XÁC ĐỊNH LD50 (LETHAL DOSE 50%) CỦA Edwardsiella Ictaluri ...

Tải bản đầy đủ (.pdf) (92 trang)

1. Trang chủ
>>
2. Thạc sĩ - Cao học
>>
3. Khoa học tự nhiên

XÁC ĐỊNH LD50 (LETHAL DOSE 50%) CỦA Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY NHIỄM QUA ĐƯỜNG TIÊU HÓA

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.44 MB, 92 trang )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCMKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPXÁC ĐỊNH LD50 (LETHAL DOSE 50%)CỦA Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA BẰNG PHƯƠNGPHÁP GÂY NHIỄM QUA ĐƯỜNG TIÊU HÓANgành: Nuôi Trồng Thủy SảnChuyên ngành: Ngư YNiên khóa: 2006-2010Sinh viên thực hiện: LÝ ĐỨC TRỌNGTháng 07/2010  XÁC ĐỊNH LD50 (LETHAL DOSE 50%)CỦA Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂYNHIỄM QUA ĐƯỜNG TIÊU HÓATác giảLÝ ĐỨC TRỌNGKhóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngànhNuôi Trồng Thuỷ Sản chuyên ngành Ngư YGiáo viên hướng dẫnTS. NGUYỄN HỮU THỊNHTháng 7 năm 2010i  CẢM TẠChúng tôi xin chân thành cảm tạ:Cha mẹ và gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên và hỗ trợ cả về tinh thần lẫn vật chấtcho con trong suốt quá trình học tập.Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.Ban Chủ nhiệm Khoa Thuỷ Sản cùng tất cả quý thầy cô đã tận tâm truyền đạt nhữngkiến thức quí báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho chúng tôi trong suốt quátrình học tập.Chúng tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Nguyễn Hữu Thịnh và anh Đỗ ViếtPhương đã hướng dẫn chúng tôi hoàn thành tốt Luận văn này với tất cả tráchnhiệm và lòng nhiệt thành.Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè và tập thể Lớp Ngư y 32 đã luôn ở bên chúng tôi,chia sẻ và động viên chúng tôi trong suốt thời gian qua.Chúng tôi rất mong nhận được sự thông cảm và đóng góp ý kiến của quý thầy cô vàcác bạn.ii  TÓM TẮTĐề tài ” Xác định LD50 của Edwardsiella ictaluri trên cá tra bằngphương pháp gây nhiễm qua đường tiêu hóa” được thực hiện bắt đầu từ25/02/2010 đến 30/05/2010 tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, trường ĐạiHọc Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Thí nghiệm được tiến hành để xác địnhliều gây chết 50% số cá tra thí nghiệm (LD50) của vi khuẩn E.ictaluri bằng phươngpháp gây nhiễm qua đường tiêu hóa.Thí nghiệm 1:+ Tỉ lệ cá chết tích lũy ứng với các mật độ vi khuẩn gây nhiễm 0 CFU/10 g cá, 1,1x 108 CFU/10 g cá , 1,1 x 107 CFU/10 g cá, 1,1 x 106 CFU/10 g cá, 1,1 x 105CFU/10 g cá, 1,1 x 104 CFU/10 g cá lần lượt là 0%, 85%, 45%, 22,5%, 2,5%,2,5%.+ Liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) là 1,04 x 107 CFU/10 g cá (theo Reed –Muench), 1,00 x 107 CFU/10 g cá (theo phân tích propit) và 0,8 x 107 CFU/10 g cá(theo phương trình hồi quy tuyến tính - R2 là 0,928).Thí nghiệm 2:+ Tỉ lệ cá chết ứng với các mật độ vi khuẩn 0 CFU/10 g cá, LD50 CFU/10 g cá, 5 xLD50 CFU/10 g cá lần lượt là 0%, 60%, 82%.iii  MỤC LỤCĐỀ MỤCTrangTrang tựaiLời cảm ơniiTóm tắtiiiMục lụcivDanh sách các chữ viết tắtviiiDanh sách các bảngixDanh sách các hình ảnhxDanh sách các biểu đồxiCHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU11.1 Đặt Vấn Đề11.2 Mục Tiêu Đề Tài11. 3 Nội Dung Đề Tài2CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN32.1 Đặc Điểm Sinh Học của Cá Tra32.1.1 Phân loại32.1.2 Nguồn gốc và phân bố32.1.3 Đặc điểm hình thái32.1.4 Điều kiện môi trường sống42.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng42.1.6 Đặc điểm sinh trưởng – sinh sản42.1.6.1 Sinh trưởng42.1.6.2 Đặc điểm sinh sản52.2 Một Số Quan Niệm Về Bệnh52.3 Bệnh Gan Thận Mủ Trên Cá Tra62.3.1 Sơ lược về bệnh62.3.2 Tác nhân gây bệnh72.3.3 Đường lây truyền của E. ictaluri vào cơ thể cáiv  82.3.4 Triệu chứng và bệnh tích82.3.5 Phương pháp chẩn đoán bệnh92.3.6 Phương pháp phòng và trị bệnh92.4 Các Phương Pháp Gây Cảm Nhiễm Nhân Tạo Cho Cá Tra92.4.1 Phương pháp tiêm92.4.2 Phương pháp ngâm102.4.3 Phương pháp nuôi chung102.4.4 Phương pháp đường tiêu hóa102.5 Sơ Lược Về LD50112.5.1 Định nghĩa112.