Các Xét Nghiệm đông Máu: Xét Nghiệm Yếu Tố Willebrand (P2) | BvNTP

PHẦN 4: XÉT NGHIỆM KHẢ NĂNG GẮN FVIII

VWD Type 2N giống haemophilia A hoặc người mang gene. Ở type 2N, FVIII giảm do giảm khả năng gắn của VWF với FVIII.

Trong hầu hết type 2N, đột biến tìm thấy ở exon 18-20 của gene VWF, mã hóa vị trí gắn FVIII, mặc dù đột biến ở các vùng khác gần đây cũng được báo cáo.

2 đột biến cùng xuất hiện mới đủ khả năng tạo ra kiểu hình ở bệnh nhân VWD type 2N. Rối loạn này gặp ở người đồng hợp tử hoặc dị hợp kép. Với những người đồng hợp tử, bố mẹ của họ thường là người mang gene.

Nhớ rằng trong type 2N, FVIII giảm là do khả năng gắn của VWF với FVIII bất thường, còn các chức năng khác vẫn bình thường, nên xét nghiệm miễn dịch cũng như chức năng của nó đều bình thường.

GIỚI THIỆU

VWD type 2N là bệnh lý di truyền lặn do đột biến vị trí gắn kết của VWF với FVIII, dẫn đến giảm khả năng gắn và vận chuyển FVIII trong huyết tương. Hậu quả là thời gian bán hủy của FVIII giảm đáng kể vì nó không còn được bảo vệ trước sự thoái giáng bởi các protease trong huyết tương. Bệnh nhân VWD type 2N thỉnh thoảng bị chẩn đoán nhầm với Haemophilia A.

Chẩn đoán type 2N cần có:

• Phân tích phả hệ (bệnh di truyền lặn)
• Đo đồng thời hoạt tính FVIII và VWF (FVIII giảm nhưng hoạt tính VWF bình thường)
• Nghiên cứu khả năng gắn FVIII
• Phân tích gene

NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP

Có một số phương pháp hiện có để đo khả năng gắn FVIII với VWF. Phương pháp ELISA thường được sử dụng:

• Một dĩa có 96 ô chuẩn được phủ bởi kháng thể kháng VWF người.
• Dĩa được ủ với mẫu huyết tương (cho phép kháng thể kháng VWF gắn kết phức hợp VWF-FVIII cố định lên dĩa)
• Dĩa được rửa, sau đó ủ với calcium chloride để loại bỏ FVIII đã gắn với VWF nội sinh trước đó (điều này để đảm bảo chỉ có VWF gắn trên dĩa)

Nồng độ chuẩn FVIII tái tổ hợp được thêm vào để gắn với VWF đã cố định ở tất cả mẫu.

Sau khi rửa lại, tiếp tục cho vào dĩa hoặc anti-VWF thỏ gắn peroxidase hoặc antihuman FVIII gắn peroxidase. Sau bước rửa cuối cùng, cơ chất tetramethylbenzidine dihydrochloride được thêm vào và sự tạo màu được ghi nhận như xét nghiệm VWF:Ag chuẩn.

Đường cong chuẩn được tạo ra bằng cách sử dụng hàng loạt huyết tương bình thường pool (thường >60 người)

Tại mỗi độ pha loãng, giá trị của yếu tố VIII tái tổ hợp được biểu diễn cùng với VWF được cố định. Giá trị VWF:FVIII được biểu diễn bằng phần trăm so với huyết tương bình thường.

PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

Những người với VWF bình thường sẽ cho thấy khả năng gắn FVIII bình thường ở bước 4, trong khi đó bệnh nhân type 2N sẽ cho thấy có rào cản trong việc gắn kết

ĐỀ NGHỊ XÉT NGHIỆM NÀO TIẾP?

