Agarose Gel điện Di – Phần 3

Thủ tục chung Các chi tiết của thí nghiệm điện di gel agarose có thể khác nhau tùy thuộc vào phương pháp, nhưng hầu hết đều làm theo một quy trình chung. Đúc gel 

Loading mẫu DNA vào các giếng của gel agarose bằng pipette đa kênh. Gel được tạo ra bằng cách hòa tan bột agarose trong một bộ đệm thích hợp, như TAE hoặc TBE, để sử dụng trong quá trình điện di. Các agarose được phân tán trong bộ đệm trước khi làm nóng nó đến điểm gần sôi, nhưng tránh đun sôi. Các agarose nóng chảy được để nguội đủ trước khi đổ dung dịch vào khuôn đúc khi quạt có thể cong hoặc nứt nếu dung dịch agarose quá nóng. Một lược được đặt trong dàn để tạo giếng để lấy mẫu và gel phải được đặt hoàn toàn trước khi sử dụng.

Nồng độ gel ảnh hưởng đến độ phân giải DNA. Đối với điện di gel agarose tiêu chuẩn, 0,8% cho phép tách hoặc giải quyết tốt các mảnh ADN 5-10kb, trong khi 2% gel cho độ phân giải tốt cho các mảnh nhỏ 0,2-1kb. 1% gel thường được sử dụng cho điện di chuẩn. Nồng độ được đo bằng trọng lượng của agarose trên thể tích đệm sử dụng (g / ml). Thạch cao tỷ trọng thường giòn và có thể không đồng đều, trong khi tỷ lệ phần trăm thấp (0,1-0,2%) là mong manh và không dễ dàng để xử lý. Gel agarose nóng chảy thấp (LMP) cũng dễ vỡ hơn gel agarose thông thường. Agarose tan chảy điểm thấp có thể được sử dụng riêng hoặc đồng thời với agarose tiêu chuẩn để tách và cô lập DNA.  PFGE và FIGE thường được làm với tỷ lệ cao agarose gel.

Tải các mẫu  Một khi gel đã được thiết lập, lược sẽ được lấy đi, để lại các giếng có thể lấy mẫu DNA. Nạp đệm được trộn với mẫu DNA trước khi hỗn hợp được đưa vào giếng. Bộ đệm tải có chứa một hợp chất dày, có thể là glycerol, sucrose, hoặc Ficoll làm tăng mật độ mẫu để mẫu DNA có thể chìm xuống đáy giếng. Nếu mẫu DNA chứa dư ethanol sau khi pha chế, nó có thể trôi nổi ra khỏi giếng. Bộ đệm tải cũng bao gồm thuốc nhuộm màu như xylene xyanol và màu xanh bromophenol được sử dụng để theo dõi tiến trình điện di. Các mẫu DNA được nạp bằng pipet.

Điện di 

Agarose gel tấm trong bể điện di với các dải thuốc nhuộm cho thấy sự tiến bộ của điện di. DNA di chuyển theo hướng cực dương. Agarose gel điện di thường được thực hiện theo chiều ngang trong một chế độ tàu ngầm, theo đó các tấm gel là hoàn toàn ngập trong bộ đệm trong quá trình điện di. Cũng có thể, nhưng ít phổ biến hơn, để thực hiện điện di theo chiều dọc, cũng như theo chiều ngang với gel lên trên đôi agarose bằng cách sử dụng một thiết bị thích hợp . Bộ đệm được sử dụng trong gel cũng giống như bộ đệm đang chạy trong buồng điện di, đó là lý do tại sao điện di trong chế độ tàu ngầm có thể sử dụng gel agarose.

Để có độ phân giải tối ưu DNA có kích thước lớn hơn 2 kb trong điện di gel chuẩn thì nên dùng từ 5 đến 8 V / cm (khoảng cách tính bằng cm là khoảng cách giữa các điện cực, do đó điện áp đề nghị này sẽ là 5 đến 8 nhân với khoảng cách giữa các điện cực trong cm).  Điện áp cũng có thể bị hạn chế bởi thực tế là nó làm nóng gel và có thể làm cho gel tan chảy nếu nó được chạy ở điện áp cao trong một thời gian dài, đặc biệt là nếu gel được sử dụng là gel agarose LMP. Điện áp quá cao cũng có thể làm giảm độ phân giải, cũng như gây ra sự xâu chuỗi cho các phân tử ADN lớn. Điện áp quá thấp có thể dẫn đến việc mở rộng dải cho các đoạn DNA nhỏ do sự phân tán và khuếch tán. 

Vì ADN không nhìn thấy được trong ánh sáng tự nhiên nên sự tiến bộ của điện di được theo dõi bằng cách sử dụng thuốc nhuộm màu. Xylen xyanua (màu xanh nhạt) di cư các đoạn ADN lớn, trong khi màu xanh lam (màu xanh đậm) di chuyển với những mảnh nhỏ hơn. Thuốc nhuộm ít được sử dụng phổ biến hơn bao gồm Cresol Red và Orange G di chuyển trước màu xanh bromophenol. Một marker DNA cũng được chạy cùng nhau để ước lượng trọng lượng phân tử của các đoạn DNA. Tuy nhiên, lưu ý rằng kích thước của một vòng tròn DNA như plasmid không thể được đánh giá chính xác bằng cách sử dụng các tiêu chuẩn đánh dấu, trừ khi nó đã được tuyến tính hóa bằng tiêu hóa hạn chế, hoặc một dấu hiệu DNA supercoiled có thể được sử dụng.