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến LD50112.5.3 Phương pháp xác định LD50 theo Reed và Muench (1938)112.5.4 Một số nghiên cứu về LD50 của E. ictaluri12CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU143.1 Thời Gian Và Địa Điểm143.2 Vật Liệu Nghiên Cứu143.2.1 Dụng cụ143.2.2 Hóa chất và môi trường143.2.2.1 Hóa chất143.2.2.2 Môi trường153.2.3 Đối tượng thí nghiệm153.2.3.1 Cá thí nghiệm153.2.3.2 Vi khuẩn153.3 Phương Pháp Nghiên Cứu153.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm153.3.1.1 Thí nghiệm 1: Xác định LD50 của E. ictaluri trên cá tra153.3.1.2 Thí nghiệm 2: Xác định liều 5 x LD50 của E. ictaluri trên cá tra163.3.1.3 Các chỉ tiêu theo dõi173.3.2 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn173.3.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn183.3.4 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm18v  3.3.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm193.3.6 Phương pháp cấy phân lập203.3.7 Phương pháp cấy thuần203.3.8 Phương pháp định danh sơ bộ203.3.8.1 Phương pháp nhuộm gram203.3.8.2 Thử nghiệm khả năng di động213.3.8.3 Thử nghiệm Catalase213.3.8.4 Thử nghiệm Oxidase213.3.9 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit định danh Nam Khoa (IDS 14 GNR)223.3.9.1 Thử nghiệm LDC bằng kit định danh IDS 14 GNR233.3.9.2 Thử nghiệm di động bằng kit định danh IDS 14 GNR233.3.10 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng của cá233.3.11 Phương pháp tính LD50243.3.12 Phương pháp xử lí số liệu25CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN264.1 Các chỉ tiêu môi trường264.2 Kết Quả Thí Nghiệm 1274.2.1 Trọng lượng cá thí nghiệm274.2.2 Kết quả kiểm tra kí sinh trùng274.2.3 Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá284.2.4 Kết quả định danh vi khuẩn284.2.5 Triệu chứng và bệnh tích314.2.6 Tỷ lệ cá chết344.2.7 Kết quả phân lập cá còn sống sau 14 ngày gây nhiễm364.2.8 Kết quả LD50374.3 Kết quả thí nghiệm 2404.3.1 Trọng lượng cá thí nghiệm 2404.3.2 Kết quả kiểm tra kí sinh trùng404.3.3 Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá404.3.4 Kết quả định danh vi khuẩn414.3.5 Triệu chứng và bệnh tích41vi  4.3.6 Tỷ lệ cá chết424.3.7 Kết quả phân lập cá còn sống sau 14 ngày gây nhiễm ở thí nghiệm 245CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ475.1 Kết Luận475.2 Đề Nghị47TÀI LIỆU THAM KHẢOPHỤ LỤCvii  DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮTLD50Lethal Dose 50%BNPBacillacy Necrosis of PangasiusBHIABrain Heart Infusion AgarBHIBBrain Heart Infusion BrothVPVoges-poskauerONPGO-Nitrophenyl β – D GalactopyrannosidePADPhenyl Alanin DeaminnaseLDCLysin decarboxylaseDODissolve OxygenTSATryptic Soy AgarPCRPolymerase Chain ReactionCFUColony Forming Unitviii  DANH SÁCH CÁC BẢNGTrangBảng 3.1: Tỷ lệ thức ăn, nước và huyền dịch vi khuẩngây nhiễm thí nghiệm 115Bảng 3.2: Tỷ lệ thức ăn, nước và huyền dịch vi khuẩngây nhiễm thí nghiệm 216Bảng 3.3: Số thứ tự các đĩa giấy trong các giếng22Bảng 4.1: Các chỉ tiêu môi trường của quá trình thí nghiệm26Bảng 4.2: Trọng lượng cá trung bình của các nghiệm thứcThí nghiệm 127Bảng 4.3: Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá của cácnghiệm thức thí nghiệm 128Bảng 4.4: Kết quả các phản ứng sinh hóa của E. ictaluribằng test định danh ISD 14 GNR của công ty Nam Khoa.29Bảng 4.5: Tỷ lệ cá chết của các nghiệm thức trong thí nghiệm 134Bảng 4.6: Tỷ lệ nhiễm E. ictaluri (%) trong cơ thể cá còn sốngthí nghiệm 136Bảng 4.7: Tỷ lệ sống và chết (%) của cá thí nghiệmtrong mỗi nồng độ pha loãng37Bảng 4.8: Tương quan giữa tỷ lệ chết với độ pha loãngđược tính bằng phần mềm MiniTab38Bảng 4.9: Trọng lượng cá trung bình của các nghiệm thứcthí nghiệm 240Bảng 4.10: Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cátheo lý thuyết và theo thực tế41Bảng 4.11: Tỷ lệ cá chết của các nghiệm thức trongthí nghiệm 243Bảng 4.12: Tỷ lệ chết theo tính toán và theo thực tế43Bảng 4.13: Tỷ lệ nhiễm E. ictaluri trong cơ thể cá còn sống thí nghiệm 246ix  DANH SÁCH CÁC HÌNHTrangHình 3.1: Thao tác cân khuẩn lạc vi khuẩn17Hình 3.2: Ống tiêm dùng để bơm hỗn hợpthức ăn và vi khuẩn vào dạ dày của cá18Hình 3.3: Thao tác gây nhiễm cho