Bản đồ RFLP 1. Nguyên Lí - Tài Liệu Text - 123doc

1. Trang chủ >
2. Khoa Học Tự Nhiên >
3. Sinh học >

Bản đồ RFLP 1. Nguyên lí

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.74 MB, 162 trang )

1. Tách ADN từ mô sống. 2.Sử dụng các enzyme cắt hạn chế để cắt ADN thành các đoạn có kích thước khác nhau.3. Điện di trên gel agarose.4. So sánh các đoạn ADN giữa các đối tượng nghiên cứu.4.1. Bản đồ RFLP 4.1.1. Nguyên líNguyên lí của kĩ thuật này dựa trên sự khác biệt tự nhiên của các chuỗi nucleotit trong phân tử ADN và khi phân tử ADN bị cắt thành nhiều đoạn nhỏbởi enzyme cắt hạn chế thì các đoạn ADN có thể khác nhau về kích thước hay chiều dài. Sự khác nhau này có thể được khai thác để phân tích sự phân li củacác đoạn nhiễm sắc thể khi lai tạo.Các phân tử ADN có kích thước nhỏ như ADN lục lạp có thể sử dụng enzyme RE giới hạn để lập bản đồ RFLP, tuy nhiên khả năng ứng dụng ADNlục lạp trong tạo giống rất hạn chế, vì hầu hết các gene có ý nghĩa kinh tế quan trọng lại nằm trong nhân. Phân tích RFLP có thể ứng dụng với ADN nhân,nhưng rất phức tạp vì ADN nhân có kích thước lớn và hàm lượng nhiều. Khi sử dụng RE đối với ADN thì hàng triệu phân đoạn ADN được tạo thành.4.1.2. Thư viện chỉ thị RFLP Người ta dùng những đoạn nhiễm sắc thể làm chỉ thị đánh dấu để nhậnbiết các phân đoạn cắt hạn chế. áp dụng phương pháp lai ADN - ADN có tính đặc hiệu cao bởi việc sử dụng các đoạn ADN mẫu để nhận biết các phân đoạnADN nhân từ hỗn hợp các đoạn ADN tạo thành bởi việc xử lí RE. Tập hợp các đoạn ADN mẫu đó được gọi là thư viện RFLP. Đoạn ADN mẫu có độ dài 2-5 kbở trạng thái tinh khiết và được sử dụng để lai phân tử. Các đoạn ADN tinh khiết người ta cần phải thực hiện kĩ thuật nhân gene gene cloning. Kĩ thuật nhânđoạn ADN có thể được hiện như sau: Đoạn ADN được gắn vào plasmit rồi biến nạp vào vi khuẩn. Vi khuẩn sinh sản dẫn đến đoạn ADN được nhân lên tạonhiều bản sao đoạn ADN. Bằng kĩ thuật nuôi cấy và phân lập plasmit từ vi khuẩn sẽ tạo ra một số lượng lớn các đoạn ADN dùng làm mẫu cho lai ADN.Quytrình xácđịnh RFLP được thực hiện theo các bước sau : 1 Tách chiết ADN nhân ; 2. Xử lí ADN với enzyme cắt giới hạn ; 3. điện di sản phâncắt bởi RE ; 4. Biến tính ADN thành dạng sợi đơn; 5. Chuyển lên màng lai nitrocellulose Southern blot để đoạn nADN mẫu lai với đoạn ADN tương đồngtheo nguyên tắc bổ sung giữa các cặp bazơ. Người ta sử dụng kĩ thuật phát quang hoá học Enhanced Chemical Luminesence = ECL hoặc đánh dấu phóngxạ để xác định kết quả lai bằng phim âm bản hoặc bằng phóng xạ tự ghi.884.1.3. Thiết lập bản đồ di truyền RFLP Người ta tiến hành lai hữu tính được F1 và cho F1 tự thụ cho F2. Khi F1giảm phân hình thành giao tử thì các nhiễm sắc thể có sự tái tổ hợp thông qua trao đổi chéo. Trao đổi chéo dẫn đến tái tổ hợp là cơ sở cho việc thiết lập bản đồdi truyền truyền thống bản đồ liên kết. Kĩ thuật RFLP cho phép quan sát trực tiếp các phân tử chỉ thị ADN trên đoạn nhiễm sắc thể. Các chỉ thị RFLP phân lihoàn toàn chính xác như các chỉ thị gene và tuân theo các định luật Menđen một cách nghiêm ngặt. Vì thế bản đồ RFLP được thiết lập theo nguyên tắc như đốivới các chỉ thị truyền thống. Quy trình thiết lập bản đồ di truyền bằng chỉ thị RFLP được thực hiện theo các bước sau:1Chọn cặp bố mẹ cùng loài xa nhau về mặt di truyền tạo F1. Tách ADN và sử dụng RE xử lí ADN. Sàng lọc tính đa dạng và cặp bố mẹ nào có mực độđa dạng thích hợp được chọn làm cặp lai. 2.Tạo quần thể lập bản đồ. Cho cặp bố mẹ lai với nhau được F1, cho F1 tự phối được F2 hoặc có thể lai ngược. Một quần thể F2 hoặc lai ngược có 50 cáthể thì có thể đủ xây dựng bản đồ di truyền chi tiết. 3.Đánh giá RFLP trong quần thể. Tách ADN từng cá thể và tiến hành kĩ thuật RFLP. Quá trình lập bản đồ được tiến hành theo 3 quá trình sau:- Sàng lọc RFLP: Mẫu được thử với cặp bố mẹ để phát hiện ra loạienzyme giới hạn thích hợp tạo ra sự đa dạng RFLP rõ rệt nhất giữa hai cá thể bố mẹ.- Chọn cặp chỉ thị 1enzyme: Chọn cặp chỉ thị enzyme thích hợp, đó là loại enzyme cắt ADN. Có thể tiến hành như sau: tách ADN ở cây bố, cây mẹ vàtừng cây con để lập bản đồ. Sử dụng từng loại enzyme cắt, điện di, thấm truyền lên màng lai mỗi enzyme dùng một bộ màng lai riêng, chọn cặp chỉ thịenzyme thể hiện sự đa dạng về kiểu gene sẽ dùng để lập bản đồ. -Đánh giá mức độ liên kết: Khi so sánh hai chỉ thị thu được hai kết quả, 1. Chúng có xu hướng cùng phân li và hai chỉ thị có mối liên kết. Ví dụ: F2 dịhợp về chỉ thị 1 và dị hợp về chỉ thị 2 trong khi bố mẹ đồng hợp về cả hai chỉ thị. 2. Sự phân bố tính đồng hợp hay dị hợp của hai chỉ thị là không theo quyluật mà hồn tồn ngẫu nhiên, như vậy chúng khơng liên kết. Sử dụng nhiều chỉ thị sẽ xác định được mức độ liên kết khác nhau của từng chỉ thị và nhóm chỉ thị.

4.2. Ứng dụng của RFLP

Xem Thêm

Tài liệu liên quan

• Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử
  • 162
  • 652
  • 6

Tải bản đầy đủ (.pdf) (162 trang)

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(2.74 MB) - Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử-162 (trang) Tải bản đầy đủ ngay ×