Tìm Hiểu Quy Trình định Tính Alkaloid Trong Cây Thuốc Thượng - 123doc

Tải bản đầy đủ (.docx) (45 trang)

1. Trang chủ
>>
2. Y - Dược
>>
3. Bào chế

Tìm hiểu quy trình định tính alkaloid trong cây thuốc thượng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.24 MB, 45 trang )

Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.Chương IMỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đềCác dược liệu có nguồn gốc từ thực vật rất phong phú và đa dạng. Từ bao đờinay, nhân dân ta đã biết sử dụng các loài cây cỏ xung quanh mình làm thuốc chữabệnh, từ các loại bệnh thông thường đến các bệnh khó chữa trị, đặc biệt đối với đồngbào người miền núi, họ sống phụ thuộc khá nhiều vào núi rừng. Việt Nam là nơi cónguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng cộng với vốn kiến thứccủa người dân bản địa đã được tích lũy từ bao đời nay thì việc tìm kiếm, nghiên cứu vàphát huy việc sử dụng dược liệu có nguồn gốc thực vật là việc làm cần thiết.Hiện nay theo thống kê trên thế giới về cây dược liệu ở châu Âu có tới 1482 câychữa bệnh, châu Á có 3650 cây chữa bệnh với nhiều nhóm công dụng khác nhau. Hiệncó khoảng 30% tổng giá trị thuốc chữa bệnh do cây dược liệu cung cấp được khai tháctừ trong tự nhiên và được trồng trọt.Sau khi khảo sát các cây thuốc về nhiều phương diện khác nhau, chúng ta thấyrằng ngay trong phạm vi riêng biệt của ngành dược, các phương thức sử dụng cũng rấtphong phú. Ngoài việc sử dụng phương thức cổ truyền dùng nguyên dạng hay ở dạngbào chế, càng ngày các cây cỏ càng được sử dụng nhiều để chiết xuất các chất có hoạttính sinh học dùng bào chế thành dạng thuốc chữa bệnh.Ngày nay, chúng ta không thể phủ nhận được tầm quan trọng của việc điều trịbằng dược phẩm tây y nhưng bên cạnh hiệu quả điều trị, các dược phẩm này thường đểlại tác dụng phụ. Vì thế, xu hướng hiện nay trên thế giới là quay lại nghiên cứu nguồnthuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật.Trong xu hướng đó, ở núi Bà Nà – Đà Nẵng có cây thuốc thượng thường đượcngười dân dùng để trị thương nhưng chưa được nghiên cứu rộng rãi. Để bảo tồn vàphát triển dược liệu này thì việc định danh và nghiên cứu nó là một trong những côngtác cần thiết.1Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.1.2 Yêu cầuTìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.1.3 Nội dung thực hiệnÁp dụng phương pháp sắc kí cột để tách Alkaloid.Sử dụng sắc kí lớp mỏng để kiểm tra sự có mặt Alkaloid trong cây thuốcthượng.CHƯƠNG IITỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY THUỐC THƯỢNGTên thông dụng: thuốc Thượng, thuốc Mọi, Da xà lắc, thuốc dấu cà doong.Tên khoa học: Phaeanthus vietnamensis Ban.Giới: Thực vậtNgành: MagnoliophytaLớp: MagnoliopsidaBộ: MagnolialesHọ: Annonaceae (Na)Chi: PhaeanthusMô tả: Cây gỗ nhỏ hoặc cây bụi, cao 2-10m. Cành non gần như không lông. Lá thuôn hoặcgần hình mác, dài 9-16cm, rộng 3-6,5cm, đầu có mũi dài và mọn, gốc hình nêm hơi lệch,không lông; gân bên 9-11 đôi; cuống dài 5-6mm. hoa mọc sole với lá, thường thành xim 2hoa. Hoa có cuống dài 1,5-3cm, mang 4-6 lá bắc nhỏ; lá đài và cánh hoa ngoài rất giống nhau,dài trên 1mm; nhị nhiều, lá xoăn nhiều. Thân quả hình trái xoan, cỡ 12-15 x 6-7mm, không cólông, khi chín màu vàng sau chuyển thành màu mận chín; cuống dài 13-15mm , vỏ quả rấtmỏng. Ra hoa tháng 5-12, có quả tháng 6-1.2Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.Nơi sống và thu hái: thấy ở trung bộ Việt Nam: Thừa Thiên – Huế (Phú Lộc),Quảng Nam – Đà Nẵng (Đại Lộc, Quế Sơn, Núi Thành, Duy Xuyên, Tiên Phước,Phước Sơn).Công dụng: Dân gian dùng lá non hấp chín trên nồi cơm, lấy nước nhỏ mắtchữa đau mắt đỏ. Vỏ rễ, vỏ thân và lá đem nấu cao dán chỗ mụn nhọt sưng tấy. Câycòn có tác dụng chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lị, tác dụng cầm máu vết thương ngoàida.Là loài hiếm gặp, bị khai thác thường xuyên nên cần bảo vệ giữ giống.Hình 1 Thân, lá, trái của cây thuốc thượng2.2 Đại cương về alkaloidHình 2 Alkaloid không có nhân dị3vòngTìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.Alkaloid có nhân dị vòngHình 3 những alkaloid là dẫn xuấtcủa nhân quinolinHình 4 Alkaloid có khungaporphine: roemerin trong củ bình vôi.Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên hiện diện khá nhiều trong các họthực vật với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Trên thực tế có rấtnhiều loài thực vật có alkaloid nhưng ở mức độ vết hoặc tỉ lệ phần vạn. Để giới hạnvới ý nghĩa thực tiễn, một cây được xem là có alkaloid phải chứa ít nhất 0.05%alkaloid so với mẫu cây khô.4Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.Do danh sách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng được chosố lượng alkaloid rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi, các alkaloid được chia làm 3loại: alkaloid thật, protoalkaloid và giả alkaloid (Pseudoalkaloid).-Alkaloid thật là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base,thường có chứa nguyên tử nito trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổnghợp từ amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong câydưới dạng muối của một acid hữu cơ, ngoại trừ: colchicin, acid aristolochir,alkaloid tứ cấp. Các alkaloid dạng này thường được chia thành nhóm theonguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (ornithin, lysin, phenylalanin,-tryptophan, histidin, acid antranilic,...) hơn là theo vòng dị hoàn.Các protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cảmescalin và N, N-dimetyltryptamin. Chúng là những amin đơn giản, đượctổng hợp từ những amino acid, trong đó nguyên tử nito không ở trong vòng-dị hoàn.Các giả alkaloid, là những hợp chất không bắt nguồn từ amino acid, baogồm hai nhóm hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid (thí dụconessin) và purine (cafein).Hầu hết các alkaloid hiện diện trong cây có hoa, loại 2 lá mầm, nhưng ngườita cũng thấy alkaloid trong động vật, côn trung, sinh vật biển, vi sinh vật,...Chỉ có một đặc điểm chung thường gặp là tên của các alkaloid thường tậncùng bằng chữ “ine”.Các đặc tính hóa- lý của alkaloidĐa số alkaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn với điểm nóng chảy xácđịnh hoặc có khoảng nhiệt độ phân hủy. Một vài alkaloid ở dạng nhựa vô dịnh hình,một vài alkaloid ở dạng lỏng (nocotin, coniin) và một vài alkaloid có màu (berberinmàu vàng, betanidin màu đỏ).Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt của nguyên tửnito. Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhómthế R (mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nito. Các alkaloid tínhbase yếu thì phải cần môi trường acid mạnh, để tạo thành muối, tan trong nước.5Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.Các alkaloid ở dạng base tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thườngtan tốt trong dung môi hữu cơ như chloroform, dietyl eter, alcol bậc thấp. Các muốicủa alkaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơnhư chloroform, dietyl eter, benzen. Các protoalkaloid và giả alkaloid thường dễ tantrong nước.Tính hòa tan của các alkaloid đóng vai trò quan trọng trong việc chiết táchalkaloid ra khỏi cây cũng như trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc đểuống.Nói chung alkaloid là hợp chất tương đối bền, tuy vậy, một số hợp chất thuộcloại dẫn xuất của indol, dễ bị hủy hoặc biến chất khi gặp ánh sáng hoặc các tác nhânoxid hóa.Các thuốc thử để định tính alkaloid:Thuốc thử MayerThuốc thử DragendorffThuốc thử WagnerThuốc thử IodoplatinatĐịnh tính AlkaloidMuốn định tính alkaloid phải chiết alkaloid và loại những chất kèm theo gây trởngại cho các phản ứng. Sau đó làm phản ứng tạo tủa để xác định xem có alkaloidhay không. Muốn xác định xem đó là alkaloid gì thì làm phản ứng màu đặc hiệu,ngày nay thường kết hợp với phương pháp sắc kí nhất là sắc kí lớp mỏng cóalkaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh.2.3 Kĩ thuật sắc kí2.3.1 Đại cương về sắc kí2.3.1.1 Khái niệm sắc kí6Hình 5 Sự tương tác giữa tướng tĩnh tướngđộng với chất cần phân tíchTìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.Sắc ký (Chromatography) là phương pháp tách, phân ly, phân tách các chất dựavào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh.Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động vàpha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, …). Trong hệthống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Cácchất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trìnhchuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đilặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽchuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này.Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.2.3.1.2 Cơ sở khoa học của phương pháp sắc kí.Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai phađộng và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất,nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòngpha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký.7Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.2.3.1.3 Phân loại sắc kíTrong phương pháp sắc ký, pha động phải là các lưu thể (các chất ở dạng khíhay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng tháitập hợp của pha động, người ta có thể chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí (GasChromatography- GC) và sắc ký lỏng (Liquid Chromatography). Dựa vào cơ chế traođổi của các chất giữa hai pha động và tĩnh người ta lại chia các phương pháp sắc kýthành các nhóm nhỏ hơn.••••Sắc kí cộtSắc kí lớp mỏngSắc kí trao đổi ionSắc kí gel2.3.2 Sắc kí cột2.3.2.1 silca gel2.3.2.1.1 silica gel pha thường.Silica gel làm pha tĩnh trong sắc ký được chế tạo bằng cách thủy giải silicatnatri (cho tác dụng với acid sulfuric) để tạo thành acid polysilisic, tiếp theo là sựngưng tụ và polymer hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kíchcỡ hạt, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt... như yêu cầu.Các nhà sản xuất có thể trộn thêm các chất làm bám dính để silica gel có thểbám dính lên tấm bản mỏng (loại dùng để tráng bản mỏng). Tiếp vĩ ngữ “G” đượcsử dụng thống nhất trên thế giới để cho biết rằng silica gel đó có trộn thêm khoảng10% (w/w) chất kết dính [CaSO4, (0.5 H2O)]. Các nghiên cứu cho thấy sự hiện diệncủa các ion calci không làm ảnh hưởng đến khả năng tách chất của silica gel.Cũng có thể hiệu chỉnh tính hấp thu của silica gel bằng cách cho silica gelkết hợp với những hợp chất khác như các base, các dung dịch đệm ở mức pH xácđịnh. Cũng có thể thêm nitrat bạc để làm gia tăng khả năng tách các hợp chất, nhấtlà các alcen.Silica gel là polymer ba chiều của những đơn vị tứ diện oxyd silicon SiO 2,H2O và trên bề mặt hạt gel có những lỗ rỗng. Hạt silica gel sử dụng cho sắc ký cộtcổ điển có đường kính hạt trung bình khoảng 40- 200µm, các lỗ rỗng có đường kính8Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.trung bình khoảng 40- 300Å, diện tích bề mặt khoảng 100- 800m 2/g. Loại silica geldùng cho sắc ký lớp mỏng có đường kính hạt khoảng 5- 25µm, đường kính lỗ rỗng6nm, nên đã tạo ra một phần tính chất đuổi các hợp chất có trọng lượng phân tửtrong khoảng 500- 1000 Dalton. Hạt silica gel dùng cho loại sắc ký cột HPLC chỉđể định tính, có diện tích bền mặt 200- 500m 2/g, có kích thước nhỏ 2- 8 µm. Hạtsilica gel HPLC để cô lập hợp chất, có diện tích bề mặt 500- 800m 2/g, có kích thướclớn hơn 40- 60 µm.Các vị trí hoạt động trên bề mặt của hạt silica gel là các nhóm silanol, mỗinhóm cách nhau 5Å. Muốn điều chỉnh hoạt tính của bề mặt silica gel chỉ cần thêmhoặc loại bớt nước. Khi silica gel hấp thu nước, các phân tử nước sẽ che khuấtnhững vị trí hoạt động trên bề mặt của silica gel làm hạt bị giảm hoạt tính; muốnsilica gel tăng hoạt tính trở lại, chỉ cần đun nóng để loại bỏ nước. Đây là quá trínhthuận nghịch, muốn làm giảm hoạt silica gel thì chỉ cần cho thêm nước vào. Tuynhiên, khi đun nóng khoảng 400- 500 0C, quá trình thuận nghịch biến mất, silica gelbị mất vĩnh viễn hoạt tính bề mặt, do hai nhóm silsnol kề bên đã bị mất một phân tửnước, tạo thành nối ester, không có hoạt tính sắc ký.Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm silanol-OH; đây lànhững tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với những hợp chất đượcsắc ký. Vì thế, khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, những hợp chất phân cực(có mang nhóm chức –OH,NH2, -COOH...) có khả năng tạo nối hydrogen mạnh, bịsilica gel giữ chặt lại trong cột và bị giải ly ra muộn hơn so với những chất khác cótính kém phân cực như alcan, terpen (là những hợp chất không chứa những nhómchức có thể tạo nên nhóm hydrogen)ít bị silica giữ lại, sẽ ra khổi cột sớm.Tuy nhiên cũng cần nhớ là với một hợp chất nào đó đang bị silica gel giữ lạitrong cột, giải ly chất đó ra khỏi cột được hay không cũng còn tùy vào việc sử dụngdung môi giải ly mạnh hay yếu. Dung môi nào có thể tạo nối hydrogen mạnh sẽ làdung môi thích hợp để giải ly các hợp chất phân cực mạnh ra khỏi cột silica gel.Methanol thường dduocjw chọn để đuổi hết các chất còn sót lại trong cột silica gel.Hơn nữa, muốn đuổi hết các hợp chất phân cực thí dụ các flavonoid glycosid,triterpen glycosid nên dùng 1-2% acid acetic trong methanol.9Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.Lưu ý rằng khi sử dụng dung môi là methanol hoặc nước, hai loại dung môinày có thể hòa tan một lượng nhỏ silica gel khiến cho dung dịch giải ly hứng đượccó chứa một ít silica gel, gây hiểu lầm rằng đó là hợp chất thu được. Silica gel dễdàng hòa tan trong nước có pH nhỏ hơn 7.2.3.2.1.2 silica gel chế hóaSilica gel tác dụng với chlorodimetylalkylsilan R-Si(CH 3)2-Cl để biến đổi silicagel này thành loại chất hấp thu mới có tính không phân cực. Dây alkyl R có thể là C-1,C-2, C-6, C-8, C-10 và C-18, tuy nhiên, người ta thường hay chế tạo dây C-8 và C-18.Trong các loại silica gel thương phẩm, 40-60% các nhóm silanol bị biến thànhcác dẫn xuất. Các loại silica gel này rất bền, chịu được dung môi ở áp suất 6000psitrong khoảng pH 2.0- 8.5. một vài loại dẫn xuất như polystyrene, divinylbenzen cònbền hơn cả silica gel C-18, chịu được khoảng pH 1.0- 13.0.Loại silica gel pha đảo có tính kém phân cực, nên có ái lực mạnh với các hợpchất kém phân cực, giữ chặt các hợp chất này lại trong cột. Pha động thường là nước.Bên cạnh dung môi nước, người ta thêm vào những dung môi hữu cơ như methanol,acetonitril, tetrahydrofuran với nồng độ tăng dần trong quá trình sắc ký (nghĩa là trongquá trình giải ly, dung môi giải ly càng lúc càng kén phân cực), như thế những hợpchất phân cực sẽ được giải ly ra khỏi cột trước và những chất kém phân cực sẽ được rasau.Người ta thường thêm vào một tỉ lệ nhỏ 0.01- 0.1 acid trifluoroacetic (TFA) vàopha động.2.3.2.2 Sắc kí cột hở.Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thườnglà những hạt có kích thước tương đối lớn (50- 150 µm), được nạp trong cột bằngthủy tinh. Mẫu chất cần phân tách được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có mộtlớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giảily được đặt phía trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột, đượchứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Hệ thống như thế thường làmcho sự tách chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy vậy,sắc ký cột hở cũng có ưu điểm như pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễkiếm; có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất.10Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.2.3.2.2.1 Lựa chọn chất hấp thụ và dung môi để khởi đầu giải ly.Tùy thuộc vào tính phân cực của mẫu chất cần phân tích, vói những hợp chấtrất phân cực, nên sử dụng sắc lý trao đổi ion hoặc sắc ký lọc gel. Còn bình thườngthì sử dụng sắc ký hấp thu.2.3.2.2.2 chọn dung môi bắt đầu cho quá trình sắc kí cột.Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng đểdò tìm hệ dung môi cho phù hợp, các bước tuần tự như sau: B1: mẫu cần sắc ký được hòa tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp, vớinồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). B2: chẩu bị 4-6 tấm bản mỏng 2.5x10cm. chấm lên những tấm bản này, mỗitấm một chấm khoảng 2-5 µl dung dịch (A). B3: mỗi bản mỏng được triên khai với một loại dung môi dung ly khác nhau,kế đó hiện hình các vết trên bảng bằng đèn UV hoặc bằng các thuốc thử. Vớiđơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào là phù hợp. Từ kết quả đó,cố gắng tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi kém phân cực vàmột dung môi phân cực, thí dụ eter dầu hỏa: etyl acetat B4:• Với hỗn hợp mẫu chất là kết quả của một phản ứng tổng hợp hữu cơ (hỗnhợp chứa 2-3 hợp chất), hãy chọn hệ dung môi nào mà có thể đẩy hợpchất cần quan tâm lên ở vị trí trên bản với Rf=0.2-0.3.• Đối với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ (cao có chứa nhiều hợp chất từkhông phân cực đến rất phân cực), chọn dung môi giải ly đầu tiên là dungmôi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết, lên vị trí ở bản vớiRf=0.5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vếtphân cực nhất của cao chiết, lên vị trí ở bản với Rf=0.2.Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi nàycho sắc ký cột. Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tínhphân cực cho dung môi giải ly.Lưu ý:• Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và của sắc ký cột giống nhau.11Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.