Ứng Dụng Của Phương Pháp PCR Và Real-time PCR Trong Y Học Và ...

Tóm tắt nội dung

Toggle

• 1. Xét nghiệm PCR là gì
  • Nguyên lý hoạt động của PCR
  • Real time PCR – Một cải tiến lớn của PCR
• 2. Ứng dụng của phương pháp PCR và real-time PCR
  • a. Xét nghiệm Real-time PCR trong chẩn đoán SARS-CoV-2
  • b. Ứng dụng của real-time PCR trong các chẩn đoán y học:
  • c. Ứng dụng trong kiểm nghiệm an toàn thực phẩm, xác định sinh vật GMO, phát hiện vi sinh tạp nhiễm gây bệnh:
  • d. Ứng dụng kỹ thuật real-time PCR trong chẩn đoán bệnh thú y, thủy sản và cây trồng
• 3. Giải pháp real-time PCR tại Việt Nam

1. Xét nghiệm PCR là gì

Xét nghiệm PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Phương pháp PCR được nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1985.

Xét nghiệm PCR đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học, đặc biệt là sinh học phân tử do phản ứng rất nhạy và cho kết quả đặc hiệu. Thông qua PCR, một đoạn ADN với lượng rất nhỏ (chỉ vài nanogram) có thể được khuếch đại theo cấp số nhận để tạo ra hàng triệu bản sao của đoạn trình tự ADN đó do đó xét nghiệm PCR thường có kết quả độ chính xác rất cao.

Nguyên lý hoạt động của PCR

PCR dựa trên việc sử dụng khả năng của enzyme DNA polymerase để tổng hợp chuỗi ADN mới từ chuỗi ADN ban đầu được cung cấp.Bởi vì DNA polymerase chỉ có thể thêm một nucleotide vào nhóm 3′-OH có từ trước, nên enzyme này cần một đoạn ADN mồi để có thể thêm nucleotide đầu tiên.

Yêu cầu này cho phép phân định một vùng cụ thể của chuỗi mẫu mà nhà nghiên cứu muốn khuếch đại. Khi kết thúc phản ứng PCR, trình tự cụ thể sẽ được tích lũy thành hàng tỷ bản sao của đoạn trình tự ADN ban đầu.

Thành phần của một phản ứng PCR thường bao gồm:

1. Dung dịch ADN mẫu (DNA template) chứa đoạn ADN cụ thể đã được tinh sạch để nhân bản.
2. Primers: là các đoạn ADN mồi, thường có độ dài vài chục Kb, có nhiệm vụ định vị điểm bắt đầu và điểm kết thục của đoạn ADN mẫu.
3. DNA polymerase: là enzyme có nhiệm vụ tổng hợp các đoạn ADN mới là bản sao của trình tự ADN ban đầu. Enzyme này có khả năng chịu nhiệt cao và thường sử dụng trong PCR là Taq polymerase.
4. Nucleotides (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs): bao gồm 4 loại (A, T, G, C) –> là các thành phần cơ bản, được xem như những “viên gạch” cấu tạo nên cấu trúc của ADN –> DNA polymerase sử dụng các dNTPs để tổng hợp nên các trình tự ADN bản sao.
5. Dung dịch đệm (buffer solution): cung cấp môi trường hoạt động cho enzyme DNA polymerase
6. Ống PCR (PCR tube): là dụng cụ plastic chuyên dụng dùng để phối trộn dung dịch phản ứng PCR trước khi cho vào thiết bị thực hiện PCR (Thermal cycler)

Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

– Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94 oC, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn.

– Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 – 65 oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu.

– Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3′ của mồi và tạo ra mạch bổ sung.