cá19Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluriphân lập từ cá bệnh30Hình 4.2: Hình dạng của vi khuẩn E. ictalurikhi nhuộm gram30Hình 4.3: Kết quả định danh E. ictaluri bằngtest định danh ISD 14 GNR của công ty Nam Khoa31Hình 4.4: Cá thí nghiệm 1 bị xuất huyết các gốc vây và mangsau 9 ngày gây nhiễm E. ictaluri32Hình 4.5: Cá thí nghiệm xuất hiện các đốm mủ trắngtrên gan thận lách ở ngày thứ 933Hình 4.6: Cá thí nghiệm 2 xuất hiện các đốm mủ trắngtrên gan thận lách ở ngày thứ 542x  DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒTrangBiểu đồ 4.1: Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của cácnghiệm thức thí nghiệm 1 trong 14 ngày gây bệnh35Biểu đồ 4.2: Đồ thị tương quan giữa tỷ lệ chếtvà nồng độ gây nhiễm38Biểu đồ 4.3: Đồ thị tương quan giữa độ pha loãng và tỷ lệ chết39Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của cácnghiệm thức thí nghiệm 2 trong 14 ngày gây bệnhxi  44Chương 1MỞ ĐẦU1.1 Đặt Vấn ĐềVài năm trở lại đây, nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam ngày càng chứng tỏ đượcvai trò trọng yếu của mình trong cơ cấu kinh tế nước nhà, với những thành quả đã gặthái và tiềm năng phát triển rộng mở trong tương lai.Sản phẩm chế biến từ đối tượng cá tra nuôi đã cho thấy vai trò chiến lược quantrọng của mình trong cơ cấu ngành thủy sản Việt Nam. Theo Hiệp Hội Chế Biến VàXuất Khẩu Thủy Sản Việt Nam (VASEP), trong 5 tháng đầu năm 2009 kim ngạch xuấtkhẩu cá tra lên đến 477 triệu đô la Mỹ, trong khi đó kim ngạch xuất khẩu tôm chỉ đạt441 triệu đô la Mỹ. Dự kiến trong toàn năm 2010, kim ngạch xuất khẩu cá tra sẽ vượtngưỡng 1,5 tỉ đô la Mỹ.Tuy nhiên, bên cạnh những kết quả ấn tượng về sản lượng, kim ngạch xuất khẩuvà thị phần trên thị trường thế giới, nghề nuôi cá tra Việt Nam vẫn còn đó rất nhiều bấtcập tồn đọng, như vấn đề quản lý nghề nuôi còn chưa tốt, thiếu đồng bộ, giá cả sảnphẩm thất thường, người nuôi vẫn còn thiếu những hỗ trợ kĩ thuật cần thiết nhưng đángquan ngại nhất trong số đó chính là vấn đề dịch bệnh, đặc biệt là dịch bệnh gan thận mủdo vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra.Hàng năm, dịch bệnh gan thận mủ trên cá tra do Edwardsiella ictaluri vẫn gây ranhững thiệt hại rất to lớn cho nghề nuôi cá tra đồng bằng sông Cửu Long. Bệnh nàyđược phát hiện lần đầu tiên vào năm 1992 (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007), nguyên nhânbùng phát dịch bệnh chủ yếu là do vùng nuôi phát triển tự phát không theo quy hoạch,mật độ nuôi ngày càng cao nhưng thiếu các biện pháp quản lý phòng ngừa dịch bệnh.Trước đây, bệnh thường xảy ra chỉ khoảng 1 – 2 lần/ năm, nhưng hiện nay bệnh có thểxảy ra gần như quanh năm.1  Về tác nhân gây bệnh, vi khuẩn E. ictaluri có độc lực rất mạnh và có thể lâytruyền qua nhiều đường. Trong đó, con đường truyền lây qua đường tiêu hóa rất quantrọng và nguy hiểm cho cá tra nhưng hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về vấn đềnày. Do đó, việc xác định được liều vi khuẩn cần thiết có thể dẫn đến biểu hiện bệnh ganthận mủ ở cá tra thông qua con đường tiêu hóa là rất cần thiết. Từ những lý do trên, lạiđược sự phân công và hỗ trợ của Khoa Thủy Sản trường Đại học Nông Lâm Thành PhốHồ Chí Minh, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “ Xác định LD50 của Edwardsiellaictaluri trên cá tra bằng phương pháp gây nhiễm qua đường tiêu hóa”.1.2 Mục Tiêu Đề TàiGây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp cho ăn thức ăn có chứa vi khuẩn, từ đóxác định LD50 của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.1.3 Nội Dung Đề Tài- Tiến hành gây cảm nhiễm cá tra với vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp gâynhiễm qua đường tiêu hóa.- Quan sát triệu chứng bệnh tích và ghi nhận tỷ lệ cá chết.- Tiến hành phân lập và định danh vi khuẩn.