Giáo Trình Thực Tập Sinh Học đại Cương - Tài Liệu Text - 123doc

Có thể bạn quan tâm

Tải bản đầy đủ (.pdf) (44 trang)

Trang chủ

Giáo án - Bài giảng

Cao đẳng - Đại học

Giáo trình thực tập sinh học đại cương

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.25 MB, 44 trang )

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNGKHOA DƢỢCGIÁO TRÌNH THỰC TẬPSINH HỌC ĐẠI CƢƠNG(Lƣu hành nội bộ)Năm 2014NỘI QUY PHÒNG THỰC TẬP1. Sinh viên phải thực hiện đầy đủ các bài thực tập theo chƣơng trình của môn học.Sinh viên vắng 1 buổi thực tập sẽ không đƣợc thi hết môn.2. Sinh viên phải đến phòng thực tập đúng giờ qui định. Trong giờ thực hành,sinh viên muốn ra ngoài phòng thực tập phải xin phép giảng viên.Giờ thực tập:- Sáng:7h30-11h15- Chiều: 12h50-16h35- Tối:17h00-20h453. Sinh viên muốn nghỉ thực tập thì phải làm đơn xin phép nghỉ và ghi rõ ngày đithực tập bù nộp cho giảng viên phụ trách buổi thực tập (thực tập bù ngaytrong tuần). Khi đi thực tập bù, sinh viên phải trình đơn có chữ ký xác nhận chogiảng viên. Thực tập bù đúng bài qui định.4. Sinh viên phải đọc bài thực tập trƣớc khi đến phòng thực tập.5. Trong giờ thực tập, sinh viên phải đội mũ, mặc áo blouse (có gài nút), đeobảng tên và tắt chuông điện thoại. Không tự ý sử dụng máy móc khi chƣa cósự cho phép của giảng viên.6. Sau mỗi buổi thực tập, sinh viên phải sắp xếp dụng cụ đúng vị trí, vệ sinh sạch sẽphòng thực tập. Tắt tất cả các thiết bị điện trƣớc khi ra về.7. Sinh viên làm hƣ hỏng, bể vỡ dụng cụ phải đền trƣớc khi môn học kết thúcthì mới đƣợc dự thi hết môn.8. Sinh viên phải thực hiện đúng quy định phòng cháy, chữa cháy.iiMỤC LỤCPHẦN A. SINH HỌC TẾ BÀO ..................................................................................1Bài 1. KÍNH HIỂN VI - QUAN SÁT TẾ BÀO NHÂN SƠ VÀ TẾ BÀO NHÂNCHUẨN.......................................................................................................................21. Kính hiển vi quang học ........................................................................................22. Phƣơng pháp thực hiện tiêu bản hiển vi ...............................................................53. Thực hành: Quan sát tế bào nhân sơ, tế bào nhân chuẩn .....................................6Bài 2. MỘT SỐ BÀO QUAN, CHẤT DỰ TRỮ VÀ CHẤT CẶN BÃ CỦA TẾBÀO THỰC VẬT .......................................................................................................71. Các bào quan ........................................................................................................72. Chất dự trữ ............................................................................................................83. Chất cặn bã ...........................................................................................................9Bài 3. TÍNH THẤM QUA MÀNG TẾ BÀO – NGUYÊN PHÂN ...........................101. Màng tế bào ........................................................................................................102. Nguyên phân.......................................................................................................11PHẦN B. SINH HỌC PHÂN TỬ .............................................................................12Bài 1. KỸ THUẬT CƠ BẢN ....................................................................................131. Một số dụng cụ cơ bản .......................................................................................132. Cách cân pha hóa chất cần thiết .........................................................................15Bài 2. AN TOÀN THÍ NGHIỆM – CÁC PHƢƠNG PHÁP THANH TRÙNG ......171. An toàn phòng thí nghiệm cơ bản ......................................................................172. Xử lý chất thải ....................................................................................................183. Phƣơng pháp khử trùng ......................................................................................18Bài 3. CHIẾT TÁCH PLASMID PBLUESCRIPT TỪ E.COLI BẰNG PHƢƠNGPHÁP MẪU NHỎ (MINIPREP) ..............................................................................221. Nguyên tắc ..........................................................................................................222. Nguyên vật liệu ..................................................................................................223. Thực hành ...........................................................................................................22Bài 4. CHIẾT TÁCH ADN BỘ GEN TỪ TẾ BÀO MÁ Ở NGƢỜI........................241. Vật liệu – hóa chất ..............................................................................................242. Nguyên tắc ..........................................................................................................243. Phƣơng