Xemtailieu Tải về Đề tài nghiên cứu enzyme
LỜI MỞ ĐẦU Hầu như mọi phản ứng hóa học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme – chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, những nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm ra được những công dụng khác nhau của mỗi enzyme. Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng enzyme bromelain từ vỏ dứa…. Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số bệnh, đặc biệt là bệnh mang tính di truyền, có thể do thiếu hay mất hẳn một hoặc số enzyme trong các mô, các điều kiện không bình thường cũng có thể xuất hiện do hoạt tính dư thừa của một số enzyme đặc hiệu. Do đó xác định hoạt tính của một số enzyme trong huyết tương, hồng cầu hoặc trong các mô là rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh. Enzyme đã trở thành các công cụ thực tếquan trọng không những trong y học mà cả trong công nghệ hóa học, trong chế biến thực phẩm… Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nghiên liệu rất phong phú (dứa, đu đủ,… ). Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ sử dụng một phần của quả dứa, phần còn lại là phụ phẩm. Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm enzyme bromelain có từ cây dứa. Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao. 1 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU.............................................................................................................................i CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN......................................................................................................1 1.1. Đặc điểm nguồn nguyên liệu:......................................................................................1 1.2. Enzyme:.......................................................................................................................2 1.2.1. Phân loại:..............................................................................................................2 1.2.2 1.3. Tổng quan vê protease 2 Enzyme Bromelain:.....................................................................................................3 1.3.1. Cấu tạo hoá học:...................................................................................................3 1.3.2. Cấu trúc không gian:............................................................................................4 1.3.3. Tính chất vật lí:....................................................................................................4 1.3.4. Hoạt tính của bromelain:......................................................................................5 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.......................................................................8 2.1. Phương pháp nghiên cứu:............................................................................................8 2.1.1. Nguyên liệu:.........................................................................................................8 2.1.2. Hóa chất:..............................................................................................................8 2.1.3. Thiết bị:................................................................................................................8 2.1.4. Sơ đồ khối:...........................................................................................................9 2.1.5. Thuyết minh quy trình........................................................................................10 2.2. 2.2.1. Phương pháp thí nghiệm:..........................................................................................10 Khảo sát hoạt tính enzyme bromelain (Xác định hoạt tính enzym Bromelain bằng phương pháp Anson cải tiến):..........................................................................................10 2.2.2. Định lương enzyme bằng phương pháp Biuret:.................................................12 2.2.3. Phương pháp sắc kí lọc gel:...............................................................................14 2.2.4. Phương pháp điện di SDS- PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide): 15 2 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..............................................................................18 3.1. Thí nghiệm 1: tủa bromelain bằng cồn 96o................................................................18 3.2. Thí nghiệm 2: tinh sạch protein bằng phương pháp lọc gel......................................20 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN........................................................................................................21 CHƯƠNG 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................22 3 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Trái thơm...........................................................................................................1 Hình 2. Cấu trúc của Bromelain.....................................................................................4 Hình 3. Sơ đồ quy trình..................................................................................................9 Hình 4. Phản ứng Biuret...............................................................................................13 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Những tính chất vật lý của bromelain thân.......................................................5 Bảng 2. Hoạt tính phân giải casein của bromelain.........................................................5 Bảng 3. Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelain...........6 Bảng 4. Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin.............................................................11 Bảng 5. Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính..............................................11 Bảng 6. Lập đường chuẩn Biuret.................................................................................14 Bảng 7. Chuẩn bị mẫu đo Biuret..................................................................................14 Bảng 8. Cách pha gel điện di.......................................................................................16 Bảng 9. Khối lượng kết tủa thu được ở 3 tỉ lệ khác nhau............................................18 Bảng 11. Hàm lượng Protein có trong mẫu trước và sau khi tủa bằng cồn 96o..........18 Bảng 12. Hoạt tính enzyme có trong mẫu trước và sau khi tủa...................................18 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm nguồn nguyên liệu: Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, có nguồn gốc ở Nam Mỹ (Brazil, Argentina, Paraguay), hiện ở những vùng này vẫn có thể tìm thấy nhiều giống dứa hoang dại. Hiện nay trên thế giới, cây dứa được trồng hầu hết ở các nước trừ ở Châu Âu. Các nơi trồng nhiều như là: Hawaii, Brazil, Philipines, Thailand…Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn, trong đó 90% ở khu vực phía Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau…miền Bắc có Thanh Hóa, Tuyên Quang, Phú Thọ…miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam… Trên thế giới có khoảng 60-70 giống dứa và được chia thành 7 nhóm, trong đó có 3 nhóm trồng phổ biến là nhóm Cayenne, nhóm Queen và nhóm Spanish. - Nhóm Cayenne là nhóm dứa trồng phổ biến nhất trên thế giới, chiếm khoảng 80% diện tích. Ở nước ta mới trồng ở một số ít nơi như Vĩnh Phúc, Nghệ An, Lâm Đồng. Dứa thuộc nhóm này có quả lớn nhất, mắt phẳng và nông. Thịt quả kém vàng, nhiều nước, ít ngọt và kém thơm hơn dứa Queen. - Nhóm Queen còn gọi là dứa Hoàng Hậu, dứa hoa, dứa tây. Đây là nhóm dứa trồng phổ biến nhất ở nước ta hiện nay, với các giống dứa tây, giống dứa Na Hoa ở phía Bắc, các giống Queen Long An, Kiên Giang ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (còn gọi là khóm hoặc thơm). Dứa thuộc nhóm này có quả tương đối nhỏ, mắt lồi. Thịt quả vàng đậm, giòn, hương thơm, vị chua và ngọt lâu. Nhóm này có chất lượng cao nhất, trên thế giới thường dùng để ăn tươi. - Nhóm Spanish còn gọi là dứa Tây Ban Nha, dứa ta. Nhóm này được trồng ở Thailand, Cuba… Quả dứa thuộc nhóm này lớn hơn dứa Queen, mắt sâu. Thịt quả vàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua ít thơm nhưng nhiều nước hơn dứa hoa. Dứa nhóm này chịu bóng râm, ít dập nát khi vận chuyển và hàm lượng đường thấp nên không được phát triển. 1 Hình 1. Trái thơm 1.2. Enzyme: Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự trao đổi chất mà ngừng lại thì sự sống sẽ không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống. ENZYME = XÚC TÁC SINH HỌC Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường là mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác tổng hợp. Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu đối với cơchất, làm tăng đáng kể tốc độ các phản ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước trong các điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học. Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong các lĩnh vực khác như: công nghệ chế biến thực phẩm, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen vào bảo vệ môi trường, đặc biệt là trong y học với ứng dụng sản xuất dược phẩm. Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản: - Nguồn động vật. Nguồn thực vật. Nguồn vi sinh vật. 1.2.1. Phân loại: Ngày nay ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện, và để thống nhất tên gọi enzyme người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại: - Oxidoreductase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hoá khử. Transferase: là nhóm enzyme xúc tác phản ứng chuyển vị một nhóm (gốc) - nào đó từ chất này sang chất khác. Hydrolase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (phản ứng cắt có sự tham gia của nước). 