- Khảo sát tỷ lệ cá chết, tính LD50 và đưa ra kết luận.2    Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1. Đặc Điểm Sinh Học của Cá Tra2.1.1 Phân loạiNgành: Chordata.Ngành phụ: Vertebrata.Lớp: Osteichthyes.Bộ: Siluriformes.Họ: Pangasiidae.Giống: Pangasianodon.Loài: Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1880)2.1.2 Nguồn gốc và phân bốCá tra trong tự nhiên phân bố khá rộng ở vùng Đông Nam Á. Ở Việt Nam, cá traphân bố dọc theo khu vực sông Mêkông. Những năm trước đây, khi chưa có sinh sảnnhân tạo cá tra, thì cá bột và cá giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởngthành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp trong địa phận Việt Nam do cá có tập tính di cưngược dòng sông Mêkông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên.2.1.3 Đặc điểm hình tháiCá tra có đầu rộng, dẹp bằng, mõm ngắn. Răng nhỏ mịn, răng vòm miệng chialàm bốn đám nhỏ mỏng chia làm đường vòng cung. Có hai đôi râu, râu mép ngắn kéodài chưa đến gốc vây ngực.Thân thon dài, không vảy, màu sắc đen xám trên mặt lưng của đầu và thân,bụng màu trắng bạc, phần chót đuôi hơi đỏ, tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng của đầu cátra lớn hơn cá basa.3  Đường bên kéo dài hoàn toàn theo chiều dọc của thân và phân nhánh bắt đầu từmép trên của lỗ mang đến gốc vây đuôi, mặt sau của gai vi lưng và vi ngực có răng cưa.Cá khi còn nhỏ thì phần lưng của đầu và thân có màu xanh lục. Ngoài ra, cá còncó hai sọc màu xanh lục chạy dài theo chiều dọc của thân, sọc này lợt dần và mất đi khicá lớn.2.1.4 Điều kiện môi trường sốngCá tra sống được ở các thủy vực nước chảy và nước tĩnh. Cá sống chủ yếu ởthủy vực nước ngọt, cũng có thể sống ở nước lợ với nồng độ muối thấp.Oxy hòa tan: Số lượng hồng cầu trong máu cá tra nhiều hơn trong máu các loàicá khác. Chúng có cơ quan hô hấp phụ, có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu đựngđược môi trường thiếu oxy hòa tan. Hàm lượng oxy hòa tan tối ưu cho cá là 3 – 6mg/L.Nhiệt độ: 26 – 30oC (ở 15oC cường độ bắt mồi giảm nhưng cá vẫn sống. Ở 39oCcá bơi lội không bình thường).pH tối ưu: 6,5 – 8 (ở pH = 5 cá mất nhớt, râu teo hoạt động chậm chạp, khi pH =11 cá lờ đờ và có biểu hiện mất nhớt).Độ mặn: Cá có thể chịu đựng được độ mặn từ 8 – 10o/oo, tuy nhiên cá chủ yếusống ở nước ngọt.2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡngCá sau khi tiêu hết noãn hoàng thích ăn mồi tươi sống. Vì vậy, chúng có thể ănthịt lẫn nhau ngay trong bể ấp và trong quá trình ương nuôi nếu không được cho ăn đầyđủ. Trong quá trình ương giống, chúng ăn động vật phù du có kích thước vừa cỡ miệngvà ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi loại thức ăn. Trong điều kiện thiếu thứcăn, chúng có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như: Mùn bã hữu cơ, thức ăn cónguồn gốc động vật. Trong ao nuôi, cá tra có thể thích nghi với nhiều loại thức ăn khácnhau như cám, rau, động vật đáy, …2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng – sinh sản2.1.6.1 Sinh trưởngCá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, lúc nhỏ cá tăng nhanh về chiềudài. Cá ương trong ao sau 2 tháng có thể đạt chiều dài 12 cm (14 đến 15 g).Cá trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm. Đã gặp cỡ cá trong tự nhiên 18 kghoặc có mẫu cá dài tới 1,8 m. Trong ao nuôi cá bố mẹ cho đẻ đạt tới 25 kg ở cá 10 tuổi.4  Nuôi trong ao 1 năm cá đạt 1 – 1,5 kg/con (năm đầu tiên), những năm về sau cácàng tăng trọng nhanh hơn, có khi đạt tới 5 – 6 kg/năm.2.1.6.2 Đặc điểm sinh sảnTuổi thành thục của cá đực là 2 tuổi và cá cái là 3 tuổi, trọng lượng cá thànhthục lần đầu từ 2,5 – 3 kg. Cá tra không có cơ quan sinh dục phụ (sinh dục thứ cấp), nênnếu chỉ nhìn hình dạng bên ngoài thì khó có thể phân biệt được cá đực hay cá cái. Ở thờikỳ thành thục, tuyến sinh dục ở cá đực phát triển lớn gọi là buồng tinh hay tinh sào, ở cácái gọi là buồng trứng hay noãn sào. Tuyến sinh dục đực, cái của cá tra có thể được phânbiệt từ giai đoạn II tuy màu sắc chưa khác nhau nhiều. Các giai đoạn sau, buồng trứngtăng về kích thước, hạt trứng màu vàng, tinh sào có màu hồng chuyển dần sang trắngsữa. Hệ số thành thục của cá tra trong tự nhiên (P = 8 – 11 kg) được khảo sát vào khoảng1,76 đến 12,74 (cá cái) và từ 0,73 đến 2,1 (cá đực) (Nguyễn Văn Trọng, 1994). Trong bểnuôi vỗ, hệ số thành thục cá tra cái có thể đạt tới 19,5%.Trong tự nhiên cá tra không sinh sản ở Việt Nam. Đến mùa sinh sản, chúng dicư ngược dòng sông Mêkông đến bãi đẻ nằm trên sông Mêkông từ Sanbo đếnCampuchia.Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 – 6 dương lịch. Cácó tập tính di cư, đẻ tự nhiên trên những khúc sông có điều kiện sinh thái thích hợp thuộcđịa phận Campuchia và Thái Lan, không đẻ tự nhiên ở vùng sông của Việt Nam.Cá đẻ trứng dính vào các giá thể, thường là rễ của loài cây ven sông Gimenilaaiatica, sau 24 giờ thì trứng nở thành cá bột và trôi về hạ nguồn.Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá tra từ 200 ngàn đến vài triệutrứng (sức sinh sản tuyệt đối). Sức sinh sản tương đối của cá tra có trọng lượng 3,2 kg là139.000 trứng/ kg thể trọng. Cá đẻ trứng dính, trứng sắp đẻ có đường kính 1mm, sau khitrương nước có thể đạt 1,5 – 1,6 mm.2.2. Một Số Quan Niệm Về BệnhTôm cá sống ở trong nước hay nói một cách khác nước là môi trường sống củatôm cá. Tôm cá muốn sống được phải có một môi trường sống tốt đồng thời chúng phảicó khả năng thích ứng với môi trường. Nếu môi trường sống của tôm cá xảy ra nhữngthay đổi không có lợi cho chúng thì những con nào thích ứng được sẽ duy trì được cuộcsống, những con không thích ứng được sẽ mắc bệnh hoặc chết. Tôm cá và môi trường5  sống là một thể thống nhất. Cá tôm mắc bệnh là kết quả tác dụng lẫn nhau giữa cơ thể vàmôi trường sống (Bùi Quang Tề, 2006).Bệnh là biểu hiện trạng thái bất thường của cơ thể sinh vật với sự biến đổi xấu củamôi trường xung quanh, cơ thể nào thích ứng thì tồn tại, không thích ứng thì mắc bệnhvà chết. Hay nói cách khác, bất cứ sự thay đổi trạng thái nào đó của cơ thể hoặc một bộphận, cơ quan nào làm ảnh hưởng đến chức năng sinh lý bình thường của cơ thể sinh vậtđược gọi là bệnh.Căn cứ vào nguyên nhân gây bệnh có thể chia làm 2 loại bệnh: Bệnh truyền nhiễmvà bệnh không truyền nhiễm.Bệnh truyền nhiễm do: Vi khuẩn, nấm, virus. Tính chất lây truyền mạnh và có thểtạo thành những ổ dịch lớn, gây chết hàng loạt và có thể nhầm lẫn với nhiễm độc hóahọc.Bệnh không truyền nhiễm do: Môi trường, dinh dưỡng, độc tố (Dung, 2005).2.3 Bệnh Gan Thận Mủ Trên Cá Tra2.3.1 Sơ lược về bệnhBệnh mủ gan được ghi nhận đầu tiên xuất hiện trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vàocuối năm 1998 và có tên là BNP (Bacillacy Necrosis of Pangasius) (Dung và ctv, 2005).Bệnh này gây hại nghiêm trọng về kinh tế trên cá tra nuôi thâm canh.Bệnh xuất hiện mạnh vào mùa lũ, chất lượng nước biến động, nước chảy mạnhcá dễ bị sốc, sức khỏe giảm. Khả năng đề kháng đối với mầm bệnh giảm vì thế bệnh dễdàng bộc phát, trong một vụ nuôi bệnh mủ gan có thể xuất hiện 3 - 4 lần. Tỷ lệ hao hụtlên đến 10 - 50% tùy thuộc vào chế độ chăm sóc và vệ sinh ao (Từ Thanh Dung, 2005).Những khu vực bị ảnh hưởng chủ yếu là những vùng có nghề nuôi cá tra pháttriển mạnh, mang tính chất công nghiệp như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và VĩnhLong, sau đó lây lan sang các vùng lân cận. Đặc biệt những năm gần đây bệnh này cũngxuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nghề nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và SócTrăng (Từ Thanh Dung và ctv, 2003).Bệnh do E. ictaluri có khả năng lây lan mạnh với tỷ lệ chết cao. Bệnh có thể lâytrực tiếp từ cá sang cá thông qua chất thải như phân cá bệnh hoặc do cá khỏe ăn cá bệnh,cá chết.6  E. ictaluri có thể lây từ ao này sang ao khác qua lưới, vợt hay một số dụng cụkhác dùng chung giữa các ao. Tuy nhiên, nếu các dụng cụ này được phơi nắng trực tiếpthì có khả năng giết chết vi khuẩn.Chim, cò, vật nuôi (chó, mèo…) và người cũng góp phần làm lây lan mầm bệnh.2.3.2 Tác nhân gây bệnhBan đầu vi khuẩn Hafnia alvei và Plesiomonas shigelloides được cho là tácnhân gây bệnh (Trần Thị Minh Tâm và ctv, 2003). Về sau tác nhân gây bệnh được xácđịnh là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra (Từ Thanh Dung và ctv, 2003).