĐ: "Tiêu chuẩn vệ sinh nước ăn uống".

Quyết định 178/1999/QĐ - TTg: "Quy chế ghi nhãn hàng hóa lưu thông trong nước và hàng hoá xuất khẩu, nhập khẩu".

TCVN 378 : 1986 Rượu trắng. Phương pháp thử.

TCVN 1052 : 1971 Etanol tinh chế. Yêu cầu kỹ thuật.

TCVN 3217 : 1979 Rượu. Phân tích cảm quan. Phương pháp cho điểm.

TCVN 5501 : 1991 Nước uống. Yêu cầu kỹ thuật.

TCVN 5989 : 1995 (ISO 5666-1 : 1983) Chất lượng nước. Xác định thủy ngân tổng số bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa. Phương pháp sau khi vô cơ hoá với Penmaganat-Pesufat

TCVN 6193 : 1996 (ISO 8288 : 1996) Chất lượng nước. Xác định niken, coban, đồng, kẽm, cadimi và chì. Phương pháp trắc phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa.

TCVN 6626 : 2000 (ISO 11969 : 1996) Chất lượng nước. Xác định hàm lượng asen. Phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử.

3 Định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng định nghĩa sau:

3.1 Rượu trắng (Distilled alcoholic beverages): Đồ uống có cồn được chưng cất từ dịch lên men có nguồn gốc tinh bột, đường, hoặc được pha chế từ cồn thực phẩm và nước.

4 Yêu cầu kỹ thuật

4.1 Nguyên liệu

4.1.1 Nước dùng để pha chế rượu trắng: theo TCVN 5501 : 1991.

4.1.2 Etanol dùng để pha chế rượu trắng: theo TCVN 1052 : 1971.

4.1.3 Nước dùng để sản xuất rượu trắng theo Quyết định số 1329/ 2002 của Bộ Y tế về “Tiêu chuẩn vệ sinh nước ăn uống”.

4.2 Yêu cầu cảm quan Các chỉ tiêu cảm quan đối với rượu trắng được quy định trong bảng 1.

Bảng 1 – Yêu cầu cảm quan

Tên chỉ tiêu	Yêu cầu
1. Màu sắc	Không màu hoặc trắng trong
2. Mùi	Mùi đặc trưng của nguyên liệu lên men, không có mùi lạ
3. Vị	Không có vị lạ, êm dịu
4. Trạng thái	Trong, không vẩn đục, không có cặn

4.3 Chỉ tiêu hóa học

Các chỉ tiêu hóa học của rượu trắng chưng cất từ dịch lên men được quy định trong bảng 2.

Bảng 2 – Các chỉ tiêu hóa học của rượu trắng

Tên chỉ tiêu	Mức
1. Hàm lượng etanol (cồn) ở 20 0 C, tính theo % (V/V),	Theo tiêu chuẩn đã được công bố của nhà sản xuất
2. Hàm lượng aldehyt, tính bằng miligam aldehyt axetic trong 1 l rượu 100 0 , không lớn hơn	50
3. Hàm lượng este, tính bằng miligam este etylaxetat trong1 l rượu 100 0 , không lớn hơn	200
4. Hàm lượng metanol trong 1 l etanol 100 0 , tính bằng % (V/V), không lớn hơn	0,1
5. Hàm lượng rượu bậc cao tính theo tỷ lệ hỗn hợp izopentanol và izobutanol, hỗn hợp 3:1, tính bằng miligam trong 1 l etanol 100 0	Theo tiêu chuẩn đã được công bố của nhà sản xuất
6. Hàm lượng furfurol, mg/l, không lớn hơn	Vết

4.4 Giới hạn hàm lượng kim loại nặng

Giới hạn tối đa hàm lượng kim loại nặng được quy định trong bảng 3.

Bảng 3 – Giới hạn tối đa hàm lượng kim loại nặng

Tên chỉ tiêu	Giới hạn tối đa (mg/l)
1. Asen (As)	0,2
2. Chì (Pb)	0,5
3. Thủy ngân (Hg)	0,05
4. Cadimi (Cd)	1,0
5. Đồng (Cu)	5,0
6. Kẽm (Zn)	2,0

4.5 Phụ gia thực phẩm

Phụ gia thực phẩm: theo "Quy định danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm" ban hành kèm theo Quyết định 3742/2001/QĐ-BYT.

5 Phương pháp thử

5.1 Xác định các chỉ tiêu cảm quan của rượu, theo TCVN 3217 : 1979.

5.2 Xác định hàm lượng etanol, theo TCVN 378 : 1986.

5.3 Xác định hàm lượng metanol, theo TCVN 378 : 1986.

5.4 Xác định hàm lượng este, theo TCVN 378 : 1986.

5.5 Xác định hàm lượng aldehyt, theo TCVN 378 : 1986.

5.6 Xác định hàm lượng rượu bậc cao (dầu fusel), theo TCVN 378 : 1986

5.7 Xác định hàm lượng asen, theo TCVN 6626 : 2000 (ISO 11969 : 1996).

5.8 Xác định thủy ngân tổng số, theo TCVN 5989 : 1995 (ISO 5666/1 : 1983).

5.9 Xác định đồng, kẽm cadimi và chì, theo TCVN 6193 : 1996 (ISO 8288 : 1996).

6 Bao gói, ghi nhãn, bảo quản và vận chuyển

6.1 Bao gói

Rượu trắng phải được đựng trong các chai kín, chuyên dùng cho thực phẩm và không ảnh hưởng đến chất lượng của rượu.

6.2 Ghi nhãn

Theo "Qui chế ghi nhãn hàng hóa lưu thông trong nước và hàng hoá xuất khẩu, nhập khẩu" ban hành kèm theo Quyết định số 178/1999/QĐ - TTg.

6.3 Bảo quản

Các thùng đựng rượu trắng phải để nơi khô ráo, bảo đảm vệ sinh và tránh ánh nắng trực tiếp.

6.4 Vận chuyển

Phương tiện vận chuyển rượu trắng phải khô, sạch, không có mùi lạ và không ảnh hưởng đến chất lượng của rượu.