2 - Lyase: là nhóm các enzyme xúc tác quá trình phân cắt một nhóm nào đó ra - khỏi hợp chất mà không có sự tham gia của nước. Izomerase: là nhóm enzyme xúc tác sự đồng phân hoá, chuyển dạng đồng - phân này sang dạng đồng phân khác. Ligase: là nhóm enzyme xúc tác sự tổng hợp chất hữu cơ nhờ năng lượng ATP và các chất tương tự. 1.2.2. Tổng quan về protease: Nhóm enzyme protease ( peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptit ( -CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptitde đến sản phẩm cuối cùng là axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa…) và động vật ( gan, dạ dày…). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất có thể tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng Bromelain là proteinenzyme có nhiều trong quả dứa và có một ít trong quả chuối, enzyme này được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỷ 20. Ở nước ta nghiên cứu về bromelain được bắt đầu từ những năm 1968 -1970 1.3. Enzyme Bromelain: . Bromelain là nhóm protease thực vật có mã số EC-3.4.22.33 được thu nhận từ họ bromeliaceae, đặc biệt là từ thân và trái dứa. Ở mỗi bộ phận khác nhau thì bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau. Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide. Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein. Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl của bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro. 3 1.3.1. Cấu tạo hoá học: Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose. Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu –NH 2 là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelain quả, acid amin đầu –NH2 là alanine. OH OH OH Fructose OH OH Maltose CH2 OH CH2 OH OH OH Glucofamine OH Maltose CH2 OH Maltose CH2 OH NHCONH3 OH OH Xylose C NHCOCH2 CH OH OH N NHCONH3 Hình 1.1: Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelain 1.3.2. Cấu trúc không gian: Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau: - Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp - - Gly – Cys – Lys Hìnhtâm 2. Cấuhoạt trúc củađộng Bromelain. Bromelain là một protease trong có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối - S – S -. Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp. 4 Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra, trong phân tử còn có các ion Zn 2+ có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzyme. 1.3.3. Tính chất vật lí: Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau: Bảng 1. Những tính chất vật lý của bromelain thân. Tính chất Ký hiệu Số liệu Hằng số sa lắng S (s) 2.73 Hằng số khuếch tán D (cm2 / s) 7.77 x 10 -7 Thể tích riêng phần V (ml/g) 0.743 Độ nhớt bên trong [ I ] (dl/g) 0.039 Tỷ số ma sát f / fo 1.26 Điểm đẳng điện pI 9.55 Sự hấp thu A1%cm ở 280nm 20.1 32.000 * Trọng lượng phân tử 32.100 ** 35.500 *** * : Tính bằng phương pháp sa lắng - khuếch tán ** *** : Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong : Tính bằng phương pháp Archibald 1.3.4. Hoạt tính của bromelain: 1.3.4.1. Hoạt tính phân giải Bromelain có 3 hoạt tính: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở bromelain hơn papain trong đu đủ và ficin trong cây thuộc họ Sung. - Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromelain. Bảng 2. Hoạt tính phân giải casein của bromelain. Cơ chất Hoạt tính phân giải casein ( UI/mg) Bromelain Bromelain 5 Bromelain quả thân Casein quả xanh 7.4 chín 4.0 3.0 - Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơn trong - quả xanh và quả chín. Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của bromelain. Bảng 3. Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelain. Cơ chất Hoạt tính phân giải BAA ( UI/mg) Bromelain thân BAA Bromelain quả xanh 3.7 Bromelian quả chín 9.1 7.2 Qua bảng trên ta thấy bromelain quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelain thân và quả chín. 1.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain: Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch, phương pháp tinh khiết... Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của các chất hoạt hóa… Ảnh hưởng của pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme, pH tối thích của bromelain không ổn định mà tuỳ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch enzyme…Ví dụ: Khi thu thập bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là (NH4)2SO4 thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH = 4.8, ổn định ở pH = 4.6 5.4. Bromelain đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH = 6.0 và pH = 8.0, ổn định ở pH = 3.5 – 5.6 với nhiệt độ 63 ºC. Bromelain có biên độ pH rộng (3 -10), tốt nhất là pH = 5 – 8 tuỳ thuộc vào cơ chất. Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những loại cơ chất khác nhau, bromelain có hoạt tính khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn papain gấp 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelain tương tự như papain. Đối với các cơ chất tổng hợp như BAA 6 (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thuỷ giải của bromelain yếu hơn papain. Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ ít nhiều ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme. Ví dụ: Ở dịch chiết quả dứa (pH = 3.5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60ºC thì bromelain vẫn còn hoạt tính nhưng nếu tăng cao quá thì bromelain sẽ mất hoạt tính. Ở 5ºC, pH = 4 - 10 thì enzyme giữ hoạt tính tối đa trên casein trong 24h. Ở 55ºC, pH = 6.1 thì enzyme mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút. Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme. Chẳng hạn muối thuỷ ngân có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain và mức độ kìm hãm tuỳ thuộc vào nồng độ của muối. 7 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Phương pháp nghiên cứu: 2.1.1. Nguyên liệu: Vỏ quả dứa, 1 phần thịt quả dứa 2.1.2. Hóa chất: - Hóa chất để tủa: Cồn 96O - Dung dịch đệm phosphate : NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4. - Hóa chất xác định hàm lượng protein: thuốc thử anson =. - Hóa chất xác định hoạt tính enzyme. - Hóa chất để cố định enzyme: - Đệm phosphate 0.1 M pH 7 - CaCl2 0.02 M - Acid acetic 1% 2.1.3. Thiết bị: - Máy quang phổ UV-Vis - Máy ly tâm. - Máy xay vỏ dứa. - Máy đo PH. - Cân phân tích. - Ống nghiệm - Bình tam giác. - Giấy lọc. - Pipet thủy tinh: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml. - Pipet man các loại. 8 - Đầu típ các loại. - Cốc thủy tinh 100ml, 250ml. - Giá đựng ống nghiệm - Ống đong 50ml, 100ml, 500ml 9 2.1.4. Sơ đồ khối: Vỏ dứa Nghiềền Lọc - 5000v/phút - 10 phút Ly tâm Thu dịch -Cồền 96o - 3 tỷ lệ 1:3; 1:4; 1:5 T ủa Ly tâm - 5000v/ phút - 20 phút Xác định hoạt tính và định lượng enzyme Tủa mẫu theo tỷ lệ có hàm lương cao nhất Ly tâm Xác định hoạt tính và định lượng enzyme Chạy sắc kýlọc gel Hình 3. Sơ đồ quy trình. 10 Enzyme 2.1.5. Thuyết minh quy trình Vỏ dứa sau khi thu nhận từ các cơ sở đưa đươc về phòng thí nghiệm. Tại đây, vỏ dứa được xay hoặc nghiền nát. Sau đó, đem đi lọc thu được dịch lọc và mang dịch lọc này ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ cặn và thu lấy dịch. Sau đó, tạo tủa cho 1 phần dịch này bằng cồn 96 0 theo 3 tỷ lệ dịch mẫu: ancol là 1:3; 1:4; 1:5. Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác. Cho từ từ lượng cồn 96 0 đã được làm lạnh vào bình tam giác chứa dịch enzyme. Khuấy đều. Để tủ lạnh 40 phút ở nhiệt độ 5 0C. Lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút. Thu tủa. Hòa trong 2ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7. Lấy mẫu đi xác định hoạt tính bằng phương pháp Anson cải tiến và định lượng enzyme bằng phương pháp Biuret. Sau khi có kết quả định tính và định lượng, ta tủa tất cả dịch theo tỷ lệ cho kết quả cao nhất và thực hiện các bước tương tự như trên. Chạy sắc ký lọc gel enzyme thô và thu được enzyme tinh khiết. Kiểm tra kết quả lọc gel bằng phương pháp điện di. 2.2. Phương pháp thí nghiệm: 2.2.1. Khảo sát hoạt tính enzyme bromelain (Xác định hoạt tính enzym Bromelain bằng phương pháp Anson cải tiến): 2.2.1.1. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzym Bromelin có trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để tính lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên. 2.2.1.2. Dụng cụ và hóa chất: Dụng cụ - Ống nghiệm Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml Máy quang phổ 11 - Becher 50ml, 250ml, 500ml Bình tia Hóa chất - Dung dịch Casein 1% Dung dịch TCA 5% Dung dịch NaOH 0,5N Thuốc thử Folin Dung dịch HCl 0,2N Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 mM/l trong dung dịch HCl 0,2N 2.2.1.3. Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin : Bảng 4. Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin Dung dịch hóa chất Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10 Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK). 2.2.1.4. Phương pháp tiến hành: Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không Bảng 5. Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Thử thật Thử không Dung dịch Casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10 Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 1 o Lắc đều và giữ ở 35,5 C trong 20 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không. 12 Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm. Tính ΔOD = OD TT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được số µM Tyrosin. 2.2.1.5. 2.2.1.5 Tính kết quả: Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 …) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn. Hđ Protease = μ M tyrosin ×V × L t × m ×v (UI/g) Với: Hđ Protease : hoạt độ enzym protease trên 1 đơn vị khối lượng (UI/g) V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml) v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) t : thời gian thủy phân (phút) m : khối lượng mẫu enzym đem đi xác định hoạt tính (g) L: độ pha loãng enzym µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn 2.2.2. Định lương enzyme bằng phương pháp Biuret: 2.2.2.1. Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng tạo màu giữa protein và Cu 2+ trong môi trường kiềm tạo phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540nm. Cường độ màu tỷ lệ thuận với lượng Cu và số lượng liên kết peptide trong chuỗi polypeptide. 13 Hình 4. Phản ứng Biuret. 2.2.2.2. Dụng cụ và hóa chất: Dụng cụ - Ống nghiệm - Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml - Máy quang phổ - Becher 50ml, 250ml, 500ml - Bình tia Hóa chất - Dung dịch albumin chuẩn 1% - Thuốc thử Biuret: CuSO4 Tartrat Kilium và Natrium Nước cất 2.2.2.3. Tiến hành: - Chuẩn bị thuốc thử Biuret: Cân chính xác CuSO4 : 1,5g Tartrat Kilium và Natrium: 6g Nước cất: 500ml Cho vào bình lắc cho tan hoàn toàn và định mức đến 1000ml. - Lập đồ thị chuẩn: Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 7 và cho vào đó các chất như bảng sau: 14 Bảng 6. Lập đường chuẩn Biuret. Ống nghiệm Nồng độ protein chuẩn (mg/ml) Dung dịch protein chuẩn (ml) Thuốc thử Biuret (ml) 1 2 3 4 5 6 7 0 0 2 4 6 8 10 1 1 1 1 1 1 1 4 4 4 4 4 4 4 Lắc đều, để 20 phút. Đo OD ở bước sóng 540nm. - Chuẩn bị mẫu đo Biuret: Bảng 7. Chuẩn bị mẫu đo Biuret. Ống nghiệm Dung dịch mẫu Thuốc thử Biuret (ml) 0 1ml nước cất 4 1 1ml mẫu 4 2 1ml mẫu 4 Lắc đều, để 20 phút. Đo OD ở bước sóng 540nm. 2.2.2.4. Tính kết quả: Lập đồ thị chuẩn của các ống nghiệm từ 3-7 . Trị số mật độ quang của các ống nghiệm từ 3-7 bằng mật độ quang của các ống nghiệm từ 2-6 đã đo ở trên trừ cho mật độ quang trung bình của ống 1 và 2 ( Bước sóng 540 nm). Sau đó lập đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn. Tương tự, độ hấp thu thật sự của protein trong ống nghiệm bằng trị số mật độ quang của ống nghiệm trừ cho ống đối chứng. Sau đó chiếu vào đường chuẩn suy ra lượng protein có trong mẫu thí nghiệm. 2.2.3. Phương pháp sắc kí lọc gel: 2.2.3.1. Nguyên tắc: Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng này được phủ đầy dung môi dùng làm pha động. Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có trọng lượng phân tử khác nhau cò thể tách riêng được hay không là tuỳ vào kích thước lỗ rỗng. Các phân tử có kích thước lớn hơn lỗ rỗng, không thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng, nhanh chóng theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột. các phân tử có trọng lượng phân tử (TLPT) nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng, sẽ toàn phần hay bán phần lọt vào lỗ rỗng, tuy rằng cuối cùng rồi cũng theo dòng chảy đi ra khỏi cột nhưng sẽ chậm trễ hơn. Dòng chảy pha động khiến các phân tử lớn 15 không thể chui vào lỗ rỗng của mạng gel, nhanh chóng đi xuyên qua cột, ra khỏi cột, trong khi phân tử nhỏ ra khỏi cột lâu hơn vì còn chui vào và đi ra khỏi lỗ rỗng của gel. Như vậy, các thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khi đi ngang qua cột sắc ký gel, sẽ ra khỏi cột lần lượt theo trình tự TLPT lớn đi ra khỏi cột trước, phân tử nhỏ đi ra khỏi cột sau. 2.2.3.2. Tiến hành Sắc ký gel phải thực hiện trong cột hình ống trụ bằng thuỷ tinh, gồm các bước sau: - Nhồi gel vào cột: các hạt gel trương nở hiện diện ở dạng huyền phù trong dung môi phù hợp cho vào cột. Huyền phù được chỉnh sao cho thật sệt nhưng khi rót vẫn chảy vào cột thành dòng dễ dàng. Cân bằng cột bằng cách cho dung môi giải ly chảy ngang qua cột, lượng dung môi có thể tích bằng 2-3 lần thể tích cột. Kiểm tra sự chặt chẽ của cột bằng cách cho một lượng mẫu thử vào đầu cột. mẫu thử thường được chọn là dextran blue 2000, có màu xanh dương để có thể được quan sát bằng mắt thường sự di chuyển của mẫu trong - cột. Đặt mẫu cần sắc ký lên đầu cột gel: dung dịch mẫu cần phân tách phải được lọc bỏ những hợp chất còn ở dạng rắn, cặn. Dung dịch mẫu hoà tan vào dung - dịch đệm, đặt lên đầu cột giống như sắc ký cột. Triển khai sắc ký gel: triển khai giải ly rất đơn giản, chỉ sử dụng kỹ thuật dung môi đơn nồng độ (nghĩa là sử dụng một loại dung môi hay hỗn hợp hai dung môi, khi bắt đầu cho tới khi kết thúc quá trình giải ly chỉ sứ dụng một loại dung môi đó). Giải ly có thể bằng trọng lực nhưng rất tốt khi sử dụng bơm đẩy từ đầu cột. hứng dung môi giải ly trong những lọ nhỏ, mỗi lọ có một thể tích nhất định. Các chất tan sẽ ra khỏi cột theo thứ tự TLPT giảm dần. 2.2.4. Phương pháp điện di SDS- PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide): 2.2.4.1. Nguyên tắc: Dựa vào sự di chuyển cảu các phân tử mang điện tích trong điện trường. Điện di protein trên gel tiến hành xử lý gel bằng SDS. Phân tử protein có điện tích tự do chứa những nhóm acid và base. Nếu các phân tử protein không được đạt ở điểm đẳng điện thì dưới ảnh hưởng của điện trường ngoài, chúng di chuyển sang các cực. Các protein khác nhau có trị số điện tích tự do khác nhau. Vì thế, tốc độ di chuyển của chúng trong điện trường ở những điều 16 Tải về bản full