pháp tiến hành .......................................................................................25Bài 5. CHIẾT TÁCH ADN TỪ MÔ THỰC VẬT ...................................................261. Phƣơng pháp MITSUI ........................................................................................262. Phƣơng pháp CTAB ...........................................................................................27Bài 6. KỸ THUẬT CẮT GIỚI HẠN ADN ..............................................................291. Vật liệu – hóa chất ..............................................................................................292. Các enzyme cắt giới hạn.....................................................................................293. Phƣơng pháp tiến hành .......................................................................................30Bài 7. PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE ....................................311. Nguyên vật liệu ..................................................................................................312. Tiến hành ............................................................................................................31iiiBài 8. PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ADN BẰNG ĐO MẬT ĐỘ QUANG .....331. Nguyên tắc ..........................................................................................................332. Nguyên vật liệu ..................................................................................................333. Tiến hành ............................................................................................................33Bài 9. PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI ADN - PCR .....................................................341. Nguyên tắc chung ...............................................................................................342. Thực hành ...........................................................................................................34PHA CHẾ MỘT SỐ HÓA CHẤT DÙNG TRONG THỰC HÀNH ........................36ivPHẦN ASINH HỌC TẾ BÀOBiên soạn: PGS.TS. Trƣơng Thị Đẹp1Bài 1KÍNH HIỂN VI - QUAN SÁT TẾ BÀO NHÂN SƠ VÀTẾ BÀO NHÂN CHUẨNMỤC TIÊU HỌC TẬP1. Nêu được các thành phần cấu tạo của kính hiển vi quang học và sử dụngđược kính hiển vi để quan sát tế bào.2. Thực hiện được các tiêu bản hiển vi để quan sát bằng kính hiển vi quang học.3. Quan sát và vẽ được hình dạng và cấu tạo của tế bào nhân sơ và nhân chuẩn.1. Kính hiển vi quang họcThân kínhChân kínhHình 1. Kính hiển vi 2 thị kính hiệu OLYMPUS21.1. Cấu tạo của kính hiển viCác bộ phận cơ bản của một kính hiển vi quang học (Hình 1) nhƣ sau:a. Chân kính: Để giữ thăng bằng cho kính, có các hình dạng khác nhau.b. Thân kính: Từ dƣới lên trên gồm các bộ phận sau:- Bộ phận lấy ánh sáng: là đèn chiếu sáng hoặc gương phản chiếu đƣợc gắntrên chân kính. Gƣơng phản chiếu có hình tròn, gồm một mặt phẳng và một mặtlõm, có thể xoay theo nhiều hƣớng khác nhau; trong thực hành tại Bộ môn, sinhviên chỉ sử dụng mặt lõm của gƣơng để hội tụ ánh sáng từ nguồn sáng là đèn néonhay ánh sáng mặt trời.- Bàn kính (bàn mang lam kính): Để đặt tiêu bản, có hình tròn hay hìnhvuông, ở giữa có một lỗ thủng để cho ánh sáng đi từ dƣới lên. Trên bàn kính có kẹpdùng để cố định lam kính. Lam kính có thể di chuyển theo chiều ngang và chiều dọcnhờ các ốc di chuyển gắn trên bàn kính. Bàn kính có thể đƣợc cố định hay di chuyểnlên xuống bằng ốc sơ cấp.- Ốc di chuyển vật kính: gồm ốc điều chỉnh lớn (ốc sơ cấp) và ốc điều chỉnhnhỏ (ốc vi cấp). Ốc sơ cấp giúp nâng lên hoặc hạ xuống bàn kính hoặc vật kính; khiđiều chỉnh bằng ốc sơ cấp khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản quan sát thì thayđổi mắt thƣờng có thể nhìn thấy đƣợc. Ốc vi cấp dùng điều chỉnh hình ảnh rõ néthơn.- Tụ quang: có hình trụ, nằm ngay bên dƣới bàn kính; đây là một hệ thốngthấu kính dùng để hội tụ ánh sáng từ gƣơng phản chiếu để tạo thành chùm tia sángmạnh hơn, có thể di chuyển nhờ một ốc gắn trên thân kính. Phía dƣới hệ thống sángcó một cần gạt để mở hay đóng cửa sổ chắn sáng giúp ta điều chỉnh nguồn ánh sángvào nhiều hay ít.- Cần kính: là chỗ cầm kính hiển vi khi di chuyển kính, ở đầu mang thị kính,ở giữa có gắn một bàn xoay trên đó có gắn các vật kính có độ phóng đại khác nhau.- Vật kính: là bộ phận quan trọng và phức tạp nhất của kính hiển vi, bênngoài vỏ có ghi: loại vật kính, độ phóng đại, độ mở,…Ví dụ: Vật kính có ghi 40X/0.65 và 160/0.17 thì có nghĩa là: vật kính có độ phóngđại là 40 lần, độ mở của tụ quang là 0,65, chiều dài ống kính phù hợp là 160 mm,chiều dày của phiến kính trung bình là 0,17 mm ( 0,02 mm).Các kính hiển vi sử dụng tại Bộ môn thƣờng có 4 loại vật kính có độ phóngđại là 4, 10, 40 và 100 lần (4X, 10X, 40X, 100X). Các vật kính trên có thể:+ Di chuyển xoay tròn nhờ một bàn xoay, trong bàn xoay có một cái khớp.Khi muốn quan sát ở vật kính nào thì xoay vật kính đó vào đúng khớp.