Xét Nghiệm Vi Sinh - Sinh Học Phân Tử - Di Truyền Tại Bệnh Viện Nhi ...

Sinh học phân tử (molecular biology) là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật hay các hiện tượng sinh vật ở mức độ phân tử. Ta gặp các nội dung của sinh học phân tử trong nhiều môn khoa học thuộc lĩnh vực khoa học sự sống đặc biệt là di truyền học và sinh hóa học. Ngược lại, các nội dung của di truyền học và sinh hóa học cũng bao hàm nhiều kiến thức của sinh học phân tử. Chính vì vậy có thể cho rằng có sự giao thoa và mối liên hệ chặt chẽ giữa sinh học phân tử, di truyền học, sinh hóa học và nhiều môn khoa học khác.

Mục đích của sinh học phân tử là tìm hiểu mối tương tác giữa các hệ thống khác nhau trong tế bào bao gồm cả mối liên hệ và tương tác giữa các phân tử DNA, RNA, quá trình tổng hợp protein cũng như tìm hiểu cơ chế điều hòa những mối tương tác này. Kiến thức về các mối tương tác trong từng đối tượng tế bào, mô, cơ quan, hệ cơ quan, cơ thể v.v. giúp ta tìm hiểu sâu hơn về học thuyết trung tâm (central Dogma) trong di truyền học từ đó có những can thiệp thích hợp để đưa đến những ứng dụng trong y dược học, nông nghiệp, công nghiệp, bảo vệ môi sinh.v.v.

Sinh học phân tử cũng không chỉ giúp con người nghiên cứu hình thái của sinh vật ở mức độ tinh vi hơn mà còn nghiên cứu quá trình hình thành, phát triển (về số lượng và kích thước) của một tế bào, một cơ quan, một cá thể hay một loài cũng như nghiên cứu về chức năng của các quá trình đó.

Những phương pháp thường được áp dụng trong SHPT

Từ những năm giữa thê kỷ 19, các nhà nghiên cứu sinh học phân tử đã tìm cách tách các phân tử DNA, RNA cũng như protein và khuyếch đại (nhân dòng) những phân tử này.

PCR (polymerase chain reaction)

Trong các tài liệu tiếng Việt có nhiều cách dịch khác nhau như phản ứng khuyếch đại gene, phản ứng chuỗi trùng hợp v.v. Về bản chất, phản ứng này được thực hiện nhằm mục đích tạo nhiều bản sao từ một phân tử DNA khi có mặt của DNA-polymersase với quá trình biến nhiệt theo chu kỳ.

Trong cơ thể sinh vật, các phân tử DNA được nhân lên (quá trình tự sao) với sự có mặt của DNA- polymerase, các thành phần tạo chuỗi DNA (các bazơ nitơ). Để quá trình tự sao này diễn ra nhân tạo, ngoài DNA-polymerase và các bazơ nitơ, cần cung cấp các oligopeptide xác đinh điểm khởi đầu và điểm kết thúc của đoạn DNA cần tạo dòng (các primer, ta quen gọi là các đoạn mồi), dung dịch đệm (buffer) và đặc biệt là chu trình nhiệt (thermocycle). Sự biến đổi về nhiệt độ theo chu trình sẽ làm cho DNA biến tính (làm hai mạch DNA phân ly), bắt cặp của các bazơ nitơ của primer với các bazơ nitơ bổ sung trên mạch DNA và kéo dài mạch mới… Trình tự của primer và chu trình nhiệt được xác đinh phù hợp cho mỗi đoạn DNA cần nhân dòng.

Dựa trên nguyên tắc của PCR căn bản sử dụng các thermocycler (chúng ta hay gọi là các máy PCR) thông thường, các phương pháp PCR định lượng (quantitative PCR với các máy như Prism sequence detector, iCycler, Light Cycler) giúp xác định biểu hiện gene (gene expession ở mức RNA)…

Điện di trên gel

Là kỹ thuật dùng để tách các phân tử protein hay các đoạn DNA, RNA dựa trên sự khác nhau về khối lượng và điện tích của chúng. Vì mỗi phân tử protein hay nucleic acid đều mang điện tích nhất định nên nếu đặt chúng trong một điện trường chúng sẽ di chuyển. Các phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn. Quá trình điện di có thể được thực hiện trên giấy điện di hay gel (điện di trên gel, thường là agarose gel). Nhờ có chất nhuộm thích hợp mà có thể biết được vị trí của các phân tử trên giấy hoặc trên gel. Nếu có mẫu chuẩn với các phân tử đã biết trước kích thước ta có thể kiểm tra được kích thước của nucleic acid đã được tách trên gel.

