Xác định Một Số đặc điểm Vi Sinh Của Escherichia Coli Sinh Beta ...

Xác định một số đặc điểm vi sinh của Escherichia coli sinh beta lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại cộng đồng huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình, năm 2016.Thuốc kháng sinh được coi là một giải pháp cho loài ngƣời trong phòng và điều trị bệnh do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, trong những năm gần đây vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh ngày càng nghiêm trọng và sự lan truyền các vi khuẩn kháng kháng sinh đang trở thành mối đe dọa lớn cho sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới.

Có nhiều cơ chế kháng kháng sinh, trong đó cơ chế ức chế bằng enzyme β-lactamase phổ mở rộng, hay còn đƣợc gọi là ESBL (Extended – Spectrum Beta -Lactamase) là cơ chế thƣờng gặp. ESBL là các enzyme do vi khuẩn sinh ra, chúng có khả năng làm bất hoạt các thuốc nhóm β-lactam bằng cách phá hủy nối amide của vòng β-lactam vì vậy các vi khuẩn có enzyme này kháng lại các kháng sinh nhóm β-lactam rất hiệu quả. ESBL thƣờng đƣợc tìm thấy trong các nhóm Enterobacteriaceae, thƣờng gặp ở Escherichia coli (E. coli) [32, 101]. E. coli là vi khuẩn sống cộng sinh trong đƣờng tiêu hóa, nhƣng nó cũng là một trong những tác nhân gây bệnh khá phổ biến ở ngƣời. Trên nhiều chủng E. coli sinh ESBL, các plasmid không chỉ mang gen mã hóa sinh ESBL mà còn kèm các gen kháng kháng sinh khác, vì vậy các vi khuẩn này có thể kháng đồng thời nhiều loại kháng sinh [32]. Mặt khác, các chủng E. coli mang gen mã hóa sinh ESBL còn có khả năng truyền các gen kháng kháng sinh cho các vi khuẩn khác trong cùng loài hoặc cho các loài vi khuẩn gây bệnh khác nhƣ: Salmonella, Shigella… làm gia tăng tình trạng kháng kháng sinh trong cộng đồng và gây ra những khó khăn trong điều trị lâm sàng [32, 101]. Trên thế giới, tỷ lệ nhiễm E. coli sinh ESBL chiếm tỷ lệ từ 5% đến 62%. Tỷ lệ này cao ở khu vực châu Á, đặc biệt là các nƣớc khu vực Nam Á và Trung Quốc (trên 50%) ở cả bệnh viện và cộng đồng [61, 92].2 Tại Việt Nam, tỉ lệ nhiễm E. coli sinh ESBL là tƣơng đối cao: 18% đến 57,3 % trong bệnh viện [61, 92]. Hầu hết các nghiên cứu có liên quan đến E. coli sinh ESBL chủ yếu là trên các bệnh phẩm của bệnh nhân tại bệnh viện, rất ít các nghiên cứu đƣợc thực hiện trên ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng. Đặc biệt những thông tin về đặc điểm vi sinh y học của vi khuẩn E. coli sinh ESBL tại cộng đồng hầu nhƣ chƣa đƣợc thông báo. Vì vậy cần thiết có những nghiên cứu trên ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng nhằm đánh giá thực trạng nhiễm, đặc điểm vi sinh học của vi khuẩn E. coli sinh ESBL tại cộng đồng, góp phần đƣa ra bức tranh tổng thể về dịch tễ học của vi khuẩn E. coli tại cộng đồng, cung cấp cơ sở khoa học cho việc thiết lập hệ thống giám sát, phòng ngừa sự lây nhiễm và lan truyền vi khuẩn kháng kháng sinh tại cộng đồng. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài ―Xác định một số đặc điểm vi sinh của Escherichia coli sinh beta lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại cộng đồng huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình, năm 2016‖ với các mục tiêu sau: 1. Xác định sự lưu hành của Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại cộng đồng, huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình, năm 2016. 2. Xác định một số đặc điểm sinh học của các chủng Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng phân lập được từ người khỏe mạnh tại cộng đồng

