Kết Quả Khảo Sát Nồng độ Primer Thích Hợp Kết Quả Khảo ... - 123doc

1. Trang chủ >
2. Khoa Học Tự Nhiên >
3. Sinh học >

Kết quả khảo sát nồng độ primer thích hợp Kết quả khảo sát số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR.

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.16 MB, 66 trang )

Trong 5 chu trình, chu trình 5 cho sự khuếch đại đặc hiệu cao nhất, vạch sản phẩm phụ mờ, còn vạch sản phẩm chính rất sáng và rõ nét. Chu trình này được xâydựng dựa trên phương pháp Touchdow PCR của Don và ctv 1991 trích dẫn bởi McPherson M.J. và Moller S.G., 2000. Phương pháp này rất hữu hiệu cho các phảnứng PCR có lượng bản sao ban đầu của mẫu thấp. Trong đó, 10 chu kỳ đầu được thiết lập với nhiệt độ bắt cặp cao 58oC, giúp tăng sự chuyên biệt của phản ứng, nhân bản chính xác đoạn DNA mong muốn. Khi lượng bản sao mục tiêu đã tăng lênđến mức cần thiết, các chu kỳ sau được thiết lập với một điều kiện thuận lợi hơn bắt cặp ở 54oC, giúp phản ứng khuếch đại xảy ra dễ dàng hơn. Như vậy, kết quả trên cho thấy chu trình 5 là chu trình thích hợp nhất chophản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1 với các hóa chất mà chúng tôi sử dụng.

4.2.3 Kết quả khảo sát nồng độ primer thích hợp

Sau khi đã xác định được yếu tố chính của phản ứng RT-PCR là quy trình nhiệt, chúng tôi tiến hành xác định các yếu tố khác để tối ưu hóa phản ứng RT-PCR.Tỷ lệ primer – RNA mẫu ảnh hưởng rất lớn đối với phản ứng RT-PCR, vì vậy, cần phải xác định tỷ lệ primer – RNA thích hợp để thu được kết quả tối ưu. Đốivới quy trình đang thiết lập, việc xác định nồng độ RNA sau khi ly trích rất khó thu được kết quả chính xác nên chúng tôi chỉ thay đổi nồng độ primer để làm thay đổi tỷlệ primer – RNA. Có 3 nồng độ primer được chọn khảo sát là 1 mM, 0,8 mM và 0,6 mM. Các sản phẩm đều được thực hiện với RNA trên cùng một mẫu bệnh và chokết quả điện di sản phẩm RT-PCR như sau:Hình 4.3: Kết quả khảo sát nồng độ primer thích hợpChú thích: L: Ladder - : Đối chứng âmGiếng 1: sản phẩm RT-PCR với nồng độ primer 1 mM Giếng 2: sản phẩm RT-PCR với nồng độ primer 0,8 mMGiếng 3: sản phẩm RT-PCR với nồng độ primer 0,6 mM Kết quả điện di trên cho thấy, với 2 nồng độ primer 1 mM và 0,8 mM phảnứng RT-PCR đều cho vạch sản phẩm chính sáng và rõ nét, nhưng nồng độ 0,8 mM cho lượng sản phẩm phụ ít hơn. Còn ở nồng độ 0,6 mM, lượng primer quá ít nênphản ứng cho hiệu quả khuếch đại thấp. Như vậy, nồng độ primer 0,8 mM chính là nồng độ thích hợp nhất.

4.2.4 Kết quả khảo sát số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR.

Vì số lượng bản sao RNA của virus trong RNA thực vật rất thấp nên số chu kỳ cho một phản ứng RT-PCR thông thường là 40 – 45 chu kỳ. Do đó, chúng tôi đãtiến hành khảo sát trên 5 mức 41, 42, 43, 44 và 45 chu kỳ để tìm số chu kỳ thích hợp nhất. Kết quả của thí nghiệm này cho thấy như sau:500 bpL-1 2 3589 bpHình 4.4: Kết quả khảo sát số chu kỳ RT-PCR thích hợpChú thích: L: Ladder Giếng 1: sản phẩm RT-PCR với 41 chu kỳGiếng 2: sản phẩm RT-PCR với 42 chu kỳ Giếng 3: sản phẩm RT-PCR với 43 chu kỳGiếng 4: sản phẩm RT-PCR với 44 chu kỳ Giếng 5: sản phẩm RT-PCR với 45 chu kỳKết quả điện di ở hình 4.4 cho thấy tất cả 5 chu kỳ được khảo sát đều cho kết quả đặc hiệu, thu được vạch sản phẩm mong muốn 589 bp. Các phản ứng có số chukỳ ít cho sản phẩm chính hơi mờ. Còn ở các phản ứng có số chu kỳ cao, tuy vạch sản phẩm chính rõ hơn nhưng lượng sản phẩm phụ cũng được khuếch đại lên theo.Như vậy, tính đặc hiệu của các phản ứng khuếch đại không tăng lên. Tuy nhiên, quy trình RT-PCR trên được xây dựng với mục đích phát hiện PMWaV-1 trên nhữngmẫu chồi với lượng bản sao RNA virus ban đầu rất thấp nên chúng tôi quyết định chấp nhận lượng sản phẩm phụ cao để tăng độ nhạy cho phản ứng. Vì vậy, mức 45chu kỳ được chọn là mức thích hợp nhất cho phản ứng RT-PCR.L 1 2 3 4 5589 bp 500 bpTrong suốt q trình xây dựng quy trình RT-PCR trên, ngồi vạch sản phẩm chính 589 bp, còn xuất hiện thêm 1 vệt sản phẩm phụ kích thước khoảng 100 bp.Bên cạnh đó, ở các phản ứng đối chứng âm giếng -, hình 4.3 khơng thấy có sản phẩm khuếch đại, chứng tỏ trong q trình thao tác khơng xảy ra sự ngoại nhiễm.Như vậy, chúng tôi tạm lý giải điều này là do các nguyên nhân sau: - Primer dư tạo thành các dimer.- Hỗn hợp phản ứng RT-PCR thừa các sản phẩm Mg2+, dNTP, RNA mẫu. - Trên RNA của cây dứa thu được chung với của PMWaV-1 trong q trình lytrích RNA tổng số có những đoạn trình tự cũng gần như bổ sung với cặp primer 225, 226 nên trong phản ứng, ngồi đoạn HSP 70 của PMWaV-1 thìđoạn trình tự này cũng được nhân bản. Tuy nhiên, trên GenBank khơng có dữ liệu về trình tự các đoạn RNA của cây dứa nên chúng tôi không thể kiểm tralại giả thuyết này. Việc khử các vạch sản phẩm không chuyên biệt trên đòi hỏi phải mất khánhiều thời gian và hóa chất nên trong khn khổ hạn hẹp của đề tài, chúng tôi chưa thực hiện được việc này. Tuy nhiên, lượng sản phẩm phụ đã được làm giảm đi nhiều,còn sản phẩm chính đã đạt được mức khuếch đại cần thiết để có thể đánh giá chính xác sự hiện diện của PMWaV-1. Như vậy, có thể kết luận quy trình RT-PCR đượcxây dựng hồn tồn đủ độ tin cậy trong việc phát hiện PMWaV-1.Hình 4.5: Sơ đồ phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1

4.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng phương pháp giải trình tự

Xem Thêm

Tài liệu liên quan

• xây dựng quy trình phát hiện virus PMWaV-1
  • 66
  • 2,612
  • 18

Tải bản đầy đủ (.pdf) (66 trang)

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(1.16 MB) - xây dựng quy trình phát hiện virus PMWaV-1-66 (trang) Tải bản đầy đủ ngay ×