Đặc điểm của E. ictaluri: E. ictaluri thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, làtrực khuẩn gram âm kích thước 1 x 2 – 3 μm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùynghi, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môitrường glucose. E. ictaluri có từ 1 - 3 plasmid (Newton và ctv, 1989). Chức năng củachúng vẫn chưa được làm rõ, nhưng có giả thuyết cho rằng chúng quan trọng trong việcnâng cao tính kháng đối với kháng sinh của E. ictaluri. Vi khuẩn phát triển chậm trênmôi trường nuôi cấy, cần mất 36 - 48 giờ để hình thành những khuẩn lạc nhỏ li ti trênmôi trường thạch BHIA tại 28 – 300C, phát triển yếu hoặc không phát triển ở 370C. Khitrong môi trường nuôi cấy có sự hiện diện của một loài vi khuẩn phát triển nhanh hơn E.ictaluri (như Aeromonas.sp) thì khi đó chúng sẽ ức chế hoặc làm cho E. ictaluri pháttriển rất chậm (Shotts và Walman, 1990).E. ictaluri có khả năng sinh tồn yếu, do nó chỉ sống được trong nước một thờigian ngắn, khoảng 8 ngày (Hawke, 1979). Tuy nhiên, chúng có thể tồn tại trong bùn đến95 ngày ở 25 oC (Plumb và Quinlan, 1986).Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có khả năng gây bệnh tự nhiên trên nhiều loàicá như bệnh viêm ruột và nhiễm trùng máu trên cá nheo Ictalurus punctatus (Hawke,1979, Hawke và ctv., 1981), cá dao xanh Eigemannia virescens (Kent và Lyons, 1982),cá danio Danio devano (Waltman và ctv., 1985), và cá trê Clarias batrachus(Kasornchandra và ctv., 1987).7  2.3.3 Đường lây truyền của E. ictaluri vào cơ thể cáE. ictaluri có thể lây nhiễm cho cá qua nhiều con đường khác nhau:+ Vi khuẩn trong nước có thể xâm nhập vào cơ thể cá thông qua đường mũi, đếndây thần kinh khứu giác, đến màng não, rồi sau đó tiếp tục đến hộp sọ và da (Morrisionvà Plumb, 1994). Vi khuẩn này tấn công vào mũi làm giảm chức năng của niêm mạcmũi ở lớp màng nhầy. Khi quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy có sự hiện diện E.ictaluri trên bề mặt màng nhầy và trong biểu mô.+ E. ictaluri cũng có thể xâm nhập qua đường tiêu hóa. Đầu tiên vi khuẩn quađường miệng, phát triển ở ruột, gan, thận và cơ, sau 2 tuần gây cảm nhiễm làm ruộttrương to, đầy hơi (Francis – Floyd và ctv., 1987). Bằng con đường này thì vi khuẩn vàomao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố da. Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thểxâm nhập qua đường tiêu hóa, qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu.+ E. ictaluri cũng xâm nhập qua mang. Một số thí nghiệm đã chứng minh trongsuốt quá trình ngâm, vi khuẩn sống thành tập đoàn trên biểu bì mang với số lượng lớn,sau đó gia tăng ở gan và ít phát triển ở thận sau, ruột và não (Nusbaum và Plumb, 1996).2.3.4 Triệu chứng và bệnh tíchTriệu chứng: Cá bệnh có xu hướng tập trung ở đầu nguồn nước hoặc hai mặt củaao, tách đàn, treo mình lơ lửng trong tầng nước, bơi lội và hô hấp chậm hơn bình thường,các phản ứng kích thích thường chậm chạp, cá bị mất thăng bằng và bơi xoay vòng. Cábỏ ăn ngay sau khi nhiễm khuẩn.Bệnh tích: Theo Từ Thanh Dung và ctv. (2003), cá tra bị nhiễm bệnh do E.ictaluri có những triệu chứng và bệnh tích điển hình nhất là: Gan, thận, lách sưng vàhoại tử. Nếu bệnh nặng có thể phát triển thành các đốm mủ trắng có đường kính từ 1 – 3mm khắp trên bề mặt của các cơ quan này.8  2.3.5 Phương pháp chẩn đoán bệnhPhân lập vi khuẩn trong môi trường BHIA hoặc môi trường TSA có bổ sung5% máu (cừu, thỏ). Đĩa cấy ủ ở nhiệt độ 28 – 30OC trong 48 giờ. Dùng KIT API 20Ehoặc Nam Khoa để định danh.Phản ứng miễn dịch: Phản ứng ngưng kết trên phiến kính, phản ứng ELISA.Dùng kĩ thuật PCR nhưng phức tạp và đòi hỏi kĩ thuật cao.2.3.6 Phương pháp phòng và trị bệnhBiện pháp phòng bệnh quan trọng nhất là quản lí môi trường nuôi tốt: Kiểm tracác chỉ tiêu chất lượng nước như: DO, NH3, nhiệt độ, pH, độ mặn, độ kiềm,…Các loại thuốc hóa chất dùng sẽ không có hiệu quả khi bệnh xảy ra. Cải tạo đáy ao vàhút bùn thật kĩ. Khi ao xảy ra bệnh thì nên giảm ăn, vớt bỏ và tiêu hủy cá bệnh. Dụng cụđược sử dụng riêng để ngăn chặn mầm bệnh lây lan và khử trùng mỗi khi sử dụng.Chọn cá giống khỏe mạnh và được kiểm tra kĩ không có mầm bệnh. Vậnchuyển cá giống đúng kĩ thuật.2.4 Các Phương Pháp Gây Cảm Nhiễm Nhân Tạo Cho CáHiện nay, để gây cảm nhiễm nhân tạo cho cá, thường có các phương pháp sauđây: Phương pháp tiêm, phương pháp ngâm, phương pháp nuôi chung và phương phápđường