Hầu hết bệnh nhân type 2N bị chẩn đoán nhầm với haemophilia A thể nhẹ. Bất kỳ bệnh nhân haemophilia A thể nhẹ nào cũng cần sàng lọc bệnh VWD type 2N. Một tình huống suy giảm kết hợp FV và FVIII cũng nên được xem xét ở bệnh nhân haemophilia A thể nhẹ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Gaucher C, Jorieux S, Mercier B, Oufkir D, Mazurier C. The "Normandy" variant of von Willebrand disease: characterization of a point mutation in the von Willebrand factor gene. Blood. 1991;77(9):1937-41.

Tuley EA, Gaucher C, Jorieux S, Worrall NK, Sadler JE, Mazurier C. Expression of von Willebrand factor "Normandy": an autosomal mutation that mimics hemophilia A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(14):6377-81.

Caron C, Mazurier C, Goudemand J. Large experience with a factor VIII binding assay of plasma von Willebrand factor using commercial reagents. Br J Haematol. 2002 Jun;117(3):716-8.

Miller CH, Kelley L, Green D. Diagnosis of von Willebrand disease type 2N: a simplified method for measurement of factor VIII binding to von Willebrand factor. Am J Hematol. 1998 Aug;58(4):311-8.

PHẦN 5: XÉT NGHIỆM HOẠT TÍNH COFACTOR CỦA RISTOCETIN (VWF:RCO)

Ristocetin là một kháng sinh, nhưng gây giảm tiểu cầu nên bị rút khỏi thị trường. Nó gây giảm tiểu cầu do kết dính tiểu cầu với nhau, nhưng chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của ristocetin. Ristocetin làm tăng sự gắn VWF vào phức hợp GpIb bằng cách thay đổi lực tĩnh điện giữa GpIb và VWF. Trong vi tuần hoàn, lực cắt cao (high shear) dẫn đến việc gắn VWF với tiểu cầu hơn là nhờ phân tử như ristocetin.

Kết quả của VWF:RCo nên được biểu diễn bằng đơn vị IU/dl dựa vào tiêu chuẩn của WHO Botrocetin là nọc độc được phân lập từ loài rắn Bothrops jararaca, sẽ làm thay đổi cấu dạng của VWF và tăng ái lực với GpIb. Xét nghiệm Botrocetin trong VWF cũng tương tự như ristocetin, tuy nhiên có một số bệnh nhân cho thấy hoạt tính 100% với botrocetin nhưng là 0% với ristocetin. Vì vậy chẩn đoán một số thể của VWD không thể loại trừ chỉ dựa vào xét nghiệm cofactor của botrocetin bình thường.

Kết dính tiểu cầu nhờ ristocetin (RIPA – Ristocetin induced platelet agglutination) được thực hiện trên huyết tương giàu tiểu cầu của bệnh nhân với nồng độ thấp ristocetin (khoảng 0.5µg/ml). Nồng độ thấp ristocetin này không thể gây ra việc gắn VWF và kết dính tiểu cầu trong mẫu từ người bình thường, nhưng sẽ xảy ra với bệnh nhân type 2B hoặc những đột biến trong receptor VWF của tiểu cầu (VWD type tiểu cầu hay bệnh giả Von Willebrand). Vì vậy, nó được dùng để sàng lọc type 2B.

VWF:CB ít có sự biến thiên giữa các xét nghiệm cũng như giữa các LABO nên tốt hơn trong việc phân biệt những VWF có/rối loạn chức năng hơn là VWF:RCo.

VWF:RCo là xét nghiệm định lượng, cho phép xác định số lượng VWF bất thường, vì sự tương tác giữa VWF và receptor GpIb trên màng tiểu cầu trong sự có mặt của ristocetin phụ thuộc vào VWF multimer. Tuy nhiên xét nghiệm này không thật sự là xét nghiệm “chức năng”, mà đúng hơn là xét nghiệm khả năng gắn của VWF với GpIb khi có mặt ristocetin (Lý do là tiểu cầu không phải của bệnh nhân)

Một số đa hình trong gene VWF cho thấy ảnh hưởng lên xét nghiệm VWF:RCo và điều này giải thích sự khác biệt của các chủng tộc trong đáp ứng với liều quan sát ở xét nghiêm VWF:RCo.