+ Di chuyển lên - xuống nhờ ốc sơ cấp.- Thị kính: gồm 2 thấu kính có mặt lõm hƣớng xuống phía dƣới, trên mặt cóghi những độ phóng đại khác nhau thƣờng là 10 lần (10X). Kính hiển vi có loại có1 thị kính, có loại có 2 thị kính.3Các bộ phận: chân kính, bàn kính, kẹp, ốc di chuyển vật kính là phần cơ họccủa kính hiển vi. Các bộ phận: tụ quang, vật kính, thị kính, đèn chiếu sáng, gƣơngphản chiếu là phần quang học.1.2. Cách sử dụng kính hiển viMỗi buổi thực hành, trƣớc khi sử dụng kính hiển vi, sinh viên phải kiểm tra cácbộ phận của kính, nếu thấy thiếu bộ phận hay bộ phận nào đó bị thay đổi thì báo cáongay cho giáo viên hƣớng dẫn. Trƣớc khi cắm điện cần phải kiểm tra công tắc ởvị trí 0 và nút chỉnh cƣờng độ sáng ở vị trí nhỏ nhất.a. Điều chỉnh ánh sáng cho quang trƣờng- Đối với kính hiển vi có 2 thị kính và có đèn gắn trên chân kínhLàm tuần tự các bƣớc sau đây:+ Cắm điện.+ Bật công tắc đèn từ vị trí 0 sang I.+ Vặn nút chỉnh cƣờng độ sáng tăng dần.+ Mở cửa sổ chắn sáng tối đa.+ Nâng tụ quang lên cho đến khi mặt kính tròn trên đầu tụ quang cách bànmang vật khoảng 5 mm.+ Xoay vật kính nhỏ (10X) vào vị trí quan sát (vào khớp).- Đối với kính hiển vi có 1 thị kính và có gƣơng phản chiếu+ Xoay mặt lõm của gƣơng phản chiếu vào nguồn sáng (có thể là ánh sáng mặttrời hay ánh sáng điện).+ Mở cửa sổ chắn sáng tối đa.+ Nâng tụ quang lên cho đến khi mặt kính tròn trên đầu tụ quang cách bànmang vật khoảng 5 mm.+ Xoay vật kính nhỏ (10X) vào vị trí quan sát (vào khớp).+ Nhìn vào thị kính, tay điều chỉnh gƣơng phản chiếu hƣớng về nguồn sáng chođến khi quang trƣờng sáng tối đa.b. Quan sát mẫu vật- Đặt tiêu bản lên bàn kính và kẹp chặt lại. Điều chỉnh sao cho mẫu vật quan sátnằm đúng ở giữa lỗ trống của bàn kính và ngay bên dƣới đầu vật kính 10X.- Dùng ốc sơ cấp chỉnh cho bàn kính lên cao tối đa (hoặc hạ từ từ vật kínhxuống cho đến khi đầu vật kính cách phiến kính mỏng khoảng 5 mm).- Nhìn vào thị kính, tay vặn ốc sơ cấp để hạ từ từ bàn kính xuống (hoặc nâng từtừ vật kính lên) cho đến khi nhìn thấy mẫu vật cần quan sát trong quang trƣờng.- Dùng ốc di chuyển tiêu bản để quan sát sơ bộ toàn bộ mẫu vật.- Khi muốn chuyển sang quan sát ở vật kính lớn: ta giữ nguyên trạng thái củakính hiển vi, dùng tay xoay nhẹ nhàng đĩa mang vật kính để đƣa vật kính cần quansát (ví dụ vật kính 40X) vào khớp, sau đó vặn ốc vi cấp để thấy rõ nét mẫu vật.41.3. Những điều chú ý khi sử dụng kính hiển vi- Khi di chuyển kính phải dùng cả hai tay để cầm kính, một tay cầm trên cần kính,một tay đỡ dƣới chân kính và luôn luôn để kính đứng thẳng.- Trong khi sử dụng kính hiển vi:+ Không để dung dịch quan sát dính vào đầu vật kính hay nhỏ xuống dƣới tụ quang.+ Vặn các ốc nhẹ nhàng. Đặc biệt đối với ốc vi cấp, khi vặn theo một chiều màthấy cứng thì lập tức phải vặn ngƣợc trở lại, không bao giờ cố vặn tới (sẽ gãyốc vi cấp).+ Nếu ngƣng quan sát một thời gian thì phải giảm nguồn sáng (không cần tắt đèn).- Sau khi sử dụng kính hiển vi:+ Giảm tối đa ánh sáng của đèn chiếu sáng.+ Tắt đèn.+ Lau cẩn thận phần cơ học bằng vải mềm khô và sạch.+ Lau cẩn thận phần quang học bằng giấy lau kính của Bộ môn. Tuyệt đốikhông đƣợc dùng khăn lau hay sờ tay vào các phần quang học.- Cất kính hiển vi vào tủ:+ Xoay vật kính nhỏ nhất vào khớp.+ Rút dây điện khỏi ổ cắm và quấn tròn quanh cần kính.+ Cất kính vào tủ theo đúng vị trí của kính.2. Phƣơng pháp thực hiện tiêu bản hiển vi2.1. Phƣơng pháp thực hiệnLàm tuần tự các bƣớc sau:- Cho 1 giọt dung dịch quan sát (nƣớc cất, glycerin, KI, Soudan III…) vào giữaphiến kính dày (phiến kính mang vật, lame).- Đặt mẫu vật cần quan sát vào giữa giọt dung dịch.- Đậy nhẹ nhàng phiến kính mỏng (phiến kính đậy vật, lamelle) lên mẫu vật saocho không có bọt khí trong dung dịch.Lưu ý:- Nếu dung dịch cho vào không đủ (không bao phủ hết mẫu vật), khi đó phảicho thêm dung dịch vào bằng cách dùng ống nhỏ giọt cho từ từ dung dịch vào mộtcạnh của phiến kính mỏng, dung dịch sẽ tự lan vào giữa 2 phiến kính.- Nếu dung dịch cho vào quá dƣ, trào ra ngoài phiến kính mỏng thì phải dùnggiấy thấm lau hết phần dung dịch thừa bên ngoài phiến kính mỏng.2.2. Cách thay dung dịch quan sátKhi cần quan sát một mẫu vật ở nhiều dung dịch khác nhau, có thể thay dungdịch bằng cách: dùng giấy thấm đặt ở một cạnh của phiến kính mỏng để rút dungdịch đang sử dụng, nhỏ 1-2 giọt dung dịch cần thay vào cạnh đối diện của phiếnkính mỏng.53. Thực hành: Quan sát tế bào nhân sơ, tế bào nhân chuẩn- Vật liệu: Bèo hoa dâu - Vi khuẩn lam, tế bào biểu mô miệng, củ Hành tây.- Hóa chất, dụng cụ:+ Dung dịch iod, nƣớc cất.