• Dung môi để giải ly cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thực nghiệmnêu trên, nhưng phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cựcmột ít so với hệ dung môi đã chọn. Bởi vì chất hấp thu, thí dụ silica gel,trnags trên bản mỏng là loại silica gel dùng cho sắc ký lớp mỏng, với cỡhạt nhuyễn mịn, lại được phun xịt tráng lên bản bằng áp lực lớn nên có độchặt chẽ lớn. Trong khi đó chất hấp thu do nghiên cứu viên tự nạp trongphòng thí nghiệm là loại silica gel dùng cho sắc ký cột, với cỡ hạt lớnhơn, lại được nạp vào cột ở áp suất thường, nên có tính chất lỏng lẻo hơn.2.3.2.2.3 tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với kích thước cột.Sắc ký cột hở là sắc ký mà chất hấp thu được nhối vào trong cột bằng thủytinh. Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lượng mẫu chất cần phân tách. Cột nhỏ nhấtcó thể tích chỉ vài ml với đường kính cột vài mm, chiều dài cột vài cm, trong khi cộtlớn nhất có đường kính cột vài cm và chiều dài cột dài tương ứng.Muốn tách chất được tốt, các kết quả thực nghiệm cho thấy có mối liên quangiữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột.2.3.2.2.4 tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần phân tách và lượng chất hấp thu.Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì trọng lượng chấthấp thu phải lớn hơn 20-50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc ký (tính theo trọnglượng). Tuy nhiên, với những hỗn hợp các hợp chất khó tách riêng thì cần sử dụngsố lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100-200 lần), còn với các hỗn hợp dễ táchthì có thể sử dụng lượng chất hấp thu it hơn.Vì thế trước khi tiến hành sắc ký, phải dự đoán trước rằng với một lượngmẫu chất muốn tách (x gam) phải cần bao nhiêu lượng chất hấp thu, sao cho chấthấp thu chiếm một chiều cao phù hợp trong cột mà cột vẫn còn chỗ để chứa dungmôi. Với lượng chất hấp thu cụ thể, phải đi tìm một cột sắc ký với kích thước phùhợp.12Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.2.3.2.2.5 tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đường kính trongcột sẮc ký.Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt, chiều cao củachất hấp thu nạp trong cột cần đạt tỉ lệ: chiều cao chất hấp thu: đường kính trongcủa cột vào khoảng (10:1).Muốn biết lượng chất hấp thu có phù hợp với cột thì cho chất hấp thu khôvào cột để quan sát.Kết quả thực nghiệm để tách chất tốt:2.3.2.2.6 Nạp chất hấp thụ vào cột.a Nạp chất hấp thụ dạng sệt vào cộtt.Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá. Nếu phần đầu ra cột không cómiếng bông thủy tinh xốp để chặn thì có thể dùng một bông thủy tinh để chặn, tiếptheo phủ cát lên để có được một mặt bằng phẳnChất hấp thu được nạp vào cột dưới dạng sệt, được chuẩn bị như sau:Trong một becher đã có chứa sẵn dung môi (dung môi là loại dung môi ít phâncực nhất được dùng để bắt đầu cho quá trình giải ly cột), cho chất hấp thu vào becher,đều dặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều. Lưu ý: không được thựchiện ngược lại, nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hất thu gặp dungmôi sẽ phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất. Lượng dungmôi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến cho bọt khí sẽ bị bắtgiữ trong cột và cũng không được quá lỏng.Nhờ một phễu lọc có đuôi dài, đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mởnhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để ở bêndưới cột, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột.Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng mộtthanh cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột.Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần để việcnạp cột được chặt chẽ, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.13Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.Lưu ý trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cộthứng, lượng dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột. không được đểcho đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn phải có dung môi phủ trên phần đầu cột.Sau khi nạp xonh, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang. Nếu mặtthoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũathủy tinh khuấy đão nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng, làm xáo một phần chấthấp thu ở trên đầu cột, để yên, chất hấp thu lắng xuống từ từ tạo nên một mặt thoángbằng phẳng.Đối với loại chất hấp thu có thể trương nở (chất hấp thu trong sắc ký lọc gel vàtrao đổi ion), cần có thời gian để gel trương nở. Thường người ta thêm đủ lượng dungmôi để làm thành hỗn hợp sệt và để yên suốt một đêm, hôm sau thêm dung môi vào đểhỗn hợp sệt có thể rót chảy, để rót vào cột.b. Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột.Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cựcnhất có thể vào khoảng hai phần ba chiều cao cột. Ngang qua một phễu lọc có đuôidài, cho chất hấp thu ở dạng bột khô vào thẳng trong cột, đều dặn, mỗi lần một lượngnhỏ, vừa cho vào vừa khõ nhẹ thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều caokhoảng 2cm trong cột, thì mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứngvào một becher trống để ở bên dưới cột, dung môi được sử dụng lại để rót trả lại lênđầu cột.Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi thấy chấthấp thu trong cột có dạng đồng nhất.Cả hai cách nhồi cột đều cho kết quả tốt nếu thực hiện việc nạp cột một cáchcẩn thận. Trong trường hợ sau khi nạp xong, quan sát thấy có rất nhiều bọt khí, cónhững “bất thường” trong cột thì phải xả hết cột và nạp lại từ đầu.14Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.2.3.2.2.7 Đặtt chất cần tách lên đầu cột sắc kí.a. Nạp mẫu ở dạng dung dịch.Nếu mẫu chất ở dạng lỏng, có thể cho trực tiếp mẫu lên đầu cột sắc ký. Nếumẫu ở dạng rắn, hòa tan mẫu chất vào một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi khởiđầu cho sắc ký cột.Dung dịch mẫu có nồng độ càng đạm đặc càng tốt, vì như thể lớp dung dịch nàynằm thành một lớp mỏng trên đầu cột. Có thể áp dụng tính toàn cụ thể như sau: thểtích dung môi V= 0.4 x D 2 với D là đường kính trong của cột tính bằng mm; V tínhbằng ml.Thực hiện việc nạp mẫu lên đầu cột như sau:Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột, để hạ mức dung môi trong cột xuốngsao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột. mặt thoáng của chất hấp thulúc này phải nằm ngang đều.Đóng khóa lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột. muốn nạp mẫu, sử dụng trongmột pipette để hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu của pipette gần sát với mặt thoáng củachất hấp thu trong cột, vừa góp vừa rây pipette dọc quanh thành trong của cột, chodung dịch chất chảy ra dọc theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt của chất hấpthu.Mở khóa bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu đượcthấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu ở đầucột bị khô.Dùng pipette cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, tranh thủ dùngdung môi này để rửa sạch thành ống mà nãy giờ dung dịch mẫu chất đã trây dính trênthành cột. Lại mở khóa, cho dung môi chảy ra. Lặp lại vài lần việc rửa thành cột nhưthế để giúp cho đungịch mẫu chất thấm sâu vào phần chất hấp thu ở phần đầu cột. Lặplại như thế cho đến khi cho một ít dung môi lên đầu cột, dung môi sẽ trong suốt khôngmàu (không bị lây màu của chất mẫu).Cho một lớp cát dày khoảng 3-6mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấpthu để bảo vệ mặt cột. Nếu không có cát, có thể sử dụng bông thủy tinh, bông gòn,15Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.giấy lọc có đường kính vừa bằng với đường kính trong của cột. Cẩn thận để không làmxáo trộn bề mặt đang nằm ngay ngắn.Cuối cùng, cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.Nếu mẫu chất không tan trong dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt đấu quátrình sắc ký cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trongdung môi phân cực có thể ảnh hưởng vào quá trình giải ly, có thể nạp mẫu “khô”.Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu cần sắc ký (Xg) được hòa tan trongdung môi như etyl acetat hoặc methanol (50Xg), cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn(10Xg). Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khi có bột silica gel khô, bấy giờ,mẫu cần sắc ký đã được tẩm lên bề mặt của những hạt silica gel.Đặt mẫu bột khô này lên trên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn đểquá trình sắc ký cột), thấm ướt phần bột silica gel. Cho một lớp cát dày khoảng 3-6mmđặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. Cuối cùng cho dungmôi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.b. Nạp mẫu ở dạng khô.Nếu mẫu chất không tan trong dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt đấu quátrình sắc ký cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trongdung môi phân cực có thể ảnh hưởng vào quá trình giải ly, có thể nạp mẫu “khô”.Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu cần sắc ký (Xg) được hòa tan trongdung môi như etyl acetat hoặc methanol (50Xg), cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn(10Xg). Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khi có bột silica gel khô, bấy giờ,mẫu cần sắc ký đã được tẩm lên bề mặt của những hạt silica gel.Đặt mẫu bột khô này lên trên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn đểquá trình sắc ký cột), thấm ướt phần bột silica gel. Cho một lớp cát dày khoảng 3-6mmđặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. Cuối cùng cho dungmôi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.2.3.2.2.7. Các kĩ thật ly giải ra khỏi cộtCó thể tiến hành giải ly cột nhờ vào trọng lực, hoặc nhờ vào việc cho một dòngkhí nén nitrogen lên trên đầu cột, hoặc nhờ vào lực hút đặt tại đầu ra của cột, hoặc16Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.dùng máy bơm để bơm dung môi giải ly đi vào đầu cột với những lực mạnh có thểđiều chỉnh.a. Dung môi giải ly và kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung môi giảilyNhững dung môi loại tiêu chuẩn thương phẩm thường có lẫn một ít tạp chất,nhất là các dung môi loại hydrocarbon thường chứa nhiều tạp hơn những dung môikhác. Chỉ cần dung môi có lẫn một ít tạp chất, thí dụ với benzen có lẫn một ítmethanol, độ phân cực của dung môi đã thay đổi đáng kể. Vì thế cần chưng cất dungmôi trước khi sử dụng.Cần nên tránh sử dụng một vài dung môi cho silica gel nhất là cho alumin dạngacid hoặc base hoặc dạng hoạt tính mạnh. Thí dụ: dung môi aceton có thể bị dimer hóabằng phản ứng aldol hóa để tạo thành diaceton alcol. Dung môi etyl acetat hoặc alcolcó thể cho phản ứng trans-ester hóa. Cuối cùng là những dung môi có hoạt tính caonhư: pirydin, methanol, nước, acid acetic có thể hòa tan và giải ly luôn cả chất hấp thusilica gel.Trong sắc ký cột, có khi chỉ cần sử dụng một đơn dung môi là có thể giải ly tấtcả các chất ra khỏi cột, đôi khi cần đến hỗn hợp dung môi. Nhưng thường nhất là trướctiên, dùng dung môi không phân cực để giải ly những hợp chất tương đối không phâncực; tiếp đó, dùng dung môi có tính phân cực mạnh hơn để giải ly những hợp chấtphân cực.Có hai kiểu giải ly: giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ và giải ly với dungmôi có tính phân cực tăng dần. Dung môi có tính phân cực tăng dần theo kiểu bậcthang hoặc theo kiểu tăng dần tuyến tính.b. Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độChỉ sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn hợp dung môi nhưng trong hỗn hợp tỉ lệgiữa các thành phần không thay đổi, để giải ly cho đến khi việc tách chất hoàn tất.c.Giải ly có nồng độ tăng theo kiểu bậc thangĐôi khi, việc sử dụng một loại dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấutử nhất định nào đó và một số cấu tử khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu17Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.cột. nếu muốn đuổi chúng ra khỏi cột, phải dùng một dung môi có lực mạnh hơn.Trong quá trình sắc ký, cần thay nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăngdần (độ phân cực tăng dần) để có thể đuổi hết các cấu tử khác nhau ra khỏi cột.Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăngchậm: thêm từ từ mỗi lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực hơnvào dung môi cũ đang sử dụng.Các kết quả nghiên cứu thực nghiêm đã giải thích vì sao lại cho thêm dungmôi phân cực vào dung môi kém phân cực theo nồng độ không tăng dần đều mà lạităng nhảy vọt, bởi vì người ta nhận thấy các dung dịch với nồng độ 1%, 2%, 3%,5%, 10% có tính phân cực tăng theo lượng dung môi phân cực cho thêm vào; trongkhi đó các dung dịch 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% lại có tính phân cựctăng lên rất ít, gần như tương đương nhau. Do đó, việc giải ly với các dung dịch cónồng độ như thế, làm mất thời gian.Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột. điều này được giảithích do alumin hoặc silica gel khi được trọn với bất kỳ loại dung môi nào cũng tạora nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi bốc hơi một cách cục bộ, hơi sinh ra tạo nênbọt khí làm nứt gãy cột. Cột gãy làm mất đi sự liên tục của chất hấp thu và vì thếkhông tách chất tốt được.d. Giải ly với nồng độ tăng tuyến tính.Để tạo dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần đều, có thể sử dụng nhữngthiết bị có sẵn, hoặc có thể tự chế.e. Vận tốc giải ly cộtVận tốc chảy của dung môi giải ly không được quá nhanh (sẽ không kịp cânbằng với chất hấp thu) cũng không được quá chậm hoặc bị cho ngừng lại một thờigian vì lúc đó các dãy chất tan sẽ khuếch tán hoặc trải dài theo mọi hướng làm xấuqua trính tách.18Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.Thường thường trong đa số sắc ký cột, vận tốc giải ly khoảng 5-50 giọt/ phúthoặc 1-2cm/ phút.f.Theo dõi quá trình giải ly cộtVới các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, quá trính giải ly bằng sắc ký cột cóthể được theo dõi bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc khác nhau,đang tách xa nhau ra. Theo dõi các dãy ,àu và hứng chúng khi được giải ly ra khỏi cột.Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không màu, nên dung dịch giải ly cũng trongsuốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau.Phương pháp thông dụng nhất là hứng dung dịch giải ly trong những lọ (erlen)có đánh số thứ tự. Hứng mỗi lọ một thể tích như nhau, thường là 50ml.Dung dịch trong những lọ hứng được sẽ được sắc ký lớp mỏng trên cùng mộtbản mỏng. Những lọ nào có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau sẽ được gom chunglại với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất kém các phân đoạn này sẽcho cao của phân đoạn đó.Khi nào thay đổi dung môi gải ly cột:Sắc ký cột được khởi đầu bằng loại dung môi nào là do kết quả của sắc ký lớpmỏng trên cao ban đầu. Thí dụ khởi đầu sắc ký cột bằng eter dầu hỏa, cứ tiếp tục giảily cho đến khi lọ cuối cùng, hứng dung dịch giải ly ra, đuổi hết dung môi ra khỏi lọnày, cân lại không thấy có cặn hoặc còn cặn không đáng kể, hoặc đuổi bớt dung môirồi chấm sắc ký bản mỏng mà không còn hiện vết nữa. Điều này có nghĩa là dung môieter dầu hỏa đã lôi hết ra khỏi cột những hợp chất không phân cực trong cao đã nạp ởđầu cột.Chú ý: Bắt buộc duổi bớt dung môi trước khi chấm sắc ký lớp mỏng, vì nếu đểnguyên dung dịch trong lọ, dung dịch quá loãng, nên dù có chấm rất nhiều lần lêncùng một chấm, bản mỏng cũng không hiện vết, nên nghĩ lầm rằng đã kéo hết chất rakhỏi cột, dẫn đến quyết định sai.Tiếp theo, cần tăng thêm độ phân cực cho dung môi giải ly để tiếp tục quá trìnhsắc ký cột. Lần lượt giải ly từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực.19Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.2.3.2.3 Tổng kết quá trình sắc kí cộtVừa giải ly cột, vừa phải theo dõi dung dịch giải ly bằng sắc ký lớp mỏng đểgom thành những phân đoạn. Chỉ ngưng cột khi đã thu được tổng lượng cao các phânđoạn bằng 70-80% trọng lượng mẫu đã nạp vào đầu cột.Chọn phân đoạn nào để tiếp tục khảo sátDù sử dụng kỹ thuật sắc ký loại gì (sắc ký cột cổ điển, sắ ký chớp nhoáng, sắcký nhanh-cột khô..) sắc ký cột lần đầu khó cho ngay một phân đoạn chỉ chứa một chấttinh khiết. thường các phân đoạn chứa hai hoặc nhiều chất khác nhau. Phải tiếp tục sắcký nhiều lần mới có thể thu được một hợp chất tinh khiết. Phải là đơn chất tinh khiếtmới có thể xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp hóa lý hiện đại Ỉ, UV,khối phổ, H-RMN, C-RMN...Nên chọn những phân đoạn có lượng cao nhiều để sắc ký cột lần thứ hai, thứ bahoặc áp dụng phương pháp kết tinh phân đoạn, phương pháp kết tinh lại có sử dụngbột than hoạt tính. Nếu phân đoạn có lượng cao ít, các vết cách xa nhau, có thể sắc kýđiều chế. Các chất thu được, trước khi gởi đi khảo sát cấu trúc hóa học, cần phải đượckết tinh lại.Các phân đoạn có lượng cao quá ít, có sắc ký lớp mỏng cho nhiều vết, đànhphải bỏ qua, rất khó tiếp tục khảo sát, vì nếu có cô lập được chất tinh khiết sẽ khôngđủ lượng mẫu để khảo sát cấu trúc hóa học bằng các phương pháp hóa lý hiện đại.2.3.3 Sắc kí bản mỏng2.3.3.1 Kiến thức tổng quátSắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu váo hiện tượng hấp thutrong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngangqua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, thí dụ như: silica gel hoặc oxid alumin.Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một mặng phẳng nhưtấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớpmỏng nên phương pháp này dược gọi là sắc ký lớp mỏng. Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ... băng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắpđậy.20Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng. Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0.25mm của một loại chất hấp thu, đượctráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấmnhôm hoặc tấm plastic. Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ sulfat calci khan,hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ. Mẫu chất cần phân tích: Mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp gồmnhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1µL dung dịchmẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành mộtđiểm gọn trên pha tĩnh, ở vịt trí phía trên cao hơn một chút so với mặtthoáng chất lỏng đang chứa trong bình. Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọctheo tấm lớp mỏng và lôi keo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển đilên cao nhờ vào tính mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyểnvới một vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc dichuyển này tùy thuộc và các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níugiữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vàođộ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ dichuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm.2.3.3.2 Các chất hấp thụ trong sắc kí lớp mỏngTất cả các chất hấp thu sử dụng cho sắc ký cột đều có thể áp dụng cho sắc kýlớp mỏng, tuy nhiên điểm quan trọng cần lưu ý là kích cỡ của hạt và độ đồng nhấtcủa các hạt hấp thu, vì điều này quyết định độ bám dính của chất hấp thu lên bề mặttấm bản mỏng. Các hạt phải đồng đều và có đường kính trong khoảng 10-25µm.Một số chất hấp thu dùng trong sắc ký lớp mỏng:Silica gelKieselguhrAluminaBột giấyLớp polyamidSephadex21Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.2.3.3.3 Dung môi giải lyCác đơn dung môi được sắp xếp theo tính phân cực tăng dần theo hằng số điệnmôi hoặc momen lưỡng cực hoặc các chỉ tiêu khác.Nguyên tắc chọn dung môi: nên chọn loại dung môi rẻ tiền, vì phải cần mộtlượng lớn, có độ tinh khiết cao, tránh có chứa các vết kim loại. Dung môi không đượcquá dễ bay hơi, thí dụ etyl eter, nhiệt độ sôi # 35 0C, gần bằng nhiệt độ của phòng thínghiệm vào mùa nóng. Dung môi dễ bay hơi sẽ dễ dàng bay đi khỏi tấm lớp mỏng saukhi giải ly.Một mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cấu tử khác nhau. Khả năng táchriêng các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tỉ lệ phân phối của các hợpchất này giữa chất hấp thu và dung môi giải ly. Muốn thay đổi khả năng tách, người tathay đổi thành phần các dung môi sử dụng để giải ly. Thường người ta giải ly với hỗnhợp hai dung môi.Nguyên tắc tổng quát, nếu có thể, nên tránh sử dụng hỗn hợp dung môi cónhiều hơn hai cấu tử, vì hỗn hợp phức tạp như thế dễ dàng dẫn đến việc thay đổi phakhi có sự thay đổi nhiệt độ.Sự lựa chọn dung môi để tách tốt các chất khác nhau vẫn tùy vào kinh nghiệmcá nhân, nhưng những hiểu biết về đặc tính của hợp chất cần phân tích sẽ giúp ích chongười nghiên cứu.2.3.3.4 Các bước chuẩn bị sắc kí lớp mỏng2.3.3.4.1 Chuẩn bị ống vi quảnVi quản là ống thủy tinh có đường kính trong của ống phải nhỏ, khoảng 12mm, một đầu được vót nhọn. Một ống vi quản có thể sử dụng để chấm nhiều loạimẫu dung dịch khác nhau, chỉ cần sau mỗi lần sử dụng, rửa sạch vi quản bằng dungmôi hữu cơ như aceton.Dùng một lọ thủy tinh nhỏ, chứa một ít aceton để dành rửa vi quản. Khiaceton trong lọ hết thì châm mới thêm một ít. Lọ có nắp đậy bằng nhựa. Khi cầnchấm mẫu, rút vi quản ra khỏi lọ aceton, dí nhẹ đầu vi quản lên một tờ giấy thấm đểhút bỏ aceton đang có trong ống, nhúng đầu vi quản vào dung dịch mẫu cần sắc ký22Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.để chấm lên bản sắc ký. Tiếp theo, muốn dùng vi quản đó để chấm vào dung dịchmẫu thứ hai thì rửa ống vi quản vài lần với aceton..2.3.3.4.2 Chấm mẫu lên bản mỏng.Chuẩn bị tấm bản mỏng: với các bản dùng để hteo dõi sắc ký cột có thể tiếtkiệm với bản có chiều dài 5cm. Với bản dùng để đo Rf, để sau này công bố kết quả,nên có chiều dài 10cm. Dùng bút chì để vạch nhẹ các nét mức xuất phát và mức tiềntuyến dung môi.Chuẩn bị dung dịch mẫu: với mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếp mẫu lênbản mỏng; trường hợp đây là dung dịch quá sệt, có thể pha loãng mẫu. Với mẫu là chấtrắn, phải hòa tan hoàn toàn mẫu trong dung môi hữu cơ phù hợp, với nồng độ 2-5%;dung môi hòa tan mẫu không nhất thiết phải là dung môi giải ly.Nhờ một vi quản, đặt dung dịch mẫu lên bề mặt của tấm sắc ký lớp mỏng mộtcách thận trọng, tránh không làm lũng bề mặt của lớp mỏng. Thao tác: cầm vi quảnnhúng vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ tự hút dung dịch lên vi quản, rồi đặt đầu viquản chạm nhẹ lên bề mặt của tấm lớp mỏng, dung dịch trong ống sẽ chảy ra và thấmlên tấm lớp mỏng. Phải nhanh chóng nhấc vi quản rời khỏi tấm lớp mỏng, để vết chấmchỉ lan rộng ra thành vết tròn có đường kính từ 2-5mm.Sắc ký lớp mỏng là phương pháp định tính vì thế mỗi vết chấm trên bản mỏngkhông nên chứa nhiều hơn 12µg (10µg là tối ưu) mẫu chất. Với một mẫu có thể chấmnhiều lần, nhưng giữ cho vết chấm đừng lan rộng ra trên bản; muốn thế, sau mỗi lầnchấm, dùng miệng thổi hơi nhẹ hoặc dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vếtchấm, rồi mới chấm tiếp theo vài lần nữa cho đến khi đủ lượng cần cho một vết chấm.Sau khi chấm hoàn