tiêu hóa.2.4.1 Phương pháp tiêmTheo Nguyễn Hữu Thịnh (2008), phương pháp tiêm là phương pháp gây bệnhbằng cách đưa trực tiếp vi khuẩn vào cá qua đường tiêm. Thông thường, tiêm vi khuẩnvào xoang bụng hoặc cơ lưng. Phương pháp này làm cho cá bệnh nhanh do vi khuẩnxâm nhập trực tiếp vào máu.Hiện nay, phương pháp tiêm được xem như là phương pháp gây bệnh phổ biếnnhất trong các thí nghiệm với đối tượng cá da trơn. Theo Mai Trâm (2008), khi tiến hànhtiêm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra ở các mật độ 5,5 × 103 cfu/mL; 5,5 × 104 cfu/mL;5,5 × 105 cfu/mL; 5,5 × 106 cfu/mL, cá tra thí nghiệm bắt đầu chết sau 3 ngày với các tỷlệ chết tương ứng là 93,55%, 95,65%, 97,4%, 99,77%. Theo Williams và Lawrence(2005) sử dụng mật độ vi khuẩn E. ictaluri R4383WT tăng dần 5,2 x 103 cfu/mL; 5,2x104 cfu/mL và 5,2x 105 cfu/mL tiêm trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus giống, trongkhoảng nhiệt độ nước 26oC cũng gây chết cá với tỷ lệ lần lượt là 67,2%, 100% và 100%.9  Trong khi đó E. ictaluri WT tiêm với mật độ 5,7 x 103 cfu/mL; 5,7 x 104 cfu/mL; 5,7 x105 cfu/mL; 5,7 x 106 cfu/mL gây chết cá với tỷ lệ là tăng dần từ 63,5% đến 100%.2.4.2 Phương pháp ngâmTheo Nguyễn Hữu Thịnh (2008), phương pháp ngâm là phương pháp gây bệnhbằng cách cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá thông qua mang, mũi, đường bên.Phương pháp này tiến hành bằng cách ngâm cá trong một thể tích nước cố định có phavi khuẩn trong một khoảng thời gian xác định.Cùng với phương pháp tiêm, phương pháp ngâm cũng là một phương phápđược áp dụng rất phổ biến trong các thí nghiệm gây cảm nhiễm nhân tạo với đối tượngcá da trơn. Theo Mai Trâm (2008), khi tiến hành ngâm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra ởcác mật độ 5,5 × 102 cfu/mL; 5,5 × 103 cfu/mL; 5,5 × 104 cfu/mL; 5,5 × 105 cfu/mL, cátra thí nghiệm bắt đầu chết sau 6 ngày với các tỷ lệ chết tương ứng là 1,35%, 2,75%,12,6%, 66,9%. Theo Williams và Lawrence (2005) sử dụng E. ictaluri R4383 WT và E.ictaluri R4383 HM với mật độ 7 x 107 cfu/mL và 7,2 x 107 cfu/mL ngâm trên cá da trơnMỹ, kết quả cho thấy tỷ lệ cá chết lần lượt là 85% và 90%.2.4.3 Phương pháp nuôi chungLà phương pháp gây bệnh bằng cách nuôi chung cá thí nghiệm với cá đã nhiễmbệnh từ trước. Trong quá trình nuôi, cá thí nghiệm sẽ bị lây nhiễm từ cá bệnh thông quatiếp xúc và môi trường nước. Hiện nay phương pháp này vẫn chưa được sử dụng nhiềutrong các thí nghiệm gây cảm nhiễm với đối tượng cá tra.2.4.4 Phương pháp đường tiêu hóaLà phương pháp gây bệnh bằng cách cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá thínghiệm qua con đường tiêu hóa. Theo phương pháp này, vi khuẩn sẽ được trộn với thứcăn rồi đưa vào ống tiêu hóa của cá bằng dụng cụ chuyên biệt. Cũng như phương phápnuôi chung, hiện nay vẫn chưa có nhiều những nghiên cứu về việc áp dụng phương phápnày trên đối tượng cá tra.10  2.5 Sơ Lược Về LD502.5.1 Định nghĩaLD50 ( Lethal dose 50%) là kí hiệu liều chết một nửa, nghĩa là lượng thuốc cầnthiết để gây chết 50% cá thể thí nghiệm, được tính bằng mg hoạt chất/kg trọng lượngcơ thể. Người ta thường chia làm ba nhóm:Loại thuốc có độ độc mạnh khi LD50 = 100 mg/kg thể trọng.Loại thuốc có độ độc trung bình khi LD50 = 100 đến 300 mg/kg thể trọng.Loại thuốc ít độc khi có LD50 trên 300 mg/kg thể trọng.Như vậy, độ độc càng cao thì trị số LD50 càng nhỏ.Trong trường hợp khi tiến hành gây bệnh thực nghiệm trên cá bằng vi khuẩn,LD50 được hiểu là lượng vi khuẩn cần thiết để gây chết 50% số cá thí nghiệm, đượctính bằng CFU/ đơn vị trọng lượng cá.2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến LD50Mỗi loại thuốc khác nhau thì có trị số LD50 khác nhau.Liều LD50 giữa các sinh vật khác nhau cũng khác nhau và cũng có thể khácnhau giữa cá thể đực và cá thể cái.Liều LD50 của thuốc đối với cơ thể còn phụ thuộc vào cách thức xâm nhập củathuốc vào cơ thể. Cùng một loại thuốc với cùng một cơ thể, khi xâm nhập qua miệngvào đường ruột tác động có thể khác xâm nhập qua da, vì vậy liều LD50 qua miệng cũngcó thể khác liều LD50 qua da.2.5.3 Phương pháp xác định LD50 theo Reed và Muench (1938)Là phương pháp thường được sử dụng tính toán trong các thí nghiệm để chuẩnđộ virus, vi khuẩn bảo hộ 50% động vật thí nghiệm và liều gây chết 50% động vật thínghiệm.11  Trên thực tế thường khó tìm ra độ pha loãng của canh trùng với liều gây chết50% động vật thí nghiệm, do đó phải tìm giữa hai nồng độ pha loãng để có tỷ lệ gây chết50%.