+ Dao lam, bông gòn y tế.3.1. Tế bào nhân sơVi khuẩn lam có cấu tạo là tế bào nhân sơ, có khả năng tự dƣỡng nhờ quanghợp, sống cộng sinh trong bèo hoa dâu.Các bƣớc thực hiện:- Đặt ngƣợc một khuôn bèo hoa dâu lên phiến kính dày có sẵn một giọt nƣớc,dùng kim mũi mác làm nát cánh bèo, đậy phiến kính mỏng.- Quan sát: Hình dạng và cách sắp xếp các tế bào của vi khuẩn lam trên kínhhiển vi ở vật kính 10X và 40X.3.2. Tế bào nhân chuẩn3.2.1. Tế bào biểu bì Hành tâyCác bƣớc thực hiện:- Dùng dao lam rạch mặt trong vảy Hành tây một hình vuông cạnh 2 mm. Bóclớp biểu bì (lớp ngoài cùng) của hình vuông vừa rạch. Úp mặt vừa bóc lên phiếnkính dày có sẵn 1 giọt dung dịch iod. Đậy phiến kính mỏng lên mẫu vật.- Quan sát: Hình dạng và các thành phần của tế bào biểu bì trên kính hiển vi ởvật kính 10X và 40X.3.2.2. Tế bào biểu mô miệngCác bƣớc thực hiện:- Dùng bông vô trùng quệt vào vòm họng, sau đó phết lên phiến kính dày trong1 giọt nƣớc và đậy phiến kính mỏng lên mẫu vật.- Quan sát: Hình dạng tế bào và các thành phần của tế bào biểu mô miệng trênkính hiển vi ở vật kính 10X và 40X.BÁO CÁO THỰC HÀNH1. Hình vẽ và chú thích đầy đủ cấu tạo của tế bào vi khuẩn lam.2. Hình vẽ và chú thích đầy đủ cấu tạo của tế bào biểu bì vảy Hành tây.3. Hình vẽ và chú thích đầy đủ cấu tạo của tế bào biểu mô miệng.6Bài 2MỘT SỐ BÀO QUAN, CHẤT DỰ TRỮ VÀ CHẤT CẶNBÃ CỦA TẾ BÀO THỰC VẬTMỤC TIÊU HỌC TẬP1. Quan sát và vẽ đúng một số bào quan của tế bào thực vật.2. Quan sát và vẽ đúng các dạng chất dự trữ và chất cặn bã ở tế bào thực vật.Vật liệu: Quả Ớt chín, lá Lẻ bạn, lá Rong đuôi chồn, tinh bột Khoai tây, củ Thƣợcdƣợc, hạt Thầu dầu, cuống lá Trầu bà, thân Rau sam, phiến lá Đa búp đỏ.Hóa chất, dụng cụ:- Dung dịch iod, nƣớc cất, dung dịch Soudan III, ethanol 900, ether.- Dao lam, giấy thấm1. Các bào quan1.1. Sắc lạp ở quả Ớt chínCác bƣớc thực hiện:- Dùng dao lam cắt ngang thịt quả Ớt chín thành lát mỏng. Đặt lát cắt lên phiếnkính dày đã có một giọt nƣớc, đậy phiến kính mỏng.- Quan sát: Hình dạng, màu sắc và cách sắp xếp của sắc lạp trong tế bào trênkính hiển vi ở vật kính 10X và 40X1.2. Vô sắc lạp ở tế bào biểu bì lá Lẻ bạnCác bƣớc thực hiện:- Dùng dao lam tách một mảnh biểu bì dƣới (mặt có màu tím) của lá Lẻ bạn.Úp mặt biểu bì vừa bóc lên phiến kính dày trong 1 giọt nƣớc, đậy phiến kính mỏng.- Quan sát: Hình dạng, màu sắc và vị trí của vô sắc lạp trong tế bào trên kínhhiển vi ở vật kính 10X và 40X.1.3. Lục lạp và sự chuyển động của tế bào chất ở lá Rong đuôi chồnTế bào sống thì chất tế bào luôn chuyển động tạo thành dòng nội chất.Tuy nhiên, ta không thể quan sát trực tiếp sự chuyển động này vì chất tế bàotrong suốt. Chất tế bào di chuyển sẽ lôi kéo các hạt lục lạp di chuyển theo. Nhờ đóchúng ta có thể quan sát gián tiếp sự chuyển động của chất tế bào nhờ vào sựdi chuyển của các hạt lục lạp.Các bƣớc thực hiện:- Chọn một lá rong đuôi chồn tƣơi xanh, đặt lên phiến kính dày trong một giọtnƣớc, đậy phiến kính mỏng.- Quan sát: Hình dạng, màu sắc và sự di chuyển của lục lạp trong tế bào trênkính hiển vi ở vật kính 10X và 40X.7Chú ý: Tìm những tế bào ở vùng gần gân lá của lá rong sẽ dễ tìm thấy sự chuyểnđộng của chất tế bào hơn.2. Chất dự trữ2.1. Glucid- Tinh bột: là loại chất dự trữ phổ biến nhất trong tế bào thực vật (trong củ, thân,rễ, hạt…). Mỗi loại cây có dạng tinh bột riêng, đặc sắc cho loại cây đó.Các bƣớc thực hiện:+ Dùng đầu kim lấy một ít tinh bột Khoai tây đặt lên phiến kính dày trong mộtgiọt nƣớc, đậy phiến kính mỏng..+ Quan sát hạt tinh bột trong nƣớc ở vật kính 10X, 40X.+ Thay nƣớc thƣờng bằng 1-2 giọt nƣớc iod. Ghi nhận màu sắc của hạt tinh bột.- Inulin: là một đồng phân của tinh bột, tan trong nƣớc nhƣng kết tinh trong cồncao độ thành những tinh thể hình cầu.Các bƣớc thực hiện:+ Dùng dao lam cắt ngang một lát mỏng củ Thƣợc dƣợc, đặt lát cắt lên phiếnkính dày trong một giọt ethanol 900, đậy phiến kính mỏng.+ Quan sát tinh thể inulin ở vật kính 10X, 40X.2.2. ProtidHạt A-lơ-rôn là dạng chất dự trữ protid của thực vật thƣờng gặp trong hạt, đƣợchình thành từ sự mất nƣớc cùa không bào trong quá trình hạt chín. Hạt a-lơ-rônkhông màu, chiết quang, có hình cầu hay hình bầu dục gồm một cầu thể và một átinh thể.Các bƣớc thực hiện:- Bóc vỏ hạt Thầu dầu, dùng dao lam cắt ngang phôi nhũ hạt thành lát mỏng,đặt lên phiến kính dày. Cho vài giọt ether lên lát cắt, để khô, sau đó cho một giọtnƣớc iod vào lát cắt, đậy phiến kính mỏng.- Quan sát hạt a-lơ-rôn ở 40X.2.3. LipidGiọt dầu mỡ là dạng chất dự trữ lipid ở thực vật, không màu hay màu vàng, rấtchiết quang, không tan trong nƣớc, cho màu đỏ cam với Soudan III.Các bƣớc thực hiện:- Dùng dao lam cắt ngang phôi nhũ hạt Thầu dầu thành lát mỏng, đặt lên phiếnkính dày và nhỏ vào một giọt Soudan III, đậy phiến kính mỏng.