Xác định Dư Lượng Penicillin G Và V Trong Thực Phẩm Bằng Phương ...

Có thể bạn quan tâm

Tải bản đầy đủ (.pdf) (40 trang)

Trang chủ

Luận Văn - Báo Cáo

Báo cáo khoa học

Xác định dư lượng penicillin G và V trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (646.24 KB, 40 trang )

Bộ y tế viện dinh dỡng ZY báo cáo tổng kết đề tài xác định d lợng penicillin g và v trong thực phẩm bằng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Chủ nhiệm đề tài: ThS. Trần quang thủy 7106 16/02/2009 Hà Nội - 2008 1 MỞ ĐẦU An toàn vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong công tác bảo vệ sức khoẻ con người. Trong tiến trình gia nhập WTO, thị trường hàng hoá của Việt nam được mở rộng, đặc biệt trong lĩnh vực xuất khẩu các mặt hàng nông sản, thuỷ sản. Tuy nhiên, do việc kiểm soát dư lượng hoá chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu dùng chưa được thực hiện nghiêm túc nên một số lô hàng bị thị trường nhập khẩu phát hiện kháng sinh có hại vẫn còn cao. Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế cho các doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng nghiệm trọng đến uy tín chất lượng hàng Việt nam trên thị trường thế giới. Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến bộ của công nghệ sinh học. Thế nhưng, việc tuỳ tiện sử dụng thuốc kháng sinh dễ dẫn đến hậu quả: Lượng thuốc kháng sinh tồn dư trong sản phẩm vượt ngưỡng cho phép, người sử dụng loại thực phẩm này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ. Penicillin là kháng sinh thế hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn. Ban đầu, nó được hoan nghênh như một thứ thuốc thần kì và đã cứu sống vô số người trong chiến tranh thế giới thứ hai. Mặc dù Penicillin đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại nhiều bệnh tật cho con người và các loài động vật, nhưng việc lạm dụng nó trong chăn nuôi có thể dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc, giảm khả năng kinh tế của vật nuôi, gây thiệt hại cho người chăn nuôi. Hơn thế nữa tồn dư Penicillin trong sản phẩm chăn nuôi có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như: ngộ độc, biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dung hoặc làm cho người tiêu dung cũng bị kháng thuốc… Việc phát triển các kĩ thuật xác định lượng tồn dư Penicillin trong thực phẩm phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm trong nước sẽ trở thành công cụ hữu hiệu giúp các cơ quan chức năng kiểm soát tốt hơn vấn đề đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm. Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu phương pháp xác định dư lượng Penicillin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao. 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về kháng sinh nhóm Penicillin 1.1.1 Đại cương Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện một nấm mốc thuộc giống Penicillium ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Fleming gọi chất kháng khuẩn chưa được biết tới này là Penicillin. 10 năm sau, một nhóm các nhà khoa học thuộc trường Đại học Oxford bắt đầu nghiên cứu chất này trên chuột thí nghiệm. Penicillin được hoan nghênh như một thứ thuốc thần kỳ và đã cứu sống vô số người trong chiến tranh thế giới thứ II [5] Penicillin là kháng sinh thể hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn. Penicillin được chiết ra từ dịch nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum. Penicillin lần đầu tiên phát hiện có tác dụng chống vi khuẩn gram dưng Staphylococcus, Diplococcus nhưng hầu như không có tác dụng chống vi khuẩn gram âm và nấm men. Vài thập niên trở lại đây đã phát hiện ra nhiều loại pencillin mới trong đó một số có hiệu quả chống lại vi khuẩn gram âm và nấm men như Saccharomyces cerevisae đơn bội và E.coli [5] 1.1.2 Phân loại Pencillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo gần giống nhau, bao gồm một vòng tiasolidin, một vòng β-lactam, một nhóm amino có gắn với CO2 và một mạch bên (R). Hai loại Penicillin được tổng hợp đầu tiên là benzylpenicillin(PenicillinG; R = C6H5CH2-) và Phenoxymethylpenicillin (PenicillinV; R = C6H5OCH2-). Và một số loại bán tổng hợp: Amoxycillin, Ampicillin, Oxacillin, Cloxacillin [5] Hình 1: Cấu trúc chung của các penicillin Sự khác biệt rõ ràng giữa các penicillin