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ……………………………………………………………………………………………………i LỜI CAM ĐOAN………………………………………………………………………………………………ii MỤC LỤC ……………………………………………………………………………………………………….iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………………………….vi DANH MỤC CÁC BẢNG ………………………………………………………………………………..ix DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………………………………………………xii ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………………………………………..1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………………………………..3 1.1. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ở ngƣời…………………………………………………………………………………………………..3 1.1.1. Tình hình nhiễm E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ở ngƣời ……………..3 1.1.2. Tình hình kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL trên ngƣời ……………….9 1.2. Một số đặc điểm và phƣơng pháp nghiên cứu E. coli sinh ESBL ………………..17 1.2.1. Đặc điểm sinh học…………………………………………………………………………….17 1.2.2. Đặc điểm và sự lƣu hành các ESBL và các gen mã hóa sinh ESBL……….18 1.2.3. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài (phylogenetic group)…………………….23 1.2.4. Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn E. coli trên ngƣời ……………………………..24 1.2.5. Khả năng lan truyền vi khuẩn E. coli sinh ESBL …………………………………27 1.2.6. Các phƣơng pháp nghiên cứu E. coli sinh ESBL………………………………….28 Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………………………..37 2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu …………………………………………….37 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu …………………………………………………………………………37 2.1.2. Thời gian nghiên cứu ………………………………………………………………………..39 2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu ……………………………………………………………………….39 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………………………………39 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu…………………………………………………………………………..39 2.2.2. Phƣơng pháp chọn mẫu và tính cỡ mẫu ………………………………………………39 2.3. Các biến số và chỉ số nghiên cứu ……………………………………………………………..41iv 2.4. Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………………………………………42 2.5. Các kỹ thuật áp dụng trong nghiên cứu …………………………………………………….45 2.5.1. Kỹ thuật lấy mẫu phân ………………………………………………………………………47 2.5.2. Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập E. coli từ mẫu phân ………………………………….48 2.5.3. Kỹ thuật định danh vi khuẩn E. coli ……………………………………………………49 2.5.4. Kỹ thuật xác định kiểu hình ESBL của các chủng E. coli……………………..50 2.5.5. Kỹ thuật xác định đặc điểm kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL ……52 2.5.6. Kỹ thuật xác định gen mã hóa sinh ESBL của E. coli sinh ESBL ………….54 2.5.7. Kỹ thuật xác định gen mcr-1 kháng colistin của E. coli sinh ESBL ……….55 2.5.8. Kỹ thuật xác định đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E. coli sinh ESBL…………………………………………………………………………………………………56 2.5.9. Kỹ thuật xác định gen độc lực của vi khuẩn E. coli sinh ESBL……………..58 2.5.10. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE …………………………..59 2.5.11. Kỹ thuật xác định các loại plasmid của các chủng E. coli sinh ESBL…..61 2.5.12. Xác định vị trí các gen mã hóa sinh ESBL bằng phƣơng pháp Southern Blot…………………………………………………………………………………………………………..63 2.5.13. Đánh giá khả năng truyền các gen mã hóa sinh ESBL của các chủng E. coli sinh ESBL trong mô hình phòng thí nghiệm bằng phƣơng pháp tiếp hợp66 2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu……………………………………………………………………….68 2.7. Biện pháp khống chế sai số ……………………………………………………………………..68 2.8. Đạo đức nghiên cứu………………………………………………………………………………..69 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………………………….70 3.1. Sự lƣu hành của vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong mẫu phân ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn tỉnh Thái Bình…………………………………………………………..70 3.1.1. Đặc điểm của đối tƣợng xét nghiệm……………………………………………………70 3.1.2. Sự lƣu hành của của vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong mẫu phân ngƣời khỏe mạnh…………………………………………………………………………………………………72 3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng E. coli sinh ESBL………………………………….76 3.2.1. Đặc điểm sinh vật, hóa học của các chủng E. coli sinh ESBL ……………….76 3.2.2. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli sinh ESBL………………77v 3.2.3. Đặc điểm các gen mã hóa sinh ESBL ở các chủng E. coli sinh ESBL ……79 3.2.4. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E. coli sinh ESBL …..84 3.2.5. Đặc điểm các gen độc lực trong các chủng E. coli sinh ESBL ………………86 3.2.6. Mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. coli sinh ESBL ……………………….88 3.2.7. Phân tích đặc điểm plasmid của các chủng E. coli sinh ESBL ………………91 Chƣơng 4: BÀN LUẬN………………………………………………………………………………….100 4.1. Sự lƣu hành của vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong mẫu phân ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn tỉnh Thái Bình…………………………………………………………100 4.1.1. Đặc điểm của đối tƣợng xét nghiệm………………………………………………….100 4.1.2. Sự lƣu hành của E. coli sinh ESBL trong mẫu phân ngƣời khỏe mạnh…101 4.2. Đặc điểm sinh học của các chủng E. coli sinh ESBL………………………………..104 4.2.1. Đặc điểm sinh vật, hóa học của các chủng E. coli sinh ESBL ……………..104 4.2.2. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli sinh ESBL…………….104 4.2.3. Đặc điểm các gen mã hóa sinh ESBL ở các chủng E. coli sinh ESBL ….108 4.2.4. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E. coli sinh ESBL …111 4.2.5. Đặc điểm các gen độc lực của các chủng E. coli sinh ESBL ……………….112 4.2.6. Mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. coli sinh ESBL ……………………..114 4.2.7. Phân tích đặc điểm plasmid của các chủng E. coli sinh ESBL …………….117 4.3. Hạn chế và hƣớng nghiên cứu tiếp theo…………………………………………………..123 KẾT LUẬN …………………………………………………………………………………………………..124 KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………………………………………..126 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ……………………………………………………………………………………………..127 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Tỷ lệ (%) các chủng E. coli kháng cephalosporins thế hệ 3 ở các nƣớc châu Âu, 2012 …………………………………………………………………………………………….14 Hình 2.1.Bản đồ hành chính tỉnh Thái Bình …………………………………………………….38 Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt phƣơng pháp thu thập thông tin nghiên cứu…………………..47 Hình 2.3. Cách cấy mẫu phân trên môi trƣờng MacConkey ………………………………48 Hình 2.4. Cách cấy khuẩn lạc trên TSI, CLIG, LIM …………………………………………49 Hình 2.5. Hình ảnh minh họa kỹ thuật Southern Blot………………………………………..66 Hình 3.1. Hình ảnh điện di các gen nhóm blaCTX, blaTEM và blaSHV………………81 Hình 3.2. Hình ảnh điện di các gen xác định nhóm phát sinh loài ………………………84 Hình 3.3. Cây phả hệ thể hiện mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. coli sinh ESBL phân lập đƣợc …………………………………………………………………………………….90 Hình 3.4. Hình ảnh đại diện PFGE về mối liên hệ giữa các chủng E. coli sinh ESBL phân lập đƣợc trong nghiên cứu……………………………………………………………………..91 Hình 3.5. Kết quả đại diện lai Southern Blot ……………………………………………………96 Hình 3.6. Kết quả đại diện truyền plasmid mang các gen mã hóa sinh ESBL từ chủng vi khuẩn E. coli sinh ESBL sang chủng E. coli J53…………………………………97