GIỚI THIỆU

VWF:RCo đo khả năng của huyết tương bệnh nhân tọa ra sự kết dính tiểu cầu khi có mặt kháng sinh ristocetin. Tỉ lệ kết dính tiểu cầu nhờ ristocetin tương quan với nồng độ cũng như hoạt tính chức năng của VWF huyết tương. Ristocetin được cho là gắn với VWF tại Glu1239-Pro-Gly Gly1242.

RIPA là test tương tự như VWF:RCo nhưng ở đây ristocetin được cho trực tiếp vào huyết tương giàu tiểu cầu của bệnh nhân và không cần pha loãng mẫu huyết tương.

Có một số phương pháp để đo VWF:RCo. Trước đây, tiểu cầu rửa được sử dụng, nhưng nay người ta dùng tiểu cầu formaldehyde hoặc tiểu cầu đông lạnh.

PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp kết dính tiểu cầu: Phương pháp này tương tự xét nghiệm yếu tố

Bước
1	Tiểu cầu rửa hoặc cố định được trộn với huyết tương bệnh nhân pha loãng (nghèo tiểu cầu)
2	Huyết tương bệnh nhân thường được pha loãng gấp đôi
3	Kết dính được cho phép diễn ra và độ dốc (hệ số góc) đường cong được ghi lại. Một đường cong chuẩn được thành lập bằng cách sử dụng phương pháp tương tự nhưng thay huyết tương bệnh nhân bằng một loạt độ pha loãng của huyết tương bình thường.
4	Độ dốc của đường cong được biểu diễn trên đồ thị log-log tại mỗi độ pha loãng và một đường thẳng được kẻ. Từ đó, hoạt tính cofactor của ristocetin được suy ra Nhớ rằng độ dốc (hệ số góc) được xác đinh bằng cách vẽ tiếp tuyến của đường cong, nó cắt trục hoành và trục tung, lấy khoảng cách trên trục tung chia cho trục hoành.
5	Nếu chúng ta tính độ dốc (S=Slope) của mỗi độ pha loãng huyết tương bình thường và biểu diễn trên đồ thị log-log thì sẽ được một đường thẳng. Dựa trên đường này, mức hoạt tính VWF:RCo được suy ra.
6	Trong mẫu huyết tương 1, gần như không có sự kết dính tiểu cầu nên VWF:RCo <1% Trong mẫu huyết tương 2, S=0,65 ta suy ra VWF:RCo khoảng 8.5%. Cuối cùng, do ta sử dùng cùng độ pha loãng với huyết tương chứng, nên không cần phải hiệu chỉnh theo độ pha loãng.
Có thể thay aggregometer bằng đọc dĩa ELISA hoặc microtitre nhưng nguyên lý vẫn vậy.

Xét nghiệm ELISA đánh giá khả năng gắn trực tiếp của VWF với GpIb tiểu cầu: trong xét nghiệm này, GpIb có thể từ 1 trong 2 nguồn:

• Mảnh GpIb tái tổ hợp: dùng dĩa ELISA phủ kháng thể kháng GpIb, cho GpIb tái tổ hợp vào, sau cho VWF (huyết tương chứng hoặc bệnh nhân) vào, và phát hiện VWF bằng kỹ thuật so màu tương như các xét nghiệm ELISA đã đề cập (dùng kháng thể anti-VWF gắn HRP, cho cơ chất tạo màu OPD, rồi so màu)
• Mảnh protein có thuật ngữ là “glycocalicin”, bao gồm phần ngoại bào của chuỗi α trong cấu trúc GpIb của tiểu cầu, nó có thể được tách khỏi tiểu cầu bằng việc sử dụng một số protease, điều thú vị là glycocalicin cũng tìm thấy trong huyết tương bình thường và có thể ly tâm để sử dụng trong xét nghiệm. Nguyên lý xét nghiệm tương tự như ở trên.