- Quan sát giọt dầu mỡ ở vật kính 10X, 40X.83. Chất cặn bãCác bƣớc thực hiện:- Cắt ngang các mẫu: Cuống lá Trầu bà, thân Rau sam, phiến lá Lẻ bạn, phiến láĐa búp đỏ thành lát mỏng, đặt lên phiến kính dày đã có 1 giọt nƣớc, đậy phiến kínhmỏng.- Quan sát các vi phẫu ở vật kính 10X, 40X.3.1. Tinh thể calci oxalat- Hình kim (cuống lá Trầu bà): các tinh thể có thể nằm riêng lẻ hay xếp thành bó.- Hình cầu gai (thân Rau sam): các tinh thể có hình cầu gai.- Hình khối (phiến lá Lẻ bạn): tinh thể có hình khối lăng trụ rải rác trong tế bào.3.2. Tinh thể calci carbonat (bào thạch, nang thạch) trong phiến lá Đa búp đỏTinh thể có dạng một khối xù xì nhƣ quả Mít, treo bởi một cuống bằngcellulose có tẩm silic vào vách tế bào hạ bì chứa nó (thạch bào).BÁO CÁO THỰC HÀNH1. Hình vẽ tế bào mô mềm của thịt quả Ớt chín có sắc lạp.2. Hình vẽ tế bào biểu bì lá Lẻ bạn có vô sắc lạp.3. Hình vẽ tế bào lá Rong đuôi chồn có lục lạp và đánh dấu dòng chuyển động củatế bào chất.4. Hình vẽ tinh bột, tế bào có các dạng chất dự trữ và chất cặn bã. Các hình vẽ đềucó chú thích đầy đủ.9Bài 3TÍNH THẤM QUA MÀNG TẾ BÀO – NGUYÊN PHÂNMỤC TIÊU HỌC TẬP1. Giải thích được các hiện tượng xảy ra khi để tế bào thực vật trong dung dịchưu trương hay nhược trương.2. Thực hiện được thí nghiệm chứng minh chức năng của màng sinh chất vàgiải thích được kết quả của thí nghiệm.3. Quan sát và vẽ đúng các kỳ của phân bào nguyên nhiễm.Vật liệu: Lá Lẻ bạn, củ Dền đỏ, rễ Hành tím.Hóa chất, dụng cụ:- Dung dịch NaCl 3%, nƣớc cất, nƣớc 30oC, 50oC, 70oC, 80oC, 100oC vàethanol 300, phẩm nhuộm orcein, dung dịch HCl 1N.- Dao, dao lam, cốc nhỏ, becher 500 ml, kẹp gắp.1. Màng tế bào1.1. Hiện tƣợng thẩm thấuĐối với tế bào sống, màng tế bào sẽ kiểm soát sự di chuyển của nƣớc và cácchất tan. Sự khuếch tán nƣớc qua màng sinh chất của tế bào thực vật đƣợc gọi là sựthẩm thấu. Trong dung dịch không cân bằng áp suất thẩm thấu, nƣớc sẽ di chuyểnqua màng sinh chất từ nơi có áp suất thẩm thấu thấp (môi trƣờng nhƣợc trƣơng) đếnnơi có áp suất thẩm thấu cao hơn (môi trƣờng ƣu trƣơng) cho đến khi áp suất thẩmthấu cân bằng giữa bên trong và bên ngoài tế bào.Tế bào biểu bì lá Lẻ bạn có chứa anthocyan nên có màu tím. Ở điều kiện sốngbình thƣờng, màng sinh chất áp sát vách tế bào nên màu tím nhuộm đầy tế bào.Các bƣớc thực hiện:- Bóc biểu bì dƣới của lá Lẻ bạn (mặt có màu tím). Quan sát tế bào biểu bì trongmột giọt nƣớc ở vật kính 10X. Thay nƣớc bằng dung dịch NaCl 3%. Quan sát dƣớikính hiển vi hiện tƣợng gì sẽ xảy ra trên các tế bào biểu bì?- Thay nƣớc muối bằng nƣớc thƣờng, lặp lại 2 lần. Quan sát dƣới kính hiển vihiện tƣợng gì sẽ xảy ra trên các tế bào biểu bì?Chú ý: Không nên kéo dài thời gian quan sát trong dung dịch NaCl 3% quá 5 phút,vì tế bào có thể bị chết, khi đó không thể thực hiện đƣợc giai đoạn tiếp.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và dung môi hữu cơ lên tính thấm của màng sinh chấtMàng sinh chất là màng lipo-protein, các phức hợp này có thể bị tổn thƣơng donhiệt độ hay hóa chất, làm phá vỡ cấu trúc chuyên biệt và làm cho màng mất khảnăng kiểm soát hoạt động sinh lý bình thƣờng. Khi màng sinh chất bị tổn thƣơng,10nó không còn khả năng giữ các chất tan trong tế bào và do đó các chất này khuếchtán ra ngoài tế bào theo nguyên lý cân bằng áp suất thẩm thấu.Các bƣớc thực hiện:- Cắt củ Dền đỏ thành 6 miếng đều nhau, có kích thƣớc 1 x 5 x 2 cm, rửa dƣớidòng nƣớc chảy cho đến khi nƣớc rửa không còn màu tím. Ngâm các miếng củ Dềntrong nƣớc sạch.- Lấy 6 cốc nhỏ, mỗi cốc đựng 30 ml nƣớc thƣờng, đánh số thứ tự từ 1 đến 6.- Chuẩn bị nƣớc có nhiệt độ thay đổi: 30oC (nhiệt độ phòng thí nghiệm), 50oC,70oC, 80oC, 100oC và ethanol 30o.- Cho 1 miếng Dền vào cốc đựng nƣớc 30oC trong thời gian 2 phút. Sau đó,chuyển miếng Dền vào cốc số 1 và để yên trong 30 phút.- Cho 1 miếng Dền khác vào cốc đựng nƣớc 50oC trong thời gian 2 phút. Sauđó, chuyển miếng Dền vào cốc số 2 và để yên trong 30 phút.- Tiếp tục thực hiện nhƣ trên đối với 3 miếng Dền khác ở các nhiệt độ xử lý lào70 C, 80oC và 100oC. Sau 2 phút xử lý, chuyển các miếng Dền vào các cốc tƣơngứng là cốc 3, cốc 4, cốc 5 và để yên 30 phút.- Cho miếng Dền còn lại vào cốc đựng ethanol 30o trong thời gian 2 phút. Sauđó, chuyển miếng Dền vào cốc số 6 và để yên trong 30 phút.- Sau 30 phút, gắp các miếng Dền ra khỏi cốc, ghi nhận màu sắc của dung dịchtrong 6 cốc.2. Nguyên phânCác bƣớc thực hiện:- Trồng củ Hành ta trong dung dịch Knop ½ 24 giờ. Khi rễ có chiều dài0,5-1 cm thì cắt chóp rễ một đoạn dài khoảng 2 mm, nhuộm với 0,5 ml orcein và 1giọt dung dịch HCl 1N trong 2 giờ. Vớt chóp rễ đặt trên phiến kính dày trong mộtgiọt glycerin, đậy phiến kính mỏng rồi đè bẹp mẫu vật bằng đầu que diêm.