Southern blotting

Trong kỹ thuật này, các đoạn DNA đã tách trên gel được “thấm” lên nitrocellulo filter để “lai” với các mẫu nucleic acid đã được đánh dấu. Từ kết quả “lai” có thể xác định và phân lập được doạn DNA mong muốn.

Northern blotting

Tương tự như Southern Blotting, kỹ thuật cho phép lai các đoạn RNA đã được tách trên gel với các mẫu đã được đánh dấu trong môi trường thích hợp để xác định các RNA mong muốn.

Western blotting

Sau khi các protein đã được tách trên gel, chúng được xác định bằng các kháng thể đã được biết trước.

Immunohistochemistry

Immunohistochemistry (hóa miễn dịch tổ chức) để xác định protein với sự có mặt của kháng thể.

Microarray

DNA microarray (gene chip, genome chip, DNA chip): Nguyên tắc chung của các phương pháp này cũng vẫn dựa trên phép “lai” DNA-DNA hay DNA-RNA giữa các mẫu DNA đã được đánh dấu gắn trên bề mặt cứng qua các liên kết hoá học. Phương pháp này cho kết quả định tính (sự biểu hiện của gene) hay định lượng (mức độ biểu hiện) và có thể thực hiện một lần với hàng ngàn gene.

Giải trinh tự gene

Hiện nay, giải trình tự đang là xu thế  phát triển và được ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như giải trình tự để định danh, định type vi khuẩn, virus, nhận dạng cá thể, nhận dạng loài, xác định đột biến gen, ứng dụng trong sản xuất vaccine, điều trị đích ung thư..

Xét nghiệm Vi sinh – Sinh học phân tử – Di truyền bệnh viện Nhi đồng Thành phố

Nhằm đáp ứng nhu cầu khoa lâm sàng trong việc điều trị, nghiên cứu chuyên sâu, Bệnh viện Nhi đồng Thành phố cũng được trang bị nhiều thiết bị hiện đại tại phòng xét nghiệm vi sinh – sinh học phân tử – di truyền với các hệ thống máy chuyên dụng như:

Hệ thống LightCycler® 480 là hệ thống real-time PCR định dạng đĩa có khả năng sử dụng linh hoạt cao cho các phân tích biểu hiện gen, định týp SNP và tầm soát đột biến thông qua phân tích đường cong nóng chảy. Thiết kế hệ thống hiện đại, cấu hình kỹ thuật ưu việt và phần mềm hoàn chỉnh giúp hệ thống LightCycler® 480 trở thành sự lựa chọn cho tốc độ cao và sự chính xác trong tất cả các ứng dụng real-time PCR hiện tại. Ứng dụng:

• Nghiên cứu biểu hiện gene
• Định lượng/ đếm tải lượng các căn nguyên vi sinh vật gây bệnh đường hô hấp, cúm A/B, tiêu chảy, enterovirus, EBV, CMV,..v.v…
• Phân tích đột biến gene, kiểu gene (genotyping) bằng kỹ thuật phân tích đường cong nóng chảy độ phân giải cao (HRM).
• Sàng lọc đột biến trong các đối tượng gene chỉ định điều trị bệnh về gen, vi sinh vật kháng thuốc v.v…

Máy giải trình tự gene, việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ của máy giải trình tự tự động. Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến. Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP. Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu. Các vạch điện di trong mao quản sẽ được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Hệ thống nhận diện tín hiệu màu sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G.

Ngoài ra còn có máy lai huỳnh quang tại chỗ (FISH), máy Microarray, Hệ thống kính hiển vi huỳnh quang và phần mềm bắt hình nhiễm sắc thể đồ và FISH.

KHỐI XÉT NGHIỆM BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG THÀNH PHỐ