Xét Nghiệm AFB Bằng Kỹ Thuật Nhuộm Ziehl - Neelsen ( AFB

Mục tiêu

1. Chuẩn bị được thuốc nhuộm và dụng cụ tiến hành nhuộm Ziehl-Neelsen.
2. Thực hiện được các bước nhuộm Ziehl-Neelsen từ bệnh phẩm đờm.
3. Phát hiện được AFB từ tiêu bản nhuộm.
4. Đánh giá được sáu tiêu chuẩn chất lượng tiêu bản.

1. Lấy và vận chuyển bệnh phẩm đờm

1.1. Lấy bệnh phẩm

• Tốt nhất lấy 3 mẫu:

+ Mẫu I: Lần đầu đến khám.

+ Mẫu II: Lấy vào buổi sáng dậy (tốt nhất).

+ Mẫu III: Lấy tại chỗ bác sĩ.

• Lấy bệnh phẩm ngoài trời thông thoáng, nơi ít người, không nên tập trung vào 1 chỗ.
• Bệnh phẩm được lấy vào hộp nhựa sạch, có nắp xoáy, trong, có nhãn. Bệnh phẩm là đờm, không phải nước bọt hay nước mũi.

1.2. Vận chuyển bệnh phẩm

• Bệnh phẩm phải chuyển ngay tới phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt theo quy trình an toàn.
• Không để bệnh phẩm trong môi trường nhiệt độ quá cao khi vận chuyển.

2. Quy trình dàn tiêu bản

2.1. Ghi số tiêu bản

• Sử dụng lam kính mới, sạch có đầu mờ.
• Bút chì HB.
• Số thứ tự (được đánh từ đầu năm) vào đầu mờ của lam kính.
• Số xét nghiệm phải đồng nhất giữa sổ xét nghiệm, phiếu xét nghiệm, cốc đờm và lam kính.

2.2. Dàn tiêu bản

• Thực hiện nơi thông khí tốt hoặc trong tủ an toàn sinh học:

+ Que phết bằng tre, gỗ chẻ nhỏ, đầu vát, sạch, khô. Mỗi bệnh phẩm dùng que phết riêng.

+ Chọn lấy chỗ đờm nhày mủ, đặt lên giữa lam kính dàn trải theo vòng xoáy từ trong ra ngoài, dàn đều đặn liên tục tạo độ mịn dày vừa phải hình ô van kích thước dài 2cm rộng 1cm.

+ Dàn xong ngâm que vào dung dịch sát khuẩn (phenol 5% hoặc javen 0,5%).

+ Chỉ huỷ lọ đờm sau khi đã trả kết quả xét nghiệm.

• Tiêu bản đạt tiêu chuẩn:

+ Dàn từ phần đờm nhày mủ.

+ Dàn đều đặn, liên tục, mịn.

+ Kích thước 1 cm x 2 cm.

+ Vết dàn cân đối ở giữa lam.

+ Độ dày vừa phải.

+ Để khô tự nhiên trước khi cố định.

2.3. Làm khô tiêu bản

• Để tiêu bản khô tự nhiên, hoàn toàn ở nhiệt độ phòng (15-30 phút).
• Không làm khô tiêu bản bằng đèn cồn hoặc ánh nắng mặt trời.

2.4. Cố định tiêu bản (Thực hiện ở ngoài tủ an toàn sinh học)

• Cố định bằng cách hơ nóng tiêu bản qua ngọn lửa đèn cồn 3 lần, mỗi lần 3 giây.
• Không cố định khi tiêu bản chưa khô hoàn toàn.

3. Quy trình nhuộm Ziehl – Neelsen

3.1. Chuẩn bị hóa chất nhuộm 

3.1.1. Dung dịch fucshin 0,3%

• Fucshin basic 3g
• Phenol 50g
• Cồn 95° 100ml
• Nước cất vừa đủ 1000ml
• Cách pha: cho 50g phenol vào bình cầu hoặc bình nón.
• Đổ 100ml cồn, lắc tan.
• Thêm 3g fucshin basic, trộn đều.
• Cho nước cất vừa đủ 1000 ml, lắc đều.
• Lọc fucshin qua giấy lọc.
• Kiểm tra chất lượng hoá chất bằng tiêu bản dương tính và âm tính trước khi sử dụng.

3.1.2. Dung dịch cồn tẩy HCL 3%

• HCL 30ml
• Cồn ethylic 95° 970ml

Rót từ từ HCL vào cồn trách gây nổ, vỡ do sinh nhiệt (không được làm ngược lại).

3.1.3. Dung dịch Methylen 0,3%

• Xanh methylen                  3g
• Nước cất                      1000ml

Hoà 1000ml nước cất với 3g xanh methylen lắc đều.

Tâí cả các hoá chất trên chứa trong chai thuỷ tinh màu, có nhãn ghi tên hoá chất, nồng độ và ngày pha. Hoá chất được lưu giữ trong tủ khô ráo tránh ánh sáng mặt trời. Hạn sử dụng 1 tháng.

3.2. Các bước nhuộm

3.2.1. Nhuộm màu

• Phủ đầy dung dịch fucshin 0,3% lên mặt phết tiêu bản đã được cố định.
• Hơ nóng bằng cồn đến khi bốc hơi (không được sôi) 1 lần.
• Để nguội 5 phút.
• Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.

3.2.2. Tẩy màu

• Phủ đầy dung dịch cồn tẩy HCL 3%.
• Để 3 phút.
• Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.
• Tẩy lại lần 2 (1-3 phút) nếu tiêu bản còn màu hồng.