- Quan sát ở vật kính 10X và 40X các tế bào mô phân sinh rễ Hành ta ở các giaiđoạn: Gian kỳ (interphase), kỳ đầu (prophase), kỳ giữa (metaphase), kỳ sau(anaphase) và kỳ cuối (telophase).BÁO CÁO THỰC HÀNH1. Hình vẽ hiện tƣợng co nguyên sinh và phản co nguyên sinh.2. Đánh giá kết quả của thí nghiệm trên các miếng Dền đỏ bằng các dấu + để chỉmức độ màu của dung dịch. Giải thích kết quả.3. Hình vẽ các kỳ của phân bào nguyên nhiễm và gian kỳ ở tế bào mô phân sinh rễHành ta. Các hình vẽ phải có chú thích đầy đủ.11PHẦN BSINH HỌC PHÂN TỬBiên soạn: TS. Lê Nguyễn Uyên Chi12Bài 1KỸ THUẬT CƠ BẢNMỤC TIÊU HỌC TẬP1. Biết cách sử dụng một số dụng cụ cơ bản2. Nắm vững một số kỹ thuật cơ bản trong thực hành1. Một số dụng cụ cơ bản1.1. MicropipetPipet tự động có thể điều chỉnh đƣợc thể tích cần lấy. Micropipet có nhiều kíchcỡ: 0,1→1µl, 1→ 10 µl, 1→ 20 µl, 10→ 100 µl, 10→ 200 µl, 100→ 1000 µl …, vàkèm theo tip tƣơng ứng: 0,1→ 10 µl (trắng), 10→ 200 µl (vàng), 100→ 1000 µl(xanh). Khi sử dụng chọn cỡ pipet và tip phù hợp với thể tích cần lấy để tránh sai số.Cấu tạo micropipet thay đổi tùy theo kiểu thiết kế nhƣng nhìn từ bên ngoài đềugồm; cần bơm, bộ phận điều chỉnh thể tích, số chỉ thể tích đƣợc chọn, bộ phận đẩytip (có thể tháo rời), đầu hút (nơi gắn tip).Sử dụng: cầm chắc pipet trong lòng bàn tay sao cho ngàm tựa tì lên đốt đầu tiêncủa ngón trỏ, dùng ngón cái để bấm cần bơmNúm chỉnh thể tíchvà núm đẩy tip. Có 2 cách sử dụng cụ thể:Cần bơmHút một lần: điều chỉnh thể tích cần lấy,Ngàm tựalấy tip, bấm cần bơm (một nấc) rồi giữ luôn,Núm chỉnh thể tíchnhúng đầu tip vào dung dịch cần lấy, thả cầnNúm đẩy tipbơm từ từ để lấy thể tích, đặt đầu tip vào nơiSố chỉcần cho vào, bấm cần bơm để đẩy thể tích cầnlấy ra. Nếu cần thiết thì bấm tiếp nấc thứ hai đểtống hết phần chất lỏng còn dính ở đầu tip.Hút nhiều lần cùng một thể tích: điềuỐng (cần) đẩy tipchỉnh thể tích cần lấy, lấy tip, bấm cần bơm 2nấc rồi giữ luôn, nhúng đầu tip vào dung dịchĐầu hútcần lấy, thả cần bơm từ từ cả 2 nấc để lấy thểTiptích, đặt đầu tip vào nơi cần cho vào, bấm cầnbơm 1 nấc để đẩy thể tích cần lấy ra rồi giữluôn (khi đó trong đầu tip vẫn còn một thể tíchHình 2. Cấu tạo micropipetthừa), nhúng đầu tip vào dung dịch cần lấy, thảcần bơm từ từ 1 nấc để lấy thể tích,...Lƣu ý: Không dùng đầu hút để hút mà phải dùng đầu tip, tip phải đƣợc gắn chặt vàođầu hút nếu không sẽ mắc sai số.131.2. EppendorfỐng đựng nhỏ bằng nhựa có nắp bật hay nắp vặn dung tích 1,5 hay 0,5 ml.Khi sử dụng cầm eppendorf trong lòng bàn tay, dùng ngón cái để bật và đóng nắp;nếu eppendorf có nắp vặn dùng ngón cái và ngón trỏ để vặn nắp.Hình 3. Eppendorf1.3. Máy lắc rung (Vortex)Máy cấu tạo cơ bản gồm 1 rotor có tâm sai với bán kính tâm sai nhỏ, đƣợcsử dụng để lắc trộn các dung dịch hay để phân tán các cắn trong tube.Máy thƣờng có 2 chế độ vận hành:- Liên tục: rotor quay liên tục- Kích hoạt: khi ta đặt tube vào rotor rồi nhấn xuốngrotor mới quay.Khi sử dụng các tube phải đƣợc đậy nắp kỹ để tránhdung dịch bắn ra ngoài và điều chỉnh tốc độ để cólực rung phù hợp với yêu cầu.Hình 4. Máy vortex1.4. Máy ly tâm nhỏ (Microcentrifuge)Dùng để lắng các cặn lơ lửng nhƣ tế bào hay tủa. Các rotor của máy thuộc loại rotorgóc và có thể thay đổi tùy theo kích thƣớc ống sử dụng. Máy ly tâm có 2 chế độ sử dụng:- Pulse (spin): Nhấn và giữ luôn nút pulse, khi muốn dừng lại thả tay ra,áp dụng để dồn các thành phần đang dính trên thành ống xuống.- Ly tâm: để lắng cặn. Chọn tốc độ và thời gian thích hợp rồi nhấn nútly tâm. Lƣu ý: một số tube, eppendorf có thành mỏng (tube PCR) không chịu đƣợctốc độ ly tâm cao nên có thể bị thủng. Sau khi ly tâm tủa sẽ lắng ở đáy ống phíađối diện với trục, do đó nên đặt ống vào rotor sao cho quai nắp hƣớng ra ngoài(xem hình minh họa), khi đó ta có thể dễ dàng hút phần dịch nổi mà khôngảnh hƣởng đến cặn.Lực ly tâm của máy tỷ lệ với tốc độ và độ dài của bán kính rotor.14Hình 5. Máy ly tâm1.5. Máy luân nhiệtMáy tạo ra các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCRtheo chƣơng trình định trƣớc, dùng để thực hiệnphản ứng PCR hay các phản ứng có nhiệt độ thay đổitheo chu kỳ.1.6. Máy điện diLà thiết bị dùng để tách và phân tích các hỗn hợpchất có điện tích bằng dòng điện.Hình 6. Máy luân nhiệt2. Cách cân pha hóa chất cần thiếtCác hóa chất sử dụng thƣờng đƣợc pha thành dung dịch mẹ và tồn trữ, khi dùngmới pha loãng thành nồng độ mong muốn.2.1. Công thức cân - pha- Cân chính xác khoảng:Thể tích dung môi cần lấy (ml) =Hay Thể tích dung môi cần lấy (ml) =- Cân chính xác và pha trong thể tích cố định:Lƣợng cần cân (mg) = thể tích dung môi (ml) x nồng độ muốn pha (mg/ml)- Cân và pha theo nồng độ mol:Cần phân biệt mol là đơn vị chỉ hàm lƣợng: cho biết số phân tử gam (MW) chấtcần có; và M là nồng độ phân tử gam: cho biết có bao nhiêu mol chất trong 1 lítdung dịch. Khi cân pha các chất theo nồng độ mol, ta có thể tham khảo giá trịphân tử gam đƣợc ghi trên nhãn của hóa chất tinh