tất, dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm,rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly.Nếu cần khảo sát một lượt nhiều mẫu khác nhau, chuẩn bị các dung dịch mẫunày, mỗi dung dịch mẫu chấm một chấm lên cùng một bản mỏng, vết này cách vết kia1cm. Hai vết ở ngoài bìa phải cách bờ cạnh 1.5cm (đối với bản có kích thước20x20cm.Với sắc ký lớp mỏng điều chế, dung dịch chất mẫu sẽ được chấm lên bản mỏngthành một đường dài, đều, dọc theo mức xuất phát.23Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.Khi dung môi lên đến đầu trên của bản, không nên để bản ở lâu trong bình; nênlấy bản ra khỏi bình giải ly, vì sự khuếch tán và sự bay hơi dung môi có thể làm cácvết vừa tách được sẽ bị trải dài ra.Ngoài ra, còn có thiết bị tự động để chấm mẫu lên lớp mỏng. Các loại thiết bịnày giúp chấm dung dịch mẫu lên lớp mỏng với lượng thể tích xác định chính xác2.3.3.4.3 Giải ly bản mỏng.a. Chuẩn bị bình giải ly bản mỏngChuẩn bị bình có khích thước lớn hơn so với kích thước của bản mỏng. Kíchthước của bình và lượng thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu.Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể vì như thế bầu khí quyển sẽ nhỏ nhất.Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình. Với sắc ký lớp mỏng địnhtính, chỉ cần một thể tích khoảng 10ml dung môi. Quan sát chiều dày của lớp dungmôi trong bình giải ly: không được cao quá 1cm, bởi vì các vết chấm mẫu trên bảnmỏng cách bìa là 1cm.Nếu sắc ký lớp mỏng với các tấm bản lớn, sử dụng bình lớn, phải tính toán thểtích dung môi cần dùng để chiều dày của lớp dung môi trong bình không cao hơnkhoảng cách của vết chấm trên bản mỏng.Trước khi cho tấm bản mỏng vào bình, bình cần được bão hòa dung môi để cóđược một bầu khí quyển đồng nhất, thực hiện bằng cách phủ bề mặt trong của bìnhbằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc.Đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, cạnh đáy của bản ngập vào dung dịchgiải ly khoảng 0.5-1.0cm. Hệ dung môi dung ly phù hợp là sau khi giải ly, hệ sẽ chocác vết chính có Rf khoảng từ 0.3 đến 0.6.b. Các kĩ thuẫt giải ly bản mỏngGiải ly để dung môi giải ly di chuyển từ trên xuốngTrong kỹ thuật này, sau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm lớpmỏng vào bình khai triển, để cho các vết chấm mẫu ở phía trên cao, gần với nắp đậybình. Ở phía trên cao của bình triển khai, có một máng nhỏ chứa dung môi giải ly.Người ta cho một tờ giấy lọc (có chiều ngang bằng với chiều ngang của tấm lớp mỏng)24Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng.vắt ngang từ máng qua tấm lớp mỏng, để dung môi từ máng di chuyển đến cạnh đầutrên của tấm lớp mỏng, rồi đi xuống dưới thấp.Giải ly để dung môi giải ly di chuyển tử dưới lênSau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm lớp mỏng vào bình khaitriển, để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dưới gần đáy bình. Cạnh đáy của tấmlớp mỏng ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0.5-1.0cm. Lưu ý: các vết mẫu khôngđược ngập vào dung môi giải ly, vì như thế mẫu sẽ khuếch tán ngay lập tức vào dungmôi. Các vết này phải cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0.5cm; nghĩa là các vếtmẫu phải được chấm cách bờ cạnh khoảng 1.0cm.Giải ly nhiều lần liên tiếpKỹ thuất được áp dụng để tách mẫu có chứa các hợp chất có Rf gần sát vớinhau, thực hiện bằng cách giải ly nhiều lần liên tiếp với cùng một loại dung môi đãchọn. Mỗi lần giải ly xong, lấy bản ra, sấy khô và cho vào trở lại để giải ly lần nữa.Giải ly hai chiềuKỹ thuật triển khai hai chiều rất phù hợp với mẫu là hỗn hợp nhiều nhóm hợpchất có tính chất khác nhau (và trong mỗi nhóm lại có chứa nhiều hợp chất có tính chấtgần giống nhau).Trên tấm sắc ký bản mỏng hình vuông, chấm dung dịch mẫu cần phân tích lêngóc ở bên phải, cách hai bìa một khoảng 2-3cm, giải ly với hệ dung môi X. Lấy bảnra,sấy khô và xoay bản 900, đặt trở lại vào bình sắc ký để được giải ly, nhưng với hệdung môi khác, là Y.2.3.3.5 Công dụng của sắc kí lớp mỏngSắc ký lớp mỏng là công ụ cần thiết cho các nghiên cứu viên trong phòng thínghiệm, trong một số công việc như sau:2.3.3.5.1 Đề công bố đặt điểm của hợp chất vừa chiết tách cô lậpĐể công bố đặt điểm của một hợp chất, bên cạnh các số liệu phổ RMN, cácđặc tính vật lý,... cũng cần cho biết giá trị Rf của hợp chất đó.25

Tài liệu liên quan

• Tìm hiểu quy trình kĩ thuật nuôi trồng nguyên liệu chiết xuất agar và đề xuất các biện pháp khai thác và bảo vệ nguồn lợi rong biển kinh tế
  • 39
  • 820
  • 0
• Luận văn công nghệ sinh học Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh
  • 73
  • 791
  • 2
• LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU QUY TRÌNH ĐỊNH HCV BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR
  • 43
  • 796
  • 1
• tìm hiểu quy trình định lượng lượng hcv bằng kỹ thuật real-time pcr
  • 51
  • 1
  • 4
• Quy trình định tính Salmonella trong công nghệ thực phẩm
  • 30
  • 2
  • 3
• Tìm hiểu quy trình định tính alkaloid trong cây thuốc thượng
  • 45
  • 5
  • 3
• ĐỊNH TÍNH – ĐỊNH LƯỢNG – CHIẾT TÁCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA HỢP CHẤT ALKALOID TRONG CÂY THUỐC THƯỢNG (Phaeanthus vietnamensis Ban)
  • 61
  • 575
  • 5
• XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PHYLLANTHIN TRONG cây DIỆP hạ CHÂU ĐẮNG
  • 57
  • 523
  • 3
• Tìm hiểu quá trình sản xuất, kinh doanh cây thuốc lá tại địa bàn xã dân chủ, huyện hòa an, tỉnh cao bằng
  • 67
  • 86
  • 0
• Tìm hiểu quá trình sản xuất, kinh doanh cây thuốc lá tại địa bàn xã Dân Chủ, huyện Hòa An, tỉnh Cao Bằng (Khóa luận tốt nghiệp)
  • 67
  • 89
  • 0

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(3.14 MB - 45 trang) - Tìm hiểu quy trình định tính alkaloid trong cây thuốc thượng Tải bản đầy đủ ngay ×