3.2.3.Nhuộm nền

• Phủ dung dịch xanh methylen 0,3% trong 1 phút.
• Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.
• Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng hoặc ở trên máy sấy lam.

Lưu ý: mỗi mẻ nhuộm không nên quá 12 tiêu bản, các tiêu bản đế cách nhau ít nhất 1 cm.

4. Đọc và nhận định kết quả

Vi khuẩn lao là trực khuẩn hình que, mảnh, hơi cong, bắt màu đỏ fucshin, đứng riêng lẻ, từng đôi hoặc thành từng đám trên nền xanh. Đếm số lượng AFB và ghi kết quả như bảng 1.

Bảng 1. Quy định đọc kết quả Số lượng AFB Kết quả Phân loại > 10 AFB/1 vi trường Dương tính (Soi ít nhất 20 vi trường) 3+ 1-10 AFB/ 1 vi trường Dương tính (Soi ít nhất 50 vi trường) 2+ 10-99 AFB/100 vi trường Dương tính 1+ 1-9 AFB/ 100 vi trường Dương tính Ghi số lượng cụ thể Không AFB/ 100 vi trường Âm tính Lưu ý: 1 dòng lam tương đương 100 vi trường. Soi ít nhât 3 dòng.

5. Sáu tiêu chuẩn đánh gỉá tiêu bản

5.1. Chất lượng bệnh phẩm

• Quan sát: tốt nhất là bệnh phẩm có nhày mủ, không có nước bọt, không có máu.
• Soi kính:

+ Có > 25 bạch cầu đa nhân/1 vi trường (soi vật kính 10X).

+ Có > 3-4 bạch cầu đa nhân/1 vi trường (soi vật kính 100X).

+ Hoặc có đại thực bào.

5.2. Kích cỡ

• Hình ovan nằm giữa lam kính
• Chiều rộng lcm, chiều dài 2cm

5.3.Độ mịn

• Bề mặt tiêu bản liên tục, đều đặn, không bị rỗng, bong.
• Soi kính: Các vi trường liên tục không có nhiều vi trường rỗng độ sáng đều.

5.4. Độ dày

• Độ dày tiêu bản khoảng 0,04mm. Kiểm tra bằng cách khi tiêu bản khô chưa nhuộm để 1 tờ giấy có in chữ xuống dưới tiêu bản cách 4-5 cm. Nếu nhìn thấy chữ mờ có thể đọc được là đạt, nếu không đọc được chữ là quá dày, nhìn chữ rõ là mỏng.
• Soi thấu chiều sâu của tiêu bản (vi trường màu xanh sáng).
• Nếu tiêu bản quá dày: Nhiều lớp, soi không thấu vi trường (vi trường màu xanh tối).
• Nếu tiêu bản quá mỏng: các vi trường thưa thớt (nền xanh nhạt).

5.5. Nhuộm và tẩy

• Tiêu bản nhìn bằng mắt thường còn màu đỏ là chưa đạt
• Soi kính:

+ AFB bắt màu đỏ rõ ràng trên nền màu xanh

+ AFB nhạt màu có thể do tẩy quá hoặc nhuộm chưa đủ (thời gian, sức nóng).

+ Nếu AFB tối màu có thể do nhuộm nền quá lâu

5.6. Độ sạch

• Soi không thấy cặn bẩn, cặn fucshin, tinh thể… do thuốc nhuộm để lâu hoặc hơ nóng quá lâu.

6. Hủy bỏ dụng cụ nhiễm khuẩn

Mẫu đờm, que phết đờm là nguồn lây nhiễm tiềm tàng nên sau khi xét nghiệm phải được huỷ bỏ theo đúng quy trình, tránh nguy cơ lây nhiễm.

Các dụng cụ khác như giá để lam, mặt bàn làm việc phải được khử bằng dung dịch sát khuẩn. Dung dịch sát khuẩn đã được chứng minh bằng thực nghiệm diệt được vi khuẩn lao là dung dịch phenol 5%, nước javen 0,5%.

Bảng kiểm cho kỹ thuật nhuộm Ziehl – Neelsen TT Các bước tiến hành kỹ thuật Có Không 1. Chuẩn bị thuốc nhuộm: đỏ fucshin 0,3%, cồn tẩy HCL 3%, xanh methylen 0.3%. Dụng cụ: lam kính, đèn cồn, diêm, que gỗ, bút chì HB, vòi nước chảy nhẹ, bình đựng chất thải bỏ, đồng hồ bấm giây. 2. Đánh đấu lam kính: ghi số xét nghiệm thống nhất từ sổ xét nghiệm,phiếu xét nghiệm, cốc đờm và đầu mờ của lam kính. 3. Phết bệnh phẩm và để khô: – Bệnh phẩm dàn đều hình oval đường kính 1 cm x 2 cm. 4. Cố định bệnh phẩm: – cắt ngang qua ngọn lửa đèn cồn 3 giây. 5. Phủ đỏ fucshin kín mặt lam. Hơ nóng phía dưới lam cho fucshin 0.3% bốc hơi (1 lần), không sôi. Để 5 phút. 6. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ. 7. Phủ dung dịch cồn tẩy HCL 0,3%.Để 3 phút. 8. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ. 9. Phủ dung dịch xanh methylen 0.3%. Để 1 phút. 10. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ. 11. Rửa tiêu bản. Xếp vào giá. 12. Sấy khô. 13. Đem soi vật kính dầu và cất vào hộp lam.