khiết. Ví dụ: dung dịch KCl 5 Mnghĩa là trong 1 lít dung dịch có 5 mol KCl, và trong 100 ml dung dịch trên thìhàm lƣợng KCl là 0,5 mol.15Lƣợng cần cân (g) = thể tích dung dịch (l) x nồng độ muốn pha (M) x MW (g)Hay:Lƣợng cần cân (mg) = thể tích dung dịch (l) x nồng độ muốn pha (mM) x MW (g)Ví dụ: pha 200 ml dung dịch NaOH 1,5 M:Số gam NaOH nguyên chất cần cân = 0,2 x 1,5 x 40 = 12 gVí dụ: pha 250 ml dung dịch NaOH 150 mM:Số gam NaOH nguyên chất cần cân = 0,2 x 150 x 40 = 1500 mg = 1,5 g2.2. Công thức điều chỉnh nồng độ pha loãngThể tích dung dịch mẹ cần lấy (ml) =x số ml muốn phaHay:Thể tích dung dịch mẹ cần lấy (ml) =xSau đó thêm dung môi vừa đủ thể tích cần phaVí dụ: pha 100 ml TAE 0,5x từ TAE 10XSố ml TAE 10X cần lấy = (0,5/10) x 100 = 5 mlVí dụ: pha 150 ml dung dịch EtBr 0,5 µg / ml từ dung dịch mẹ 0,5 mg/ml để nhuộm gel:Số ml dung dịch mẹ cần lấy = (0,5/500) x 150 = 0,15 ml = 150 µLVí dụ: pha 250 ml Tris-Cl 50 mM từ Tris-Cl 2M.Số ml Tris-Cl 2M cần lấy = (50/2) x 0,25 = 6,25 ml.16Bài 2AN TOÀN THÍ NGHIỆM – CÁC PHƢƠNG PHÁPTHANH TRÙNGMỤC TIÊU HỌC TẬP1. Hiểu biết về các quy tắc đảm bảo an toàn trong phòng thí nghiệm và khi làm việc2. Nắm vững và vận dụng các phương pháp khử trùng khi làm thí nghiệm sinh học1. An toàn phòng thí nghiệm cơ bản1.1. Bảo hộ cá nhân- Phải mặc áo choàng, áo khoác hoặc đồng phục phòng thí nghiệm (PTN) trongsuốt thời gian làm việc trong PTN.- Phải đeo găng tay trong tất cả các quá trình tiếp xúc trực tiếp hoặc tình cờ vớicác chất có khả năng gây nhiễm trùng, gây bệnh, các hóa chất độc hại. Sau khisử dụng, tháo bỏ găng tay đúng cách và phải rửa tay.- Ngƣời làm việc trong PTN phải rửa tay sau khi thao tác với các vật liệu cókhả năng gây nhiễm trùng, gây bệnh, các hóa chất độc hại và trƣớc khi ra khỏikhu vực làm việc của PTN.- Luôn đeo kính bảo hộ, mặt nạ hoặc các thiết bị bảo hộ khác để không bị cácdung dịch nhiễm trùng bắn vào mắt và mặt cũng nhƣ tránh đƣợc các vật có sức éplớn và tia cực tím nhân tạo.- Cấm ăn uống, hút thuốc trong khu vực làm việc của PTN.1.2. Khu vực làm việc- PTN phải ngăn nắp, sạch sẽ và chỉ để những gì cần thiết cho công việc.- Vào cuối buổi thực hành, mặt bàn ghế phải đƣợc làm sạch và khử nhiễmsau khi làm đổ các vật liệu nguy hiểm.- Tất cả các vật liệu, vật phẩm và môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật phải đƣợckhử trùng trƣớc khi thải bỏ.1.3. Ngƣời làm việcNhằm rèn luyện kỹ năng PTN và nâng cao tính chủ động trong nghiên cứu,sinh viên khi làm thực tập cần lƣu ý một số điểm sau:- Chủ động trong công việc: xem và sắp xếp các thí nghiệm hợp lý để rút ngắnthời gian và tăng hiệu quả công việc.- Nghiêm túc và cẩn thận khi làm thí nghiệm.- Trật tự trong PTN: tuân thủ các quy định làm việc, quy định về an toàn tạiPTN. Giữ vệ sinh PTN.- Bảo quản các dụng cụ, thiết bị của phòng: sinh viên cần giữ gìn các dụng cụđƣợc nhận và sử dụng cẩn thận các thiết bị của phòng. Những hƣ hỏng mất mát phảichịu bồi thƣờng tƣơng xứng.17- Khi ra về: phải kiểm tra tắt điện, nƣớc, máy móc không sử dụng.2. Xử lý chất thải2.1. Chất thải là tất cả các vật liệu cần thải bỏTrong PTN, việc khử trùng chất thải và thải bỏ chúng sau này có liên quanchặt chẽ với nhau. Trong khi sử dụng hằng ngày, chỉ một số ít vật liệu nhiễm trùngthật sự cần thải bỏ hoặc tiêu hủy. Hầu hết các vật liệu thủy tinh, dụng cụ và áo quầnbảo hộ sẽ đƣợc sử dụng lại hoặc tái sinh. Nguyên tắc hàng đầu là tất cả các vật liệunhiễm trùng phải đƣợc khử trùng, thanh trùng hoặc thiêu hủy trong PTN.2.2. Khử nhiễmHấp tiệt trùng là phƣơng pháp đƣợc ƣu tiên cho tất cả các quá trình khử nhiễm.Các vật liệu để khử nhiễm hoặc thải bỏ cần đƣợc đặt trong hộp nhƣ túi nhựatổng hợp đƣợc mã hóa màu theo nội dung công việc là thanh trùng hay thiêu hủy.3. Phƣơng pháp khử trùng3.1. Định nghĩaMột vật phẩm đƣợc xem là vô trùng khi không còn mang một mầm sinh vật nào nữa.Thông thƣờng sự khử trùng đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp vật lý hay hóa học.3.2. Khử trùng bằng phƣơng pháp vật lýCó thể dùng: nhiệt, lọc, bức xạ, âm ba và siêu âm.A. Khử trùng bằng nhiệtĐối với tác nhân nhiệt, các tế bào dinh dƣỡng của vi sinh vật có thể bị giết dễ dàng.1) Nhiệt khô (lò Pasteur hay tủ sấy)Khử trùng bằng nhiệt khô là do sự làm khô vi trùng và oxy hóa các cấu tử của chúng.Nhiệt khô dùng để khử trùng các dụng cụ bằng kim loại hay thủy tinh: ốngnghiệm, hộp lồng, ống hút, các bột khô.Sự diệt trùng bằng nhiệt khô đƣợc thực hiện trong tủ sấy, đó là một phòng kín bằngkim loại, đƣợc đốt nóng bằng chất khí hay điện trở. Nhiệt độ trong lò có thể lên đến180oC và khí nóng phải đƣợc quạt đều trong lò để tránh sự sai biệt về nhiệt độ.a) Khi dùng tủ sấy:- Các dụng cụ phải đƣợc làm khô và gói giấy để đảm bảo tính vô trùngsau khi sấy.- Khi cho dụng cụ vào lò sấy xong, đậy nắp lại.