Độ pha loãng của canh trùng thường pha loãng gấp 10 lần: 10-1,…, 10-9, 10-10.* Cách tính LD50Tính số cá thể chết và sống trong mỗi nhóm thí nghiệm, sau đó cộng dồn từthấp đến cao.Tính tỷ lệ chết trên tổng của cột chết và cột sống cộng dồn.Tính khoảng cách tương ứng giữa hai độ pha loãng có tỷ lệ chết cao hơn vàthấp hơn 50% gần nhất.pd = (> 50% - 50%)/(> 50% - < 50%)LD50 = pd x (độ pha loãng thấp hơn 50% - độ pha loãng) + độ pha loãng cao hơn 50%.Hoặc log LD50 = [log (> 50%)] + [log (10-1) x pd] = y →LD50 = 10y.2.5.4 Một số nghiên cứu về LD50 của E. ictaluriTheo Mai Trâm (2008), khi gây cảm nhiễm bằng cách ngâm cá tra với các mậtđộ vi khuẩn E. ictaluri là 5,5 × 102 cfu/mL; 5,5 × 103 cfu/mL; 5,5 × 104 cfu/mL; 5,5 ×105 cfu/mL, sau 14 ngày theo dõi tính được LD50 là 2,34 × 105 cfu/mL (theo Reed –Muench) và 3,09 × 105 cfu/mL (theo phương trình tương quan hồi quy tuyến tính). Khigây cảm nhiễm bằng cách tiêm cá tra với các mật độ vi khuẩn E. ictaluri là 5,5 × 103cfu/mL; 5,5 × 104 cfu/mL; 5,5 × 105 cfu/mL; 5,5 × 106 cfu/mL, sau 14 ngày theo dõitính được LD50 là 2,13 × 104 cfu/mL (theo Reed – Muench) và 1,86 × 104 cfu/mL (theophương trình tương quan hồi quy tuyến tính).Hảo và Thắng (2008), đã tiến hành gây cảm nhiễm cá tra có trọng lượngkhoảng 30 g bằng phương pháp tiêm E. ictaluri, trong thí nghiệm cá tại các nghiệm thứcđược tiêm 0,2 mL vi khuẩn E. ictaluri với những nồng độ khác nhau. Kết quả sau cùngcủa thí nghiệm cho phép xác định được liều LD50 là 2,5 × 104 cfu/mL.12  Theo Plumb và ctv. (1987), khi tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluritrên cá nheo Châu Âu (Silurus glanis) và cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) bằng phươngpháp tiêm, sau 15 ngày theo dõi đã tính được LD50 của 2 loài trên lần lượt là 5,4 × 106cfu/mL và 7,1 × 104 cfu/mL.Theo Groff và ctv. (1990), khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên cá hồiBắc Mỹ ở các mật độ vi khuẩn tương ứng là 4 × 106 cfu/mL, 4 × 107 cfu/mL, 4 × 108cfu/mL, sau thí nghiệm tính được LD50 là 3,4 × 107 cfu/mL.13  

Tài liệu liên quan

• Xác định đồng thời Ni,Co,Pd trong bản mạch điện tử bằng phương pháp trắc quang với thuốc thử PAN sử dụng thuật toán hồi quy đa biến
  • 108
  • 865
  • 2
• Luận văn xác định týp o virus lở mồm long móng ở việt nam bằng phương pháp RT PCR
  • 88
  • 684
  • 1
• Xác định kẽm, cađimi trong tỏi và thuốc chế biến từ tỏi bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử
  • 45
  • 653
  • 0
• Xác định kẽm, cađimi trong tỏi và thuốc chế biến từ tỏi bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử
  • 46
  • 772
  • 1
• Luận văn xác định khả năng kết hợp của một số dòng ngô nếp bằng phương pháp lai đỉnh
  • 101
  • 504
  • 0
• Xác định khả năng kết hợp của một số dòng ngô rau bằng phương pháp lai luân giao
  • 103
  • 525
  • 0
• Sử dụng yếu tố động học để xác định lượng vết kim loại cu và hg trong hỗn hợp bằng phương pháp chiết trắc quang
  • 39
  • 792
  • 4
• xác định đặc điểm sinh hóa và khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh mủ gan edwardsiella ictaluri trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở một số tỉnh đồng bằng sông cửu
  • 51
  • 1
  • 2
• Tài liệu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH MỦ GAN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI THÂM CANH Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG" ppt
  • 51
  • 851
  • 0
• XÁC ĐỊNH NHÓM KÝ SINH TRÙNG TẠO BÀO NANG TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) pptx
  • 10
  • 432
  • 2

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(1.44 MB - 92 trang) - XÁC ĐỊNH LD50 (LETHAL DOSE 50%) CỦA Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY NHIỄM QUA ĐƯỜNG TIÊU HÓA Tải bản đầy đủ ngay ×