Flow cytometry: trong phương pháp này, một hỗn hợp tiểu cầu cố định formalin được gắn nhãn fluochrome màu đỏ và xanh, ủ với huyết tương test trong sự hiện diện ristocetin. Một phân tử VWF multimer có nhiều vị trí gắn GpIb tiểu cầu. Khi cả 2 tín hiệu tiểu cầu “đỏ” và “xanh” được gắn vào 1 phân tử VWF thì hiện tượng vi ngưng tập xảy ra. Mức độ vi ngưng tập, phản ánh qua hiện tượng “dương kép”, tương ứng với hoạt tính VWF:RCo. Sẽ không có hiện tượng dương kép nếu trọng lượng phân tử VWF multimer quá thấp để gắn ít nhất 2 tiểu cầu.

Xét nghiệm VWF: RCo dựa trên latex: dùng hạt latex phủ kháng thể đơn dòng để gắn chuỗi GpIbα, sau đó cho ngưng kết với VWF trong sự hiện diện của ristocetin. Tiến hành đo độ đục.

PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

Xét nghiệm VWF:RCo có sự biến thiên lớn trong mỗi LABO cũng như giữa các LABO, và nó không thật sự đo chức năng sinh lý của VWF. Mặc dù với những hạn chế đó, nó vẫn là test để đo hoạt tính VWF phổ biến nhất hiện nay.

Ở người bình thường, kết quả VWF:Ag và VWF:RCo là giống nhau.

KHOẢNG THAM CHIẾU

Khoảng tham chiếu của xét nghiệm VWF:RCo thường từ 50-150 IU/dl. Nhớ rằng VWF là một protein pha cấp vì vậy nó tăng lên trong thời gian stress, mang thai….

ĐỀ NGHỊ XÉT NGHIỆM NÀO TIẾP?

VWF:RCo thường là một phần trong xét nghiệm chẩn đoán hoặc loại trừ bệnh lý VWD. Nó cũng được dùng để theo dõi điều trị.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Chen D, 4 CA, Hendricksen JI, Pruthi RK, Nichols WL, Heit JA, et al. A highly- sensitive plasma von Willebrand factor ristocetin cofactor (VWF:RCo) activity assay by flow cytometry. J Thromb Haemost. 2008 Feb;6(2):323-30.

De Vleeschauwer A, Devreese K. Comparison of a new automated von Willebrand factor activity assay with an aggregation von Willebrand ristocetin cofactor activity assay for the diagnosis of von Willebrand disease. Blood Coagul Fibrinolysis. 2006 Jul;17(5):353-8.

Dowling SV, Ekert H. A comparison of two methods for measurement of von Willebrand's factor (ristocetin cofactor). Thromb Haemost. 1976 Aug 31;36(1):284-5.

Ewenstein BM. Use of ristocetin cofactor activity in the management of von Willebrand disease. Haemophilia. 2001 Jan;7 Suppl 1:10-5.

Federici AB, Canciani MT, Forza I, Cozzi G. Ristocetin cofactor and collagen binding activities normalized to antigen levels for a rapid diagnosis of type 2 von Willebrand disease--single center comparison of four different assays. Thromb Haemost. 2000 Dec;84(6):1127-8.

Flood VH, Friedman KD, Gill JC, Morateck PA, Wren JS, Scott JP, et al. Limitations of the ristocetin cofactor assay in measurement of von Willebrand factor function. J Thromb Haemost. 2009 Nov;7(11):1832-9.

Lattuada A, Preda L, Sacchi E, Gallo L, Federici AB, Rossi E. A rapid assay for ristocetin cofactor activity using an automated coagulometer (ACL 9000). Blood Coagul Fibrinolysis. 2004 Sep;15(6):505-11.