- Điều chỉnh nhiệt độ lên từ từ 175-180oC trong 30 phút (hoặc 160oC trong2 giờ).- Tắt lò, để nguội dƣới 80oC mới đƣợc mở cửa tủ ra. Nếu không, có thể làmnứt vỡ các dụng cụ, làm ảnh hƣởng đến tính vô trùng của dụng cụ.- Lấy dụng cụ ra khỏi lò sấy: phần giấy bao hoặc bông đậy phải có màu hơi vàng.18- Vì nhiệt độ cao, phƣơng pháp này chỉ áp dụng cho các vật phẩm chịuđƣợc nhiệt độ trên 180oC.b) Hơ trên lửa: que cấy vi sinh, kéo, kẹp,v.v… có thể diệt trùng bằng kiểu này.Nên nhúng dụng cụ vào alcool rồi đốt làm nhiều lần.2) Nhiệt ẩmƢu điểm: làm nóng nhanh, hơi nóng thấm sâu vào trong vật phẩm và chohơi ẩm nhiều. Do đó vi sinh vật bị giết chết vì protein đông kết lại.a) Hấp PasteurÁp dụng phƣơng pháp này phải chọn nhiệt độ diệt trùng thích hợp vàthời gian cần thiết (bảng)Vi sinh vậtNấm menNấm mốcVi sinh vậtkhông có bào tửVi sinh vật cóbào tửSiêu vi trùngNhiệt độ diệt trùngTế bào dinh dƣỡngBào tửooNhiệt độ ( C)Thời gian (phút)Nhiệt độ ( C)Thời gian (phút)50 – 705 – 1070 – 805 – 10605 – 10705 – 1060 – 705 – 1060 – 705 – 1060 – 705 – 1012012b) Nƣớc sôiDiệt tế bào dinh dƣỡng, bào tử và nấm vẫn còn. Thời gian là 5 phút.c) Chƣng cách thủy nhiều lầnĐối với những môi trƣờng chứa serum hay chất dễ hƣ ở nhiệt độ cao, phảiáp dụng phƣơng pháp đun cách thủy với nhiệt độ 70 – 80oC, mỗi lần đun 1 giờ vàliên tiếp trong 3 ngày liền.d) Hơi nƣớc lƣu thôngDùng cho dung dịch hóa học không chịu đƣợc nhiệt độ trên 100oC. Có thểdùng autoclave nhƣng luôn mở khóa thoát hơi để nhiệt độ không quá 100oC.Đun 30 phút - 1 giờ.Cũng nhƣ phƣơng pháp chƣng cách thủy nhiều lần nhƣng vật phẩmdiệt trùng bằng hơi nƣớc lƣu thông phải đƣợc kiểm soát sự vô trùng bằng cách để ở37oC trong 24 giờ.e) Hơi nƣớc bão hòa ở áp suất cao (autoclave)Nguyên tắc: Làm gia tăng nhiệt các vật bằng hơi nƣớc bão hòa dƣới mộtáp suất lớn hơn áp suất bình thƣờng của khí quyển. Khi áp suất hơi nƣớc tăng lênthì nhiệt độ cũng tăng theo.19Nhiệt độ hơi nƣớc bão hòa ở các áp suất khác nhau:Nhiệt độ (oC)100112121128134Áp suất (atm)00,511,52Thời gian khử trùng phụ thuộc thể tích vật muốn khử trùng và dụng cụ đểchứa đựng vật đó. Thông thƣờng sử dụng 121oC trong 20 phút.Với phƣơng pháp autoclave có thể tiêu diệt cả tế bào dinh dƣỡng lẫn bào tử củavi sinh vật.Sơ đồ nồi hấp áp lực autoclave:Cách sử dụng autoclave:- Cho nƣớc cất một lần vào lò đến mức quy định.- Xếp dụng cụ, vật liệu cần khử trùng vào nồi trong các giá đựng.Không nên xếp các dụng cụ sát nhau quá để hơi nƣớc thông qua dễ dàng.- Đậy nắp nồi hấp thật kín.- Mở van thoát khí.- Đun nồi cần phải loại hết không khí có sẵn trong nồi hấp ra, bởi vì ở cùngmột áp suất thì nhiệt độ của hơi nƣớc đơn thuần sẽ cao hơn nhiệt độ củahỗn hợp giữa hơi nƣớc và không khí. Do đó tác dụng khử trùng củahơi nƣớc đơn thuần lên các vi sinh vật sẽ mạch hơn rất nhiều.- Khi hơi nƣớc thoát ra thành luồng liên tục (không khí trong nồi hấp đã bịloại hết), đóng van xả hơi lại. Tiếp tục đun cho áp suất tăng dần. Khi đạtđến áp suất yêu cầu, ta giữ áp suất ở mức đó trong thời gian cần thiết.Các nồi hấp hiện đại có chế độ điều chỉnh tự động. Khi áp suất đạt 1 atm,nhiệt độ nồi hấp khoảng 120 – 121oC.- Khi hết thời gian khử trùng, autoclave báo hiệu và tự động giảm dầnnhiệt độ. Đợi cho áp suất trong nồi hấp cân bằng với áp suất khí quyển(kim áp kế về 0), nhiệt độ nồi hấp giảm xuống dƣới 80oC, mở van xả hơi.Mở nắp nồi hấp. Tắt điện.B. Khử trùng bằng sự lọcDùng cho vật phẩm lỏng, có độ nhầy yếu, không chịu đƣợc nhiệt độ caotrên 60o. Cho vật phẩm đi qua một màng lọc xốp mà những lỗ có đƣờng kínhnhỏ hơn đƣờng kính của vi sinh vật nhỏ nhất. Sinh vật sẽ bị giữ lại trên màng lọc,còn dung dịch đi qua sẽ vô trùng.Màng xốp có thể bằng sứ, amiante, cellulose, hỗn hợp cellulose và muối estercủa cellulose. Mỗi lọc có một dung tích nhất định, có nghĩa là sự lọc phải dùngáp suất tƣơng ứng.20C. Khử trùng bằng bức xạ- Tia tử ngoại: thƣờng dùng nhất là tia UV, sử dụng để khử trùng phòngthí nghiệm, phòng vô trùng, bệnh viện. Tia UV chỉ diệt trùng bề mặt, khôngthấm sâu vào bên trong phẩm vật.- Tia âm cực: khử trùng các dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Tia âm cựccó thể diệt trùng các vật đã cho vào bao gói kín.D. Âm ba và sóng siêu âmVới cƣờng độ lớn và thời gian vừa đủ sẽ làm vỡ màng tế bào và nội chất vi sinhvật sẽ chảy ra. Dùng âm ba và siêu âm với mục đích lấy các chất trong tế bào(phá vỡ tế bào) hơn là diệt trùng.3.3. Khử trùng bằng phƣơng pháp hóa họcMục tiêu dùng chất hóa học để ngăn ngừa nhiễm trùng. Sự phân loại và sử dụng cácchất sát trùng dựa vào các điểm sau:- Tính chất của vật cần sát trùng.- Loại vi sinh vật cần khử- Cần ấn định rõ các điều kiện tổng quát nhƣ nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ.Các loại chất sát trùng: phenol, rƣợu, iode, chlor và hợp chất có chlor, thuốc tẩy,v.v…21