Real time PCR – Một cải tiến lớn của PCR

Kỹ thuật Realtime là kỹ thuật mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị sau mỗi chu trình nhiệt của phản ứng PCR. Kết quả khuếch đại được quan sát thông qua các tín hiệu huỳnh quang được giải phóng trong quá trình phản ứng PCR xảy ra. Các tín hiệu này được phát hiện và ghi lại dưới dạng biểu đồ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về số lượng sản phẩm khuếch đại DNA đích có mặt ở mỗi chu kỳ.

Real-time PCR SYBR Green Real-time PCR Taqman Probe

Thành phần của phản ứng real time PCR về cơ bản giống với PCR cổ điển nhưng có thêm chất huỳnh quang, hai loại chất huỳnh quang thông dụng nhất là SYBR Green và Taqman probe

2. Ứng dụng của phương pháp PCR và real-time PCR

PCR hiện là một kỹ thuật cơ bản quan trọng và thường không thể thiếu được trong quy trình nghiên cứu của các phòng thí nghiệm về sinh học phân tử, y sinh, khoa học hình sự, pháp y, xét nghiệm ADN, nông nghiệp, thực phẩm và môi trường. Đặc biệt trong bối cảnh dịch Covid-19 diễn biến phức tạp như hiện nay, kỹ thuật real time PCR được xem như chuẩn vàng trong các xét nghiệm chấn đoán sự có mặt của virut

a. Xét nghiệm Real-time PCR trong chẩn đoán SARS-CoV-2

Phương pháp real-time PCR xác định hiện diện của virut SARS-CoV-2 thông qua phát hiện vật liệu di truyền của chúng. Xét nghiệm real-time RT-PCR có thể phát hiện các trường hợp nhiễm virut SARS-CoV-2 tại giai đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh (1-2 ngày trước khi có triệu chứng đầu tiên) và giai đoạn tiền phát bệnh khi tải lượng virut còn thấp. Xét nghiệm PCR hiện là xét nghiệm chính xác nhất để chẩn đoán nhiễm virus COVID-19 và có ít nguy cơ cho kết quả âm tính giả. Hiện nay CÔNG TY TNHH QUỐC TẾ PTC VIỆT NAM đang cung cấp bộ kit PCL COVID19 Speedy RT-PCR của Hàn Quốc với thời gian xét nghiệm khoảng 1 giờ.

Trong các xét nghiệm real-time PCR nói chung và xét nghiệm SARS-CoV-2 nói riêng, ta sẽ thấy một chỉ số PCR hết sức quan trọng luôn đi kèm với nó là giá trị chu kỳ ngưỡng ( giá trị Ct, threshold cycle). Ct là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời điểm đó thiết bị real-time PCR bắt đầu ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ phản ứng PCR vượt qua cường độ huỳnh quang nền, hay nói một cách dễ hiểu là số chu kỳ máy phải chạy để phát hiện được tín hiệu huỳnh quang từ mẫu bệnh phẩm. Do đó giá trị Ct tỷ lệ nghịch với nồng độ virus bởi mẫu càng nhiều virus Sars-CoV-2 thì tín hiệu huỳnh quang sẽ xuất hiện sớm ở những chu kỳ sớm (Ct nhỏ), và ngược lại mẫu càng ít virus Sars-CoV-2 thì tín hiệu huỳnh quang sẽ xuất hiện muộn ở những chu kỳ lớn (Ct lớn). Theo Quyết định số 4689/QĐ-BYT về việc ban hành Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị Covid-19 ban hành ngày 6 tháng 10 năm 2021, Bộ Y Tế đặt tiêu chuẩn xuất viện của bệnh nhân COVID-19 là xét nghiệm PCR cho kết quả âm tính với Ct > 30. Ở ngưỡng này thì nồng độ virus thấp, thường dưới 1000 copies nên nguy cơ lây nhiễm không đáng kể. Chính vì thế bệnh nhân vẫn có thể được xuất viện và tiếp tục theo dõi tại nhà. Theo một số nghiên cứu mới nhất thì Ct trên 33 thì khả năng lây lan của virus SARS-CoV-2 gần như là không có.

b. Ứng dụng của real-time PCR trong các chẩn đoán y học:

Phương pháp real-time PCR thường được dùng để chẩn đoán một số bệnh đặc hiệu, liên quan đến các loại virus mà các phương pháp xét nghiệm truyền thống không thể làm được. Cụ thể xét nghiệm sinh học phân tử giúp chẩn đoán chính xác các bệnh như:

• Phát hiện các tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1…), các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).
• Phát hiện các vi khuẩn lậu (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).
• Phát hiện các tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước đó (vd: Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất đầu…).
• Phát hiện virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết.
• Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRCA1 – BRCA2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin…)
• Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)…
• Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc như S.aureus – MRSA, các vi khuẩn sinh ESBL hoặc betalactamase, carbapenemase…)
• Xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli.
• Trong công nghệ sinh học, xét nghiệm sinh học phân tử được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN…

c. Ứng dụng trong kiểm nghiệm an toàn thực phẩm, xác định sinh vật GMO, phát hiện vi sinh tạp nhiễm gây bệnh:

• Xác định, định danh thịt, kiểm nghiệm nguồn nguyên liệu đầu vào
• Phát hiện vi sinh nhật tạp nhiễm gây bệnh Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Campylobacter, Yersinia, enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Vibrio cholerae, V.parahaemolyticus, V. vulnificus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens và Clostridium botulinum. CÔNG TY TNHH QUỐC TẾ PTC VIỆT NAM cung cấp Bộ kít PCR phát hiện Clotridium Botulium trong thực phẩm,
• định lượng chính xác hàm lượng vật liệu biến đổi gen cũng như cho kết quả phát hiện sinh vật biến đổi gen chính xác nhất, nhanh nhất trong mẫu thực phẩm phân tích. Bộ kít được dử dụng phổ biến là Kit PCR phát hiện sinh vật biến đổi gen – GMOs trong thưc phẩm,…

d. Ứng dụng kỹ thuật real-time PCR trong chẩn đoán bệnh thú y, thủy sản và cây trồng

Real-time PCR được sử dụng để phát hiện nhanh chóng các mầm bệnh trên vật nuôi, cây trồng và thủy sản như (như virus gây hội chứng đốm trắng WSSV ở tôm, bệnh heo tai xanh PRRS, PCV2, PED,…). Với ưu thế về thời gian, độ nhạy và độ chính xác cao, phương pháp Real-time PCR được sử dụng phổ biến tại các cơ quan thú y của nhà nước, các doanh nghiệp và trang trại chăn nuôi để chẩn đoán, phát hiện sớm bệnh và phục vụ nhu cầu kiểm soát dịch bệnh.

3. Giải pháp real-time PCR tại Việt Nam

Kỹ thuật Real-time PCR có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực. Trên thị trường hiện nay, có thể tìm thấy nhiều loại máy Real-time PCR với công suất khác nhau phù hợp với từng nhu cầu sử dụng. Hiện nay, CÔNG TY TNHH QUỐC TẾ PTC VIỆT NAM đang cung cấp hệ thống máy AriaMx Real-Time PCR System 6 kênh màu- Agilent – Hoa Kỳ, Hệ thống Realtime PCR-RealLine Cycler… đi kèm với đó là các bộ sinh phẩm real-time PCR như bộ kit xét nghiệm Covid 19 PCL COVID19 Speedy RT-PCR , Bộ kít PCR phát hiện Clotridium Botulium trong thực phẩm Clostridium botulinum Detection LyoKit , Bộ kít PCR phát hiện sinh vật biến đổi gen – GMOs trong thưc phẩm GMO Maize Identification 1 LyoKit phù hợp với nhu cầu sử dụng trong lĩnh vực y học, sinh học, thực phẩm và môi trường có liên quan đến Sinh học phân tử và vi sinh.

Hệ thống Real time PCR AriaMx System 6 kênh màu