Lippi G, Franchini M, Salvagno GL, Montagnana M, Poli G, Guidi GC. Correlation between von Willebrand factor antigen, von Willebrand factor ristocetin cofactor activity and factor VIII activity in plasma. J Thromb Thrombolysis. 2008 Oct;26(2):150-3.

Macfarlane DE, Stibbe J, Kirby EP, Zucker MB, Grant RA, McPherson J. Letter: A method for assaying von Willebrand factor (ristocetin cofactor). Thromb Diath Haemorrh. 1975 Sep 30;34(1):306-8.

Redaelli R, Corno AR, Borroni L, Mostarda G, Nichelatti M, Morra E, et al. von Willebrand factor ristocetin cofactor (VWF:RCo) assay: implementation on an automated coagulometer (ACL). J Thromb Haemost. 2005 Dec;3(12):2684-8.

Strandberg K, Lethagen S, Andersson K, Carlson M, Hillarp A. Evaluation of a rapid automated assay for analysis of von Willebrand ristocetin cofactor activity. Clin Appl Thromb Hemost. 2006 Jan;12(1):61-7.

Truss NJ, Beavis J, MacCallum PK, Harrison P, Warner TD. Rapid and accurate method for the von Willebrand factor ristocetin cofactor assay using 96-well microtiter plates. J Thromb Haemost. 2009 Jul;7(7):1226-8.

Vanhoorelbeke K, Cauwenberghs N, Vandecasteele G, Vauterin S, Deckmyn H. A Reliable von Willebrand factor: ristocetin cofactor enzyme-linked immunosorbent assay to differentiate between type 1 and type 2 von Willebrand disease. Semin Thromb Hemost. 2002 Apr;28(2):161-6.

Vanhoorelbeke K, Cauwenberghs N, Vauterin S, Schlammadinger A, Mazurier C, Deckmyn H. A reliable and reproducible ELISA method to measure ristocetin cofactor activity of von Willebrand factor. Thromb Haemost. 2000 Jan;83(1):107-13.

Veyradier A, Fressinaud E, Boyer-Neumann C, Trossaert M, Meyer D. von Willebrand factor ristocetin cofactor activity correlates with platelet function in a high shear stress system. Thromb Haemost. 2000 Oct;84(4):727-8.

Federici AB, Canciani MT, Forza I, Mannucci PM, Marchese P, Ware J, et al. A sensitive ristocetin co-factor activity assay with recombinant glycoprotein Ibalpha for the diagnosis of patients with low von Willebrand factor levels. Haematologica. 2004 Jan;89(1):77-85.

Vanhoorelbeke K, Pareyn I, Schlammadinger A, Vauterin S, Hoylaerts MF, Arnout J, et al. Plasma glycocalicin as a source of GPIbalpha in the von Willebrand factor ristocetin cofactor ELISA. Thromb Haemost. 2005 Jan;93(1):165-71.

Chen D, Daigh CA, Hendricksen JI, Pruthi RK, Nichols WL, Heit JA, et al. A highlysensitive plasma von Willebrand factor ristocetin cofactor (VWF:RCo) activity assay by flow cytometry. J Thromb Haemost. 2008 Feb;6(2):323-30.

Lindahl TL, Fagerberg IH, Larsson A. A new flow cytometric method for measurement of von Willebrand factor activity. Scand J Clin Lab Invest. 2003;63(3):217-23.

Bowyer AE, Shepherd F, Kitchen S, Makris M. A rapid, automated VWF ristocetin cofactor activity assay improves reliability in the diagnosis of Von Willebrand disease. Thromb Res 2011;127:341-4.

Xem tiếp: Các xét nghiệm đông máu: Xét nghiệm yếu tố Willebrand (P3)

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

facebook.com/BVNTP

youtube.com/bvntp