bao gồm khác biệt trong phổ hoạt động của chúng. Penicillin trong các muối và các dạng liều khác nhau, ampicillin, và amoxicillin có hoạt tính chống lại các vi khuẩn hiếu khí gram dương và một số vi khuẩn kỵ khí. Các chất này dễ bị beta-lactamase phá huỷ và do đó không có hiệu quả chống tụ cầu và các vi khuẩn kỵ khí sản sinh beta-lactamase. Ampicillin và amoxicillin có hoạt tính chống lại một số vi khuẩn hiếu khí gram âm. Amoxicillin đã thay thế penicillin V làm loại penicillin lý tưởng để phòng viêm nội tâm mạc do sinh khả dụng ưu việt của nó. M¹ch bªnVßng thiazolindineVßng β-lactam 3 1.1.3 Tác dụng của Penicillin Giống như các họ kháng sinh khác, penicillin có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh. Cơ chế tác dụng chung như sau: Peptidoglycan là thành phần cơ bản tạo nên tính vững chắc của vách tế bào vi khuẩn. Quy trình tổng hợp peptidoglycan được thực hiện nhờ enzym D-alanin transpeptidase. Do là axit, các penicillin có khả năng acyl hoá các D-alanin transpeptidase, làm cho các enzym này không thể tham gia vào quá trình tổng hợp peptidoglycan. Sinh tổng hợp vách tế bào bị gián đoạn, vi khuẩn không thể tồn tại. Mặt khác, các penicillin còn hoạt hoá enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân huỷ vách tế bào vi khuẩn, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt. 1.1.4 Tác hại của penicillin khi tồn dư trong thực phẩm Phần lớn các kháng sinh an toàn khi sử dụng đúng. Tuy nhiên dù ít hay nhiều chúng đều có thể gây ra các tác dụng không mong muốn và tai biến. Penicillin là kháng sinh ít độc, ít tác dụng không mong muốn, ngoại trừ phản ứng dị ứng. Các sản phẩm phân huỷ kết hợp với protein tạo thành các kháng nguyên là nguyên nhân của dị ứng và tuỳ theo cơ địa từng người phản ứng ở mức độ nào. ¾ Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm như sau: Một là, có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh và có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn nuôi + Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc. + Kháng sinh cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh + Kháng sinh cho vào nước uống để chữa bệnh gia súc. + Kháng sinh cho thêm vào thức ăn cho gia súc để bảo quản súc sản lâu hư. + Kháng sinh tiêm vào súc vật hoặc cho súc vật uống trước khi giết thịt với mục đích kéo dài thời gian, tránh hư hỏng thịt tươi. Hai là, có thể cho thẳng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật để bảo quản thực phẩm. Do vận chuyển sản phẩm đi xa, cho kháng sinh vào thực phẩm để bảo quản. Tất cả những nguyên nhân trên làm cho sản phẩm chăn nuôi, thủy sản tồn dư kháng sinh, có ảnh hưởng không tốt đối với người tiêu thụ. 1.2 Giới thiệu về Penicillin G và Penicillin V 1.2.1 Thông tin chung 4 Bảng1: Thông tin chung về penicillin G và V Penicillin (KLPT) Danh pháp (IUPAC) Cấu trúc hóa học pKa T1/2 Penicillin G (334,4) (2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid 2,76 Penicillin V (350,39) (2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[[2-(phenoxy)acetyl]amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid 2,73 30 - 40 phút 1.2.2 Tính chất và tác dụng Penicillin G và Penicillin V là hai penicillin tự nhiên thu được từ môi trường nuôi cấy nấm penicillium chrysogenum. Chúng được chỉ định trong bệnh nhiễm khuẩn thông thường: nhiễm khuẩn đường hô hấp, tai mũi họng, nhiễm khuẩn huyết… Penicillin G và V có độc tính thấp, nhưng cũng giống như các penicillin khác dễ gây dị ứng thuốc: mẩn ngứa, mày đay, ngoại ban, hội chứng Stevens- johnson và Lyell, nguy hiểm nhất là shock phản vệ. Ngoài ra có thể gây viêm tĩnh mạch huyết khối, thiếu máu tan máu, giảm bạch cầu. 1.2.3 Tình hình sử dụng Penicillin Mặc dù thuốc kháng sinh đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại nhiều bệnh tật cho con người và các loài gia súc, gia cầm cũng như các loài thủy sinh, nhưng việc sử dụng bừa bãi trong chăn nuôi có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như gây độc, biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dùng hoặc làm cho người tiêu dùng cũng bị kháng thuốc. Theo số liệu của viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi ở Mỹ năm 1999 là khoảng 20,42 triệu Pao (9270 tấn), trong đó kháng sinh 5 nhóm Lonophore và Arsen chiếm nhiều nhất (47,5%) Tetracycline (15,67%), Penicillin (4,26%), và các loại khác (32,57%). Theo một báo cáo của Uỷ ban sử dụng dược phẩm trong thức ăn chăn nuôi trực thuộc Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia( NRC) (Mỹ), thiệt hại do lệnh cấm sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi có thể lên tới 2,5 tỷ USD mỗi năm. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã cảnh báo những hiểm hoạ mà loài người có thể phải đối mặt do sự kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh gây ra và WHO đang thúc đẩy một chương trình khuyến cáo tất cả các nước tiến tới cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh như chất kích thích sinh trưởng. Tại Việt Nam, theo kết quả điều tra sơ bộ của Viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam cho thấy: có tới 75% số mẫu thịt và 66,7% số mẫu gan của gia súc, gia cầm bán ở các chợ có mức tồn dư kháng sinh vượt ngưỡng cho phép. 1.2.4 Giới hạn cho phép Trước tình hình các chất kháng sinh được sử dụng tràn lan dẫn đến tồn dư trong thực phẩm có nguy cơ gây hại cao cho sức khỏe người tiêu dùng, nhiều nước trên thế giới đã đưa ra giới hạn cho phép của dư lượng penicillin trong các loại thực phẩm như sau: Bảng 2: Giới hạn cho phép tồn dư penicillin G và V trong thực phẩm Quốc gia EU Việt nam [6] (46/2007/QĐ-BYT) TCN thuỷ sản Sũa Gan, bầu dục Thịt Thịt Gan Thận Sũa Penicillin G (ppb) 4 50 50 50 50 50 4 50 Thịt Penicillin V (ppb) 25 1.3 Các phương pháp xác định Penicillin 1.3.1 Trong nước Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5147-90 [9] đã qui định phương pháp gián tiếp sử dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS xác định Penicillin tổng số trong thịt và sản phẩm thịt, dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. Phương pháp này dựa vào phản ứng tạo phức đặc trưng và hoàn toàn định lượng của cadimi với thuốc thử phenaltrolin-cadimi sinh ra phức bền. Chiết phức này bằng nitrobenzen và đo phổ hấp thụ 6 nguyên tử AAS của kim loại cadimi trong phức ở pha hữu cơ, hay phân hủy pha hữu cơ lấy cadimi vào dung dịch HCl 1% và đo phổ của cadimi. Phương pháp này phức tạp, không đặc trưng và chỉ xác định được lượng tổng Penicillin. Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 197-2004 [8] qui định phương pháp định lượng Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản được tách ra khỏi nền mẫu bằng dung dịch đệm phosphat, pH 9, làm sạch và cô đặc dịch chiết trên cột Bond Elut C18, dẫn xuất hoá và định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA. Qui trình này trải qua quá trình dẫn xuất phức tạp và mới chỉ dừng lại ở phạm vi thuỷ sản. 1.3.2 Thế giới a) Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS Tác giả Titus A.M.Msagati [13] và cộng sự đã xác định dư lượng các β-lactam trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng - khối phổ. Các tác giả đã chiết và làm sạch mẫu sử dụng hỗn hợp đệm phosphat, tetraethylammonium clorua Et4NCl và acetonitril. Sau đó, các β-lactam sẽ được tách và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ chế độ ion dương (LC-PI-ESI-MS). Giới hạn phát hiện của phương pháp này đối với Penicillin G và penicillin V trong gan và bầu dục là 1 ng/kg ; trong sữa là 0,7 µg/L. b) Phương pháp sắc ký lỏng cặp ion với detector UV Tác giả Yuko Ito [14] và cộng sự thuộc Viện sức khỏe cộng đồng (Nhật Bản) đã ứng dụng kĩ thuật làm sạch qua cột trao đổi ion để xác định 6 penicillin: Penicillin G, Penicillin V, Oxacillin, Cloxacillin, Nafcillin, và dicloxacillin trong thịt. Các penicillin được chiết ra khỏi nền mẫu thịt lợn với nước, nền mẫu thịt bò với NaCl 2%, làm sạch qua cột chiết pha rắn trao đổi ion và xác định bằng sắc ký lỏng cặp ion với detectơ tử ngoại. Hiệu suất thu hồi của phương pháp từ 73 - 95%. Giới hạn phát hiện của phương pháp cho các penicillin là 0,02 mg/kg. c) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Tác giả E.Benito-Pena [11] và cộng sự thuộc trường đại học Madrid (Tây Ban Nha) đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại – diot aray (UV-DAD) để xác định đồng thời các kháng sinh nhóm beta-lactam (Penicillin G, amoxicillin, ampicillin, Penicillin V, axacillin, dicloxacillin, và nafcillin) trong nước thải. Hai kĩ thuật SPE được so sánh cho quá trình làm sạch và làm giàu mẫu: cột silica pha đảo C18 và cột trao đổi anion hỗn hợp MAX. Các penicillin được định lượng bằng sắc ký lỏng sử dụng cột tách C18, chương trình rửa giải gradient và phát hiện với detectơ tử ngoại tại bước sóng 220nm. Cột MAX cho hiệu suất thu hồi cao hơn, nằm trong khoảng 82 – 97% và giới hạn phát hiện từ 8 – 24 ng/L 7 Tác giả Lambert K. Sorensen [12] và cộng sự ( Đan Mạch ) đưa ra quy trình xác định đồng thời 7 penicillin trong thịt, gan, bầu dục gia súc và lợn bằng phương pháp HPLC. Các penicllin được tách ra khỏi mẫu bằng H2O, loại các tạp chất hữu cơ với hỗn hợp acid sulphuric và natri tungstat. Dịch chiết được làm sạch qua cột chiết pha rắn Oasis HLB, được dẫn xuất hoá với anhydric benzoic, 1, 2, 4 - triazole và HgCl2. Các penicillin được tách và định lượng trên cột C18, chương trình rửa giải gradient và phát hiện bằng detectơ tử ngoại tại bước sóng 323nm. Giới hạn phát hiện LOD của phương pháp là từ 8,9-11,1 µg/kg đối với amoxicillin, penicillin G, ampicillin, oxacillin, nafcillin và 18,3-20,9 µg/kg cho đicloxacillin. 8 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến bộ của công nghệ sinh học, nhằm làm vật nuôi mau lớn. Thế nhưng, việc tuỳ tiện sử dụng thuốc kháng sinh dễ dẫn đến hậu quả: Lượng thuốc kháng sinh tồn dư trong sản phẩm vượt ngưỡng cho phép, người sử dụng loại thực phẩm này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ. Mục tiêu của đề tài là: Xây dựng được phương pháp xác định penicillin G và V với độ nhạy và độ chính xác cao. Phân tích một số mẫu thực tế để thẩm định lại qui trình. 2.2 Phương pháp nghiên cứu Việc phát triển các kỹ thuật xác định dư lượng penicillin G và V trong thực phẩm là rất cần thiết giúp cho các cơ quan chức năng kiểm soát tốt hơn việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi. Để phù hợp với điều kiện của hầu hết các phòng thí nghiệm trong nước, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại để phát hiện và định lượng penicillin G và V. Cơ sở lí thuyết của phương pháp được tóm tắt dưới đây: 2.2.1 Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn)[4].Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Hình 2: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 9 Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính: - Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích. - Phần tách: là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ. - Phần phát hiện và xử lí số liệu: phần này bao gồm các detector, phần khuếch đại, computer và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu. • Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp ion, sắc ký điện di mao quản; sắc ký phân bố lỏng-lỏng; sắc ký rây phân tử Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là sắc ký lỏng pha liên kết. 2.2.2 Phân tích định tính và dịnh lượng trong HPLC Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ pha đã chọn là thời gian lưu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian lưu khác nhau và cố định. Chính đại lượng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu. Vì vậy, sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ. Sau đó so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào. Trong HPLC có thể dùng một trong 2 phương pháp là phương pháp đường chuẩn hoặc phương pháp thêm tiêu chuẩn để định lượng. Việc dùng phương pháp nào trong hai phương pháp đó tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích Hi = k1.Ci Si = k2. Ci Hi, Si là chiều cao pic và diện tích pic tương ứng của chất i Ci là nồng độ chất i K1, k2 là các hằng số thực nghiệm Phương pháp đường chuẩn có ưu điểm là có thể phân tích hàng loạt mẫu của cùng một đối tượng, nhanh, đơn giản, dễ làm. Tuy nhiên khi thành phần mẫu phân tích phức tạp, việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với mẫu phân tích về thành phần nền, thành 10 phần hoá học và vật lý dễ mắc sai số lớn. Trong trường hợp này để loại trừ ảnh hưởng của nền, người ta dùng phương pháp thêm tiêu chuẩn. 2.3. Hoá chất dụng cụ dùng trong nghiên cứu 2.3.1 Dụng cụ - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detectơ PDA hoặc UV-VIS - Cột sắc ký C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) - Hệ chiết pha rắn - Cột chiết pha rắn Strata X-polymeric (500mg, 6ml) - Máy cất quay chân không - Máy lắc vortex - Máy li tâm - Máy đồng nhất mẫu - Máy đo pH - Bể điều nhiệt - Cân phân tích điện tử (độ chính xác 0,00001g) - Cân phân tích (độ chính xác 0,0001g) - Cân kĩ thuật (độ chính xác 0,01g) - Cốc có mỏ các loại dung tích 50, 100, 250 ml - Bình định mức thuỷ tinh các loại dung tích 10, 20, 100 ml, 1 lít và 2 lít - Vial loại 1,8 ml - Pipetman loại 200, 1000 ml và đầu tuyp. - Ống li tâm dung tích 50 ml. 2.3.2 Hoá chất Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích - Chuẩn Benzyl penicillin (Penicillin G) (từ Sigma) Penicillin G sodium salt (C16H17N2NaO4S) - Chuẩn phenoxymetyl penicillin Kali (Penicillin V) (viện kiểm nghiệm thuốc trung ương) C16H17KN2O5S (98,90%) - Acetonitril 11 - Methanol - Natri tungstat - Thuỷ ngân (II) clorid - 1,2,4- triazole - Natri thiosulfat - Natri hydroxid - Natri clorid - Kali dihydro photphat - Dikali hydro photphat - Acid sulfuric 2.3.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử 2.3.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin G - Dung dịch chuẩn gốc Penicillin G 1000mg/l: cân chính xác 0,1g chuẩn Penicillin G, hoà tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml. - Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin G 10 mg/l: hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc penicillin G 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất. 2.3.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin V - Dung dịch chuẩn gốc Penicillin V 1000mg/l: cân chính xác 0,1g chuẩn Penicillin V, hoà tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml. - Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin V 10 mg/l: hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc penicillin V 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất. 2.3.3.3 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc của 2 penicillin 2µg/ml: hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn trung gian 10 mg/l của mỗi penicillin vào bình định mức 5ml và định mức đến vạch bằng nước cất Các dung dịch chuẩn penicillin được bảo quản lạnh (nhiệt độ 2 – 4oC), tránh ánh sáng. 2.3.3.4 Đệm photphat 0,1M pH 6.5 Cân 7,98 gam K2HPO4.3H2O; 8,84 gam KH2PO4 và 3,89 gam Na2S2O3. Hoà tan hỗn hợp trên vào nước và chuyển vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch bằng nước cất. 2.3.3.5 Chuẩn bị pha động chạy sắc ký. 12 - Kênh A: Lấy 240ml acetonitril, 60 ml metanol cho vào bình định mức 1000 ml và định mức đến vạch bằng đệm photphat pH 6,5. - Kênh B: Lấy 300ml acetonitril và 200 ml metanol cho vào bình định mức 1000 ml và định mức đến vạch bằng đệm photphat pH 6,5. 2.3.3.6 Chuẩn bị dung dịch Natri tungstat 0,68M Cân 22,43 gam Na2WO4.2H2O, hoà tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml. 2.3.3.7 Chuẩn bị dung dịch acid sulfuric 0,68M Hút 3,8 ml dung dịch H2SO4 đặc vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất 2.3.3.8 Chuẩn bị dung dịch đệm photphat 25mM, pH 9 Cân 0,34 gam KH2PO4, hoà tan vào nước. Chỉnh đến pH 9 bằng NaOH 5M; 0,5M. Sau đó chuyển vào định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất. 2.3.3.9 Chuẩn bị dung dịch HgCl2 0,1M Cân 0,2715 gam HgCl2, hoà tan và định mức bằng nước cất đến 10ml. 2.3.3.10 Chuẩn bị dung dịch dẫn xuất Cân 13,78 gam 1,2,4 – triazol, thêm vào 60 ml H2O và 10ml HgCl2 0,1M. Dùng NaOH 0,5 M chỉnh đến pH 9,0 ± 0,05. Sau đó chuyển sang bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất. Để yên 24 giờ trước khi sử dụng. Bảo quản trong bình màu nâu. Chỉ sử dụng phần dịch trong phía trên. 13 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu các điều kiện xác định penicillin G và V bằng HPLC 3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện Detectơ là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Penicillin G và V hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại. Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn detectơ PDA để phát hiện và định lượng 2 penicillin này. Tham khảo tài liệu [11] với các điều kiện sau: - Cột Symmestry waters C18 (150mm × 4,6mm × 5µm) - Detectơ PDA: 220nm - Nhiệt độ buồng cột: 35oC - Tốc độ dòng: 1,5ml/phút - Pha động: A: H2O (0,01% TFA); B: ACN (0,01% TFA) với chương trình gradient: Bảng 3: Chương trình gradient rửa giải các penicillin (không dẫn xuất) Thời gian %A %B 0 100 0 3 100 0 8 63 37 19 63 37 20 100 0 25 100 0 Bơm hỗn hợp chuẩn 2 penicillin: PenG 25ppm, PenV 56ppm thu được sắc đồ sau: Minutes02 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24mAU0 25 50 75 100mAU0255075100PenG 13.643 435014 35626PenV 15.083 1498533 90893 Hình 3: Sắc đồ chạy chuẩn PenG 25ppm – Pen V 56ppm (không dẫn xuất) 14 Bơm mẫu thịt lợn thêm chuẩn thu được sắc đồ sau: Minutes02 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22mAU020 40mAU02040PenG 13.824 57738 4211PenV 15.339 87391 7740 Hình 4: Sắc đồ chạy mẫu thịt lợn (thêm chuẩn ở mức 1mg/kg đối với Pen G và 2,2mg/kg đối với Pen V) (không dẫn xuất) Có thể sử dụng detectơ PDA tại bước sóng 220nm để xác định các penicillin. Tuy nhiên giới hạn phát hiện của phương pháp này không cao (LOD ~ 2ppm). Mặt khác, có rất nhiều chất hấp thụ tại vùng bước sóng 220nm, nên sắc đồ thu được chứa nhiều tạp chất gây khó khăn cho việc phát hiện và định lượng chất phân tích. Tức là phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc kém. Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp dẫn xuất hoá các penicillin để mở rộng vùng bước sóng UV làm tăng độ chọn lọc của phương pháp, giảm tối đa ảnh hưởng độ hấp thụ của nền mẫu. Tác nhân dẫn xuất được sử dụng ở đây là hỗn hợp 1,2,4-triazole và thuỷ ngân (II) clorid. Sản phẩm của quá trình dẫn xuất hấp thụ cực đại tại bước sóng 225nm và 323nm. Chúng tôi lựa chọn bước sóng 323nm để phát hiện và định lượng các penicillin. Hình 5: Sắc đồ 3D của hỗn hợp chuẩn Penicillin G 0,4ppm – Penicillin V 0,8ppm. 15 3.1.2 Chọn pha động Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định đến hiệu quả tách sắc ký. Nhìn chung, pha động có thể ảnh hưởng đến: độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lưu trữ, hiệu lực của cột tách, độ phân giải, độ rộng của pic sắc ký. Trong HPLC, pha động phân cực được sử dụng phổ biến với thành phần chủ yếu là nước mang lại tính kinh tế cao. Để tách 2 penicillin ra khỏi các chất cản trở trong nền mẫu và định lượng nó một cách dễ dàng và chính xác, pha động sử dụng phải phân cực. Để đảm bảo sự ổn định của kết quả, đặc biệt là thời gian lưu, chúng tôi sử dụng hệ đệm. Hệ đệm được lựa chọn ở đây là đệm photphat 0,1M; pH 6,5. Khảo sát chương trình pha động trên 3 kênh: A: Đệm photphat 0,1M; pH 6,5; B: ACN; C: MeOH Cố định các điều kiện: - Cột Symmestry waters C18 (150mm × 4,6mm × 5µm) - Detectơ: PDA 323nm - Nhiệt độ buồng cột: 40oC - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Mẫu phân tích: dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 penicillin 0,4ppm. Khảo sát các thành phần pha động khác nhau, thu được kết quả sau: Bảng 4: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thời gian lưu của 2 penicillin. Thành phần pha động Kết quả %A %B %C Thời gian lưu của Pen G (phút) Thời gian lưu của Pen V (phút) 90 0 10 Không tìm thấy Không tìm thấy 65 35 0 2,581 2,869 70 20 10 Không rõ Không rõ 60 30 10 3,669 4,107 60 25 15 4,843 5,440 16 Minutes01 2 3 4 5 6 7 8 9 10mAU0 5 10mAU0510 3.669 57621 4.107 332121: 323 nm, 8 nmPensstd mix 200_60-30-10.datNameRetention TimeArea Hình 5: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm tại thành phần pha động A: B: C = 60 : 30 : 20 Từ bảng kết quả trên, chúng tôi nhận thấy, với chế độ chạy isocractic: nếu thành phần pha động chỉ gồm đệm photphat và MeOH thì chất phân tích không được rửa giải; nếu thành phần pha động chỉ gồm đệm photphat và ACN thì thời gian lưu của 2 penicillin thấp và chúng không tách khỏi nhau được. Thành phần pha động có cả đệm photphat, ACN và MeOH với các tỉ lệ khác nhau thì thời gian lưu có cao hơn nhưng khả năng tách của 2 chất ra khỏi nhau vẫn chưa tốt. Do vậy, chúng tôi sử dụng chế độ gradient với chương trình rửa giải như sau: A: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60 B: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200 Bảng 5: Chương trình gradient rửa giải các penicillin (dẫn xuất) Thành phần pha động Thời gian (phút) %A %B 0 100 0 20 0 100 21 100 0 25 100 0 Ban đầu, giữ ổn định ở 100%A. Từ 0-20 phút, thành phần pha động thay đổi tuyến tính từ 100%A đến 100%B. Trong khoảng thời gian này, chất phân tích được rửa giải. Đến 21 phút, quay trở lại 100%A. Từ 21-25 phút, duy trì ổn định ở 100%A. Đây là thời gian ổn định và hoạt hóa cột để chạy mẫu tiếp theo. 17 Minutes02 4 6 8 10 12 14 16 18mAU0 1 2 3mAU0123PenG 8.512 53587 2414PenV 9.557 24359 1225 Hình 6: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm (chương trình rửa giải gradient) 3.1.3 Chọn cột tách Cột tách là trung tâm của phép tách sắc ký. Penicillin G và V có tính phân cực, pha động phân cực. Do vậy, cột tách sử dụng phải là cột pha đảo. Phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát trên một số loại cột C18. Cố định các điều kiện sau: - Pha động: chương trình gradient như trên - Detectơ: PDA 323nm - Nhiệt độ buồng cột: 40oC - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Mẫu phân tích: dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 penicillin 0,4ppm Thu được các kết quả sau: Minutes02 4 6 8 10 12 14 16 18 20mAU1 2 3mAU123PenG 8.309 28513 1385PenV 9.461 22263 1022 Hình 7: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm (cột Symmestry waters: 150mm × 4,6mm × 5µm) 18 Minutes2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24mAU1 2 3 4mAU1234PenG 12.640 45263PenV 14.016 34526 Hình 8: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm (cột Symmestry waters: 250mm × 4,6mm × 5µm) Minutes01 2 3 4 5 6 7 8 9 10mAU0 2 4 6mAU0246 4.032 55994 4502 4.427 35132 2492 Hình 9: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm (cột ODS: 150mm × 4,6mm × 5µm) Từ các kết quả trên chúng tôi nhận thấy, cột Symmestry waters phù hợp để tách và định lượng penicillin G và penicillin V. Sử dụng cột với chiều dài 250mm thời gian lưu được kéo giãn và khả năng tách cũng tốt hơn. Do vậy, chúng tôi lựa chọn cột tách với các thông số như sau: - Loại cột: Symmestry waters C18 - Chiều dài cột: 250mm - Đường kính cột: 4,6mm - Cỡ hạt: 5µm Tuy nhiên, hiện nay có rất nhiều loại cột với cỡ hạt và đường kính cột nhỏ hơn, khả năng tách của chất phân tích sẽ tốt hơn. Một số tài liệu [12] đã sử dụng loại cột C18 (150mm × 3,9mm × 4µm ). Tóm lại, các thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký là: - Cột Symmestry waters C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) - Pha động: chương trình gradient A: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60 B: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200 19 Thành phần pha động Thời gian (phút) %A %B 0 100 0 20 0 100 21 100 0 25 100 0 - Detectơ: PDA 323nm - Nhiệt độ buồng cột: 40oC - Tốc độ dòng: 1ml/phút 3.2 Tối ưu hoá các điều kiện xử lí mẫu Nguyên tắc: Penicillin G và V được tách ra khỏi nền mẫu bằng nước cất, loại các tạp chất hữu cơ bằng hỗn hợp acid sulphuric và natri tungstat, làm sạch qua cột chiết pha rắn SPE, dẫn xuất với hỗn hợp 1,2,4-triazole và thuỷ ngân (II) clorid, phát hiện và định lượng bằng săc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại. QUY TRÌNH DỰ KIẾN CHIẾT PENICILLIN G VÀ V 20 5ml đệm photphat 25mM Mẫu (~5g)/ống li tâm 50ml + 20ml H2O + 2ml H2SO4 0,68M + 2ml Natri tungstat 0,68MLắc vortex, để yên 5 phút Đồng nhất Lọc / bình nón 50ml Li tâm 6000 v/ph, 5 phút bã Chỉnh đến pH phù hợp SPE hoạt hoáRửa giải bằng 10ml ACN/bình cất quay HPLC Rung siêu âm ở 55oC, 30 phút Cô quay đến cạn, 40oC+ 500µL đệm photphat 25mM, pH 9 + 500µL hỗn hợp dẫn xuất 3ml MeOH 3ml H2O rửa tạpHút khô 1 phút 21 3.2.1 Khảo sát cột chiết pha rắn SPE Khảo sát hiệu lực chiết penicillin G và V trên hai loại cột: cột SPE C18 và cột SPE Polymeric. Sử dụng nền mẫu thịt lợn không phát hiện penicillin, thêm cùng một mức chuẩn: PenG 40mg/kg, Pen V 60mg/kg , mỗi loại cột làm lặp 3 lần. Tiến hành phân tích như qui trình trên, tiêm vào hệ thống HPLC và lấy kết quả trung bình: Bảng 6: Ảnh hưởng của loại cột SPE đến hiệu lực chiết các penicillin Loại cột SPE Diện tích Pen G (mAU) Diện tích Pen V (mAU) Polymeric 13422 6530 C18 9882 4870 Minutes02 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24mAU0 1 2mAU012PenG 12.800 12964PenV 14.208 6003 Hình 10: Sắc đồ chạy mẫu thịt lợn thêm chuẩn: PenG 40mg/kg, Pen V 60mg/kg (sử dụng cột Polymeric) Minutes2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24mAU0 1 2mAU012PenG 12.779 9287PenV 14.165 4877 Hình 11: Sắc đồ chạy mẫu thịt lợn thêm chuẩn: PenG 40mg/kg, Pen V 60mg/kg (sử dụng cột C18) Về bản chất, hai loại cột này khác nhau không nhiều, chúng đều là cột pha đảo. Cột C18 bao gồm các gốc C18 gắn trên bề mặt của silica. Cột Polymeric bao gồm các mạch polime gắn lên bề mặt silica. Tuy nhiên, với cấu tạo của Penicillin G và V, cột Polymeric 22 có khả năng lưu giữ tốt hơn do lực tương tác Vandevan mạnh hơn. Do đó, làm sạch mẫu sử dụng cột Polymeric cho nền mẫu sạch hơn và hiệu quả chiết tốt hơn. 3.2.2 Khảo sát pH của dịch chiết trước khi qua SPE pH của dịch chiết trước khi qua SPE ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết các penicillin. Sau khi li tâm, pH của dịch chiết nằm trong khoảng 4 – 5. Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng 4 – 11. Sử dụng mẫu thịt lợn không phát hiện penicillin, thêm cùng một nồng độ chuẩn: Pen G 50mg/kg, Pen V 200mg/kg, tại mỗi mức làm lặp 3 lần và lấy kết quả trung bình thu được bảng sau: Bảng 7: Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả chiết qua SPE pH 4,4 6,43 7,71 8,23 8,56 9,15 10,01 11,07 Diện tích pic PenG (mAU) 14902 15039 17596 18853 19563 17755 13493 5236 Diện tích pic PenV (mAU) 23225 26534 30868 31859 32785 31396 25267 15334 Vẽ đồ thị mối quan hệ giữa diện tích pic penicillin G và V vào pH thu được đồ thị sau: 050001000015000200002500030000350004681012pHarea Hình 12: Đồ thị sự ảnh hưởng của pH đến hiệu quả chiết qua SPE Từ các kết quả trên chúng tôi nhận thấy, trong khoảng nồng độ pH từ 8-9, hiệu quả chiết đạt giá trị cực đại, giảm ít khi pH < 8 và giảm mạnh khi pH > 9. Điều này có thể giải thích như sau: trong môi trường acid, nhóm –OH trên các penicillin kết hợp với H+ tạo thành dạng cation, độ phân cực tăng, khả năng lưu giữ trên cột polymeric giảm (nên bị mất trong quá trình nạp mẫu hoặc rửa tạp). Mặt khác, penicillin G kém bền trong môi trường pH thấp. Nó tồn tại không quá 5 phút ở môi trường pH < 3 [12]. Trong môi trường bazơ, các penicillin ở dạng nguyên thể với độ phân cực kém và tương tác tốt hơn với cột polymeric. Tuy nhiên, nếu môi trường bazơ quá mạnh, các penicillin dễ bị phân huỷ và hiệu lực của cột SPE cũng giảm. Do đó hiệu suất chiết giảm đáng kể. Cũng từ đồ thị trên 23 nhận thấy, tương tác giữa penicillin G và penicillin V với cột SPE khá giống nhau. Một số tài liệu đã sử dụng penicillin V làm nội chuẩn khi xác định các penicillin khác. Minutes2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24mAU0.5 1.0 1.5 2.0 2.5mAU0.51.01.52.02.5PenG 13.269 15596PenV 14.709 26868 Hình 13: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn Pen G 50mg/kg, Pen V 200mg/kg (điều chỉnh pH = 6,43 trước khi qua SPE) QUY TRÌNH CHIẾT PENICILLIN G VÀ V TRONG THỰC PHẨM 24 Mẫu (~5g)/ống li tâm 50ml + 20ml H2O + 2ml H2SO4 0,68M + 2ml Natri tungstat 0,68MLắc vortex, để yên 5 phút Đồng nhất Lọc / bình nón 50ml Li tâm 6000 v/ph, 5 phút bã Chỉnh pH = 8 – 9 với NaOH 4N, NaOH 0,4N SPE hoạt hoáRửa giải 10ml ACN/bình cất quay HPLC Bề điều nhiệt 55oC, 30 phút Cô quay đến cạn, 40oC+ 500µL đệm photphat 25mM, pH 9 + 500µL hỗn hợp dẫn xuất 3ml MeOH 3ml H2O 5ml đệm photphat 25mM rửa tạpHút khô 1 phút

Tài liệu liên quan

Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp xác định hàm lượng vitamin D (D2 và D3 ) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- 59
- 2
- 10
Xác định dư lượng penicillin G và V trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
- 40
- 3
- 6
Định lượng alpha tocopherol (vitamin e) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- 92
- 2
- 6
nghiên cứu xây dựng qui trình định lượng đồng thời chất ngọt tổng hợp aspatam và acesulpam trong một số sản phẩm thực phẩm băng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao
- 28
- 803
- 1
Nghiên cứu xác định hàm lượng chất cấm dexamethason acetat trong mỹ thẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
- 75
- 1
- 4
Xây dựng quy trình phân tích diquat và paraquat trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
- 60
- 578
- 1
Định lượng AlphaTocopherol (Vitamin E) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- 93
- 2
- 21
Nghiên cứu, xác định đồng thời hàm lượng vitamin a, d2, d3 trong một số thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- 72
- 931
- 7
Nghiên cứu xác định hàm lượng chất cấm dexamethason acetat trong mỹ thẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
- 79
- 833
- 2
Định lượng AlphaTocopherol